引用本文： 施夢, 黃杰春, 孫笑天, 汪昉睿, 儲祥麟, 姜容容, 王宜青, 龐烈文. 凝血因子Xα 抑制劑對內毒素誘導小鼠急性肺損傷的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(4): 369-376. doi: 10.7507/1671-6205.201810048 復制
急性肺損傷是一種常見的呼吸衰竭疾病，特點是肺毛細血管滲出增加、中性粒細胞浸潤和肺氣血屏障破壞[1]，其病理變化還包括出血及微血栓形成[2]。在感染性疾病引起的急性肺損傷，細菌性膿毒血癥是死亡的主要因素；細菌產生的毒素，如脂多糖和內毒素會導致炎癥反應、細胞骨架重構和內皮屏障破壞[3]。急性肺損傷的病理改變包括炎癥反應和肺組織內促凝血及抗纖溶功能增強[4]，特別是肺組織內凝血功能激活相對于抗凝和纖溶來說在急性肺損傷的病理生理改變中更加重要[2]。肺組織中的凝血功能增強，會影響組織中炎癥反應及損傷修復[5]。研究表明腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）和 IL-6，可以激活外源性凝血途徑；同時凝血因子 Xα（coagulation factor Xα，FXα）、α-凝血酶和纖維蛋白的增加也促使 IL-6 和 IL-8 的合成[6]。因此，凝血和炎癥反應的相互促進，會導致急性肺損傷程度加重[7]。
研究表明，除了促凝血功能外，FXα 在其他生理過程中也起重要作用，涉及炎癥調節、血管重構和組織纖維化[8-9]。急性肺損傷小鼠的肺泡灌洗液中凝血酶和 FXα 升高[10]。FXα 可以增加炎癥因子的 mRNA 表達[11-12]。凝血因子的非凝血功能主要通過蛋白酶激活受體（protease-activated receptors，PARs）調節，增加組織炎癥反應及抑制組織修復[12-14]。PARs 是一種 G 蛋白結合受體家族，調節凝血系統蛋白酶的功能，例如凝血酶、胰蛋白酶和金屬蛋白酶[15]。生理條件下，PAR-2 主要表達在血管內皮細胞上，PAR-2 激活可以促進內皮細胞轉變成促炎細胞，使血管通透性增加，促炎癥因子分泌及表達增加[16-18]。
利伐沙班是一種口服抗凝藥，可以抑制 FXα 和減少體內炎癥介質分泌[12]。但是，利伐沙班是否對內毒素誘導的急性肺損傷有影響及相關作用機制研究沒有相關報道。本研究旨在小鼠體內證明利伐沙班通過抑制 PAR-2-NF-κB 信號通路改善內毒素引起的急性肺損傷。
1 材料與方法
1.1 藥品及試劑
FXα 購自 Hematologic Technologies 公司，內毒素和伊文思藍購自 Sigma 公司，利伐沙班購自拜耳藥業，上海斯萊克動物飼料公司制備含有利伐沙班 0.4 mg/g 和 0.2 mg/g 嚙齒類動物飼料。小鼠的凝血功能用法國 Stago 公司的半自動血凝儀檢測。各種單克隆抗體，如 P65、p-P65、β-肌動蛋白（β-actin）購自 Cell Signaling Technology 公司。PAR-2 抗體購自 Abcam 公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抗體購自 R&D 公司；鼠 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自 R&D 公司。蛋白濃度測量用 BCA 試劑盒。所有試劑及藥品均為藥物級別。
1.2 動物實驗及標本取材
雄性 C57BL/6 小鼠（6～7 周，平均體重 20 g）購自斯萊克實驗動物中心［動物生產許可證號：scxk（滬 2017-0005）］。將 C57BL/6 小鼠隨機分為對照組（ PBS 組）、標準飼料組（N-LPS 組）、 0.2 mg/g 利伐沙班組（L-LPS 組）和 0.4 mg/g 利伐沙班組（H-LPS 組）。PBS 組給予標準飼料喂養；N-LPS 組、L-LPS 組和 H-LPS 組造模前分別給予標準飼料、含有 0.2 mg/g 或 0.4 mg/g 利伐沙班的飼料共 10 d[14]。飼料喂養前后分別稱量各組小鼠體重，評估不同飼料對小鼠營養狀態的影響。喂養 10 d 后，N-LPS 組、L-LPS 組和 H-LPS 組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，經氣管按體重滴注內毒素（濃度為 2 mg/mL，2.5 μL/g）進行造模，PBS 組給予相同容積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。造模 48 h 后，處死小鼠取血漿、支氣管肺泡灌洗液及肺組織進行相關實驗結果分析。小鼠急性肺損傷建模流程見圖 1。每組 6 只小鼠。
圖1
內毒素氣管內滴注建立小鼠急性肺損傷模型流程圖
內毒素氣管內滴注建立小鼠急性肺損傷模型，造模前給予標準飼料或給予含有不同劑量利伐沙班藥物的飼料
從心臟取出全血后，根據全血體積與 3.4% 的枸櫞酸鈉相混合，用兩次離心法制備乏血小板血漿，然后分裝血漿保存在–80 ℃冰箱中。行左肺肺泡灌洗，回收支氣管肺泡灌洗液分別測炎癥細胞數量、蛋白濃度、伊文思藍濃度和細胞因子含量。一部分右肺組織用福爾馬林固定和石蠟包埋。部分肺組織行蛋白印跡法（Western blot）檢測分析。所有實驗經過復旦大學動物實驗及關懷委員會同意。
1.3 檢測指標
1.3.1 凝血功能評價
測定鼠尾出血時間。乏血小板血漿用半自動血凝儀測定活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和凝血酶時間（thrombin time，TT）。
1.3.2 利伐沙班血藥濃度的測定
用液相色譜–質譜（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）法測定[19]。用利奈唑胺作為內參照，血清中二甲基亞砜為 0.05%，不影響小鼠凝血功能[20]。
1.3.3 肺濕干重比
取右肺下葉放在事先稱重的鋁箔紙上，稱重減去鋁箔紙重量，表示濕重；將其放入 60 ℃ 溫箱中烘烤 5 d，再次稱重獲得此肺組織干重（即兩次測量干重質量固定后被確定為肺組織干重）。所得濕重和干重比值為濕干重比[21]。
1.3.4 肺氣血屏障的通透性評價
肺組織通透性用肺泡灌洗液中的蛋白濃度、伊文思藍濃度和肺組織內伊文思藍含量表示[22]。用 BCA 方法測定肺泡灌洗液中的蛋白濃度。血清白蛋白結合的伊文思藍復合物可以通過肺泡氣血屏障到達損傷的肺組織部位[23]。肺泡灌洗液和肺組織萃取液經 620 nm 波長光測定溶液中的伊文思藍濃度，計算肺泡灌洗液（μg/mL）及單位質量干肺組織中的伊文思藍含量（μg/g）。
1.3.5 肺泡灌洗液中的炎癥細胞計數
肺泡灌洗液中的細胞沉淀，用小動物血細胞分析儀測定炎癥細胞數量。取 10 μL 細胞重懸液滴在載玻片上，用吉姆薩–瑞特染液進行懸浮細胞染色，顯微鏡下觀察及計數有核細胞，確定分類及數量。
1.3.6 肺組織的形態學評價
開胸取右肺部分肺葉，用 10% 的福爾馬林固定，石蠟包埋，蘇木精–伊紅染色，光鏡下評價肺損傷程度，計算肺組織病理損傷評分（total histology score，THS）。
1.3.7 放射學分析
小動物 CT 目前已成為一種有效的實驗室檢查方法。為了評價 LPS 對肺損傷的影響，急性肺損傷小鼠制備 48 h 后用西門子的小動物 CT 掃描小鼠整個胸腔，用 Feldkamp 算法重構圖像，用 DICOM 軟件讀片及獲得有效圖像。
1.3.8 免疫組織化學分析
石蠟切片進行脫蠟，用梯度乙醇脫水；室溫用 10% 小羊血清封閉 30 min，然后相應一抗 4 ℃ 孵育過夜；37 ℃ 二抗孵育 20 min；顯微鏡觀察并記錄。
1.3.9 ELISA 檢測肺泡灌洗液中炎癥因子
采用小鼠的左肺肺泡灌洗液，回收率為 80%，用鼠相應 ELISA 試劑盒，測量炎癥細胞因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的濃度。
1.3.10 Western blot 檢測
采用深低溫凍存的肺組織，勻漿，取上清液；檢測肺組織中的 MPO、PAR-2、P65、p-P65 和β-actin 含量。用 1% PMSF 的組織裂解液裂解組織，用 SDS-PAGE 膠分離目標蛋白，一抗 4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育 2 h，顯影和拍照。用 ImageJ 軟件檢測目標蛋白和內參照蛋白的灰度比值。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 軟件進行數據分析。呈正態分布的計量數據用均數±標準差（
±s）表示，用 Student’s 非配對 t 檢驗和 ANOVA 多參數檢驗方法進行統計學分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組小鼠的基本情況
本實驗首先觀察用不同含量利伐沙班飼料喂養后的小鼠，三組間體重無明顯差異（圖 2a）。用 LC-MS 方法檢測利伐沙班的血藥濃度，給予0.2 mg/g 和 0.4 mg/g 利伐沙班飼料的小鼠利伐沙班血藥濃度相應上升（圖 2b）。不同飼料喂養的各組小鼠，鼠尾出血時間差異無統計學意義（P=0.03）（圖 2c）。檢測各組小鼠乏血小板血漿中凝血功能的 PT、APTT 和 TT 值（圖 2d~f），各組 TT、APTT 值沒有顯著差異（P>0.05）；但是，用含 0.4 mg/g 利伐沙班飼料喂養的小鼠與常規飼料小鼠相比，其凝血功能 PT 值延長；低劑量的利伐沙班飼料對小鼠的 PT 值沒有明顯影響。
圖2
不同飼料喂養的小鼠基本情況
a. 小鼠的體重；b. 利伐沙班的血藥濃度；c. 鼠尾出血時間；d. PT；e. APTT；f. TT。與 N-LPS 組比較，*
2.2 利伐沙班減輕內毒素引起的急性肺損傷
內毒素刺激 48 h 后，各組小鼠急性肺損傷病理改變明顯，炎癥細胞浸潤，肺間質增厚，組織水腫明顯（圖 3a）。用 THS 方法半定量評價肺損傷嚴重程度，發現高劑量利伐沙班飼料喂養的小鼠，與正常飼料喂養的小鼠相比，內毒素氣管內滴注后急性肺損傷程度明顯減輕；但是，內毒素在低劑量利伐沙班飼料喂養小鼠并沒有表現出相應作用（圖 3b）。用小動物 CT 掃描檢查各組小鼠急性肺組織損傷程度，與對照組小鼠比較，急性肺損傷組表現出雙側肺野廣泛滲出，高劑量利伐沙班飼料喂養可以減輕急性肺損傷滲出（圖 3c）。
圖3
利伐沙班可以減輕急性肺損傷程度
a. 小鼠肺組織病理像（蘇木精–伊紅染色×100）；b. 小鼠肺組織的 THS 評分；c. 小動物 CT 影像學檢測各組小鼠急性肺損傷程度。與 PBS 組比較，*
2.3 利伐沙班減輕肺損傷氣血屏障的通透性
對照組小鼠肺濕干重比為 4.30±0.11，內毒素刺激后，急性肺損傷小鼠肺的濕干重比為 5.29±0.25。用標準飼料和含有利伐沙班飼料喂養的各組急性肺損傷小鼠肺濕干重比差異無統計學意義（圖 4a）。與對照組相比，內毒素誘導急性肺損傷后肺泡灌洗液的蛋白濃度明顯升高（P<0.05）。用含 0.2 mg/g 和 0.4 mg/g 利伐沙班飼料喂養的小鼠，急性肺損傷后肺泡灌洗液蛋白濃度降低（P<0.05，圖 4b）。急性肺損傷造模 48 h 后，與對照組相比，內毒素刺激后肺泡灌洗液和肺組織中伊文思藍含量明顯增高（P<0.05）；與 N-LPS 組小鼠相比，L-LPS 及 H-LPS 組小鼠肺泡灌洗液及肺組織中伊文思藍濃度明顯降低（P<0.05）（圖 4c、d）。以上結果提示，利伐沙班可以通過改善肺氣血屏障通透性減輕急性肺損傷的嚴重程度。
圖4
利伐沙班對急性肺損傷氣血屏障通透性的影響
a. 肺濕干重比；b. 肺泡灌洗液中的蛋白濃度；c. 肺泡灌洗液中伊文思藍濃度；d. 小鼠肺組織中伊文思藍濃度。與 PBS 組比較，*
2.4 利伐沙班抑制急性肺損傷的炎癥反應
急性肺損傷后肺泡灌洗液內炎癥細胞數量增加（圖 5a）。急性肺損傷組肺泡灌洗液內炎癥細胞數量是對照組的 8 倍，H-LPS 與 N-LPS 組相比，炎癥細胞減少 45%（P<0.05，圖 5b）。用 Western blot 檢測肺組織中 MPO 活性（圖 5c、d），用免疫組織化學方法觀察組織切片中 MPO 陽性細胞的數量，急性肺損傷后 MPO 陽性的棕色細胞數量明顯增加（圖 5e）。高劑量利伐沙班飼料喂養小鼠后，急性肺損傷的 MPO 水平明顯下降（P<0.05）。用 ELISA 方法檢測炎癥細胞因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的水平，發現對照組肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量很低；內毒素氣管內滴注后，肺泡灌洗液中炎癥因子表達增加明顯（P<0.01）；利伐沙班預處理后這些炎癥因子表達減低（P<0.05）。結果見圖5 f~h。
圖5
利伐沙班抑制急性肺損傷的炎癥反應
a. 肺泡灌洗液中炎癥細胞病理像（吉姆薩–瑞特×100）；b. 肺泡灌洗液中細胞數量；c、d. 肺組織中 MPO 含量 Western blot 檢測像和定量分析；e. 肺組織中 MPO 表達病理像（免疫組織化學×100）；f. 肺泡灌洗液中 IL-1β 含量；g. 肺泡灌洗液中 TNF-α 含量；h. 肺泡灌洗液中 IL-6 含量。與 PBS 組比較，*
2.5 利伐沙班通過 PAR-2-NF-κB 信號通路抑制炎癥反應
與 PBS 組相比，內毒素處理組小鼠肺組織中 PAR-2 表達增加，PAR-2 陽性的棕色細胞明顯增多（圖 6a）；與 N-LPS 組相比，利伐沙班可以降低肺組織中 PAR-2 和 p-P65 的蛋白表達（圖 6b~d）。這些結果表明 PAR-2 和 FXa 與急性肺損傷的病理改變相關。利伐沙班可以通過抑制 PAR-2-NF-κB 信號通路減輕內毒素誘導的肺損傷。
圖6
利伐沙班抑制炎癥信號通路 PAR-2-NF-κB 的激活
a. 肺組織 PAR-2 表達病理像（免疫組織化學染色×100 及×400）；b. 肺組織 PAR-2、P65 和 p-P65 蛋白表達 Western blot 檢測像（β-actin作為內參照）；c. 肺組織中 PAR-2 含量；d. 肺組織中 p-P65 含量。與 PBS 組比較，*
3 討論
本研究證實利伐沙班有抗凝作用，影響外源性凝血途徑，并可以抑制炎癥反應，改善內毒素引起的小鼠急性肺損傷。用含有 0.4 mg/g 利伐沙班飼料喂養小鼠，凝血功能 PT 時間明顯延長。抑制 FXα 可以減輕急性肺損傷程度，降低肺組織中炎癥因子含量，如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6。利伐沙班抑制急性肺損傷組織中 PAR-2 表達，從而通過對核轉錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）炎癥信號通路抑制改善急性肺損傷嚴重程度。
凝血級聯反應的主要功能是促進止血和減少血液丟失，在炎癥反應和組織損傷修復過程中也起重要作用。凝血蛋白酶如 FXα 和凝血酶，除了有促凝血功能以外，也可以促進多種炎癥反應[24]。急性肺損傷與肺組織內局部的炎癥反應和凝血功能異常都相關。炎癥反應和凝血功能相互促進可以進一步加重急性肺損傷，如果抑制一方面的異常可以打破這種相互促進的狀態，從而減輕急性肺損傷的病理改變。本研究發現，應用 FXα 抑制劑不僅可以抑制小鼠的外源性凝血功能，也可以抑制急性肺損傷的局部炎癥反應，因此推測它通過抑制促凝血狀態來抑制炎癥反應。既往研究已發現，內毒素氣管內滴注引起的急性肺損傷小鼠凝血功能沒有明顯變化，即急性肺損傷小鼠的 PT、APTT 和 TT 值與正常小鼠相比沒有明顯變化[5]。用含有高劑量利伐沙班飼料喂養小鼠，其體內血藥濃度可達到 141 ng/mL，遠高于治療作用人體內的血藥濃度，小鼠凝血功能中的 PT 值延長。但本研究并不能明確證實利伐沙班是否僅通過抗凝血途徑發揮抗炎作用，從而來減輕小鼠急性肺損傷的嚴重程度。
肺血管內皮細胞損傷和氣血屏障通透性增高在內毒素誘導急性肺損傷中起重要作用。急性肺損傷病變中有大量的細胞因子和炎癥因子表達增加[25]。炎癥因子促進白細胞黏附、凝血功能激活和肺氣血屏障通透性增加。肺毛細血管內皮細胞屏障的完整性在保持血管和肺組織功能穩定方面起關鍵作用[26]。本研究探究利伐沙班對炎癥信號通路 NF-κB 的作用，NF-κB 信號途徑已被證實在炎癥反應中起重要作用，本研究證明了利伐沙班對內毒素誘導急性肺損傷的抑制作用。PAR-2 可以被 TF-VIIα 復合物和 FXα 激活，同時 PAR-2 在炎癥反應和血管內皮細胞功能中起作用。本研究用急性肺損傷小鼠模型闡述 FXα 抑制劑和 PAR-2 之間的關系，發現內毒素激活 PAR-2 和促進炎癥細胞因子分泌。利伐沙班可以抑制 NF-κB 信號通路的激活，可以通過抑制 PAR-2-NF-κB 信號通路來抑制急性肺損傷的嚴重程度。
綜上所述，本研究利用內毒素氣管內滴注成功地建立了小鼠急性肺損傷模型，進一步在基礎實驗方面證實了急性肺損傷和凝血功能之間相互促進的關系。直接抑制 FXα 可以通過對炎癥信號通路 PAR-2-NF-κB 的抑制來改善急性肺損傷的炎癥反應。利伐沙班除了有抗凝作用外，也可以抑制內毒素引起的炎癥反應。關于 FXα 抑制劑改善急性肺損傷的具體機制還需進一步細胞學方面的研究。
急性肺損傷是一種常見的呼吸衰竭疾病，特點是肺毛細血管滲出增加、中性粒細胞浸潤和肺氣血屏障破壞[1]，其病理變化還包括出血及微血栓形成[2]。在感染性疾病引起的急性肺損傷，細菌性膿毒血癥是死亡的主要因素；細菌產生的毒素，如脂多糖和內毒素會導致炎癥反應、細胞骨架重構和內皮屏障破壞[3]。急性肺損傷的病理改變包括炎癥反應和肺組織內促凝血及抗纖溶功能增強[4]，特別是肺組織內凝血功能激活相對于抗凝和纖溶來說在急性肺損傷的病理生理改變中更加重要[2]。肺組織中的凝血功能增強，會影響組織中炎癥反應及損傷修復[5]。研究表明腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素-1β（interleukin 1β，IL-1β）和 IL-6，可以激活外源性凝血途徑；同時凝血因子 Xα（coagulation factor Xα，FXα）、α-凝血酶和纖維蛋白的增加也促使 IL-6 和 IL-8 的合成[6]。因此，凝血和炎癥反應的相互促進，會導致急性肺損傷程度加重[7]。
研究表明，除了促凝血功能外，FXα 在其他生理過程中也起重要作用，涉及炎癥調節、血管重構和組織纖維化[8-9]。急性肺損傷小鼠的肺泡灌洗液中凝血酶和 FXα 升高[10]。FXα 可以增加炎癥因子的 mRNA 表達[11-12]。凝血因子的非凝血功能主要通過蛋白酶激活受體（protease-activated receptors，PARs）調節，增加組織炎癥反應及抑制組織修復[12-14]。PARs 是一種 G 蛋白結合受體家族，調節凝血系統蛋白酶的功能，例如凝血酶、胰蛋白酶和金屬蛋白酶[15]。生理條件下，PAR-2 主要表達在血管內皮細胞上，PAR-2 激活可以促進內皮細胞轉變成促炎細胞，使血管通透性增加，促炎癥因子分泌及表達增加[16-18]。
利伐沙班是一種口服抗凝藥，可以抑制 FXα 和減少體內炎癥介質分泌[12]。但是，利伐沙班是否對內毒素誘導的急性肺損傷有影響及相關作用機制研究沒有相關報道。本研究旨在小鼠體內證明利伐沙班通過抑制 PAR-2-NF-κB 信號通路改善內毒素引起的急性肺損傷。
1 材料與方法
1.1 藥品及試劑
FXα 購自 Hematologic Technologies 公司，內毒素和伊文思藍購自 Sigma 公司，利伐沙班購自拜耳藥業，上海斯萊克動物飼料公司制備含有利伐沙班 0.4 mg/g 和 0.2 mg/g 嚙齒類動物飼料。小鼠的凝血功能用法國 Stago 公司的半自動血凝儀檢測。各種單克隆抗體，如 P65、p-P65、β-肌動蛋白（β-actin）購自 Cell Signaling Technology 公司。PAR-2 抗體購自 Abcam 公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）抗體購自 R&D 公司；鼠 IL-1β、IL-6 和 TNF-α 的酶聯免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒購自 R&D 公司。蛋白濃度測量用 BCA 試劑盒。所有試劑及藥品均為藥物級別。
1.2 動物實驗及標本取材
雄性 C57BL/6 小鼠（6～7 周，平均體重 20 g）購自斯萊克實驗動物中心［動物生產許可證號：scxk（滬 2017-0005）］。將 C57BL/6 小鼠隨機分為對照組（ PBS 組）、標準飼料組（N-LPS 組）、 0.2 mg/g 利伐沙班組（L-LPS 組）和 0.4 mg/g 利伐沙班組（H-LPS 組）。PBS 組給予標準飼料喂養；N-LPS 組、L-LPS 組和 H-LPS 組造模前分別給予標準飼料、含有 0.2 mg/g 或 0.4 mg/g 利伐沙班的飼料共 10 d[14]。飼料喂養前后分別稱量各組小鼠體重，評估不同飼料對小鼠營養狀態的影響。喂養 10 d 后，N-LPS 組、L-LPS 組和 H-LPS 組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉，經氣管按體重滴注內毒素（濃度為 2 mg/mL，2.5 μL/g）進行造模，PBS 組給予相同容積的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）。造模 48 h 后，處死小鼠取血漿、支氣管肺泡灌洗液及肺組織進行相關實驗結果分析。小鼠急性肺損傷建模流程見圖 1。每組 6 只小鼠。
圖1
內毒素氣管內滴注建立小鼠急性肺損傷模型流程圖
內毒素氣管內滴注建立小鼠急性肺損傷模型，造模前給予標準飼料或給予含有不同劑量利伐沙班藥物的飼料
從心臟取出全血后，根據全血體積與 3.4% 的枸櫞酸鈉相混合，用兩次離心法制備乏血小板血漿，然后分裝血漿保存在–80 ℃冰箱中。行左肺肺泡灌洗，回收支氣管肺泡灌洗液分別測炎癥細胞數量、蛋白濃度、伊文思藍濃度和細胞因子含量。一部分右肺組織用福爾馬林固定和石蠟包埋。部分肺組織行蛋白印跡法（Western blot）檢測分析。所有實驗經過復旦大學動物實驗及關懷委員會同意。
1.3 檢測指標
1.3.1 凝血功能評價
測定鼠尾出血時間。乏血小板血漿用半自動血凝儀測定活化部分凝血活酶時間（activated partial thromboplastin time，APTT）、凝血酶原時間（prothrombin time，PT）和凝血酶時間（thrombin time，TT）。
1.3.2 利伐沙班血藥濃度的測定
用液相色譜–質譜（liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）法測定[19]。用利奈唑胺作為內參照，血清中二甲基亞砜為 0.05%，不影響小鼠凝血功能[20]。
1.3.3 肺濕干重比
取右肺下葉放在事先稱重的鋁箔紙上，稱重減去鋁箔紙重量，表示濕重；將其放入 60 ℃ 溫箱中烘烤 5 d，再次稱重獲得此肺組織干重（即兩次測量干重質量固定后被確定為肺組織干重）。所得濕重和干重比值為濕干重比[21]。
1.3.4 肺氣血屏障的通透性評價
肺組織通透性用肺泡灌洗液中的蛋白濃度、伊文思藍濃度和肺組織內伊文思藍含量表示[22]。用 BCA 方法測定肺泡灌洗液中的蛋白濃度。血清白蛋白結合的伊文思藍復合物可以通過肺泡氣血屏障到達損傷的肺組織部位[23]。肺泡灌洗液和肺組織萃取液經 620 nm 波長光測定溶液中的伊文思藍濃度，計算肺泡灌洗液（μg/mL）及單位質量干肺組織中的伊文思藍含量（μg/g）。
1.3.5 肺泡灌洗液中的炎癥細胞計數
肺泡灌洗液中的細胞沉淀，用小動物血細胞分析儀測定炎癥細胞數量。取 10 μL 細胞重懸液滴在載玻片上，用吉姆薩–瑞特染液進行懸浮細胞染色，顯微鏡下觀察及計數有核細胞，確定分類及數量。
1.3.6 肺組織的形態學評價
開胸取右肺部分肺葉，用 10% 的福爾馬林固定，石蠟包埋，蘇木精–伊紅染色，光鏡下評價肺損傷程度，計算肺組織病理損傷評分（total histology score，THS）。
1.3.7 放射學分析
小動物 CT 目前已成為一種有效的實驗室檢查方法。為了評價 LPS 對肺損傷的影響，急性肺損傷小鼠制備 48 h 后用西門子的小動物 CT 掃描小鼠整個胸腔，用 Feldkamp 算法重構圖像，用 DICOM 軟件讀片及獲得有效圖像。
1.3.8 免疫組織化學分析
石蠟切片進行脫蠟，用梯度乙醇脫水；室溫用 10% 小羊血清封閉 30 min，然后相應一抗 4 ℃ 孵育過夜；37 ℃ 二抗孵育 20 min；顯微鏡觀察并記錄。
1.3.9 ELISA 檢測肺泡灌洗液中炎癥因子
采用小鼠的左肺肺泡灌洗液，回收率為 80%，用鼠相應 ELISA 試劑盒，測量炎癥細胞因子 TNF-α、IL-1β 和 IL-6 的濃度。
1.3.10 Western blot 檢測
采用深低溫凍存的肺組織，勻漿，取上清液；檢測肺組織中的 MPO、PAR-2、P65、p-P65 和β-actin 含量。用 1% PMSF 的組織裂解液裂解組織，用 SDS-PAGE 膠分離目標蛋白，一抗 4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育 2 h，顯影和拍照。用 ImageJ 軟件檢測目標蛋白和內參照蛋白的灰度比值。
1.4 統計學方法
采用 GraphPad Prism 軟件進行數據分析。呈正態分布的計量數據用均數±標準差（±s）表示，用 Student’s 非配對 t 檢驗和 ANOVA 多參數檢驗方法進行統計學分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組小鼠的基本情況
本實驗首先觀察用不同含量利伐沙班飼料喂養后的小鼠，三組間體重無明顯差異（圖 2a）。用 LC-MS 方法檢測利伐沙班的血藥濃度，給予0.2 mg/g 和 0.4 mg/g 利伐沙班飼料的小鼠利伐沙班血藥濃度相應上升（圖 2b）。不同飼料喂養的各組小鼠，鼠尾出血時間差異無統計學意義（P=0.03）（圖 2c）。檢測各組小鼠乏血小板血漿中凝血功能的 PT、APTT 和 TT 值（圖 2d~f），各組 TT、APTT 值沒有顯著差異（P>0.05）；但是，用含 0.4 mg/g 利伐沙班飼料喂養的小鼠與常規飼料小鼠相比，其凝血功能 PT 值延長；低劑量的利伐沙班飼料對小鼠的 PT 值沒有明顯影響。
圖2
不同飼料喂養的小鼠基本情況
a. 小鼠的體重；b. 利伐沙班的血藥濃度；c. 鼠尾出血時間；d. PT；e. APTT；f. TT。與 N-LPS 組比較，*
2.2 利伐沙班減輕內毒素引起的急性肺損傷
內毒素刺激 48 h 后，各組小鼠急性肺損傷病理改變明顯，炎癥細胞浸潤，肺間質增厚，組織水腫明顯（圖 3a）。用 THS 方法半定量評價肺損傷嚴重程度，發現高劑量利伐沙班飼料喂養的小鼠，與正常飼料喂養的小鼠相比，內毒素氣管內滴注后急性肺損傷程度明顯減輕；但是，內毒素在低劑量利伐沙班飼料喂養小鼠并沒有表現出相應作用（圖 3b）。用小動物 CT 掃描檢查各組小鼠急性肺組織損傷程度，與對照組小鼠比較，急性肺損傷組表現出雙側肺野廣泛滲出，高劑量利伐沙班飼料喂養可以減輕急性肺損傷滲出（圖 3c）。
圖3
利伐沙班可以減輕急性肺損傷程度
a. 小鼠肺組織病理像（蘇木精–伊紅染色×100）；b. 小鼠肺組織的 THS 評分；c. 小動物 CT 影像學檢測各組小鼠急性肺損傷程度。與 PBS 組比較，*
2.3 利伐沙班減輕肺損傷氣血屏障的通透性
對照組小鼠肺濕干重比為 4.30±0.11，內毒素刺激后，急性肺損傷小鼠肺的濕干重比為 5.29±0.25。用標準飼料和含有利伐沙班飼料喂養的各組急性肺損傷小鼠肺濕干重比差異無統計學意義（圖 4a）。與對照組相比，內毒素誘導急性肺損傷后肺泡灌洗液的蛋白濃度明顯升高（P<0.05）。用含 0.2 mg/g 和 0.4 mg/g 利伐沙班飼料喂養的小鼠，急性肺損傷后肺泡灌洗液蛋白濃度降低（P<0.05，圖 4b）。急性肺損傷造模 48 h 后，與對照組相比，內毒素刺激后肺泡灌洗液和肺組織中伊文思藍含量明顯增高（P<0.05）；與 N-LPS 組小鼠相比，L-LPS 及 H-LPS 組小鼠肺泡灌洗液及肺組織中伊文思藍濃度明顯降低（P<0.05）（圖 4c、d）。以上結果提示，利伐沙班可以通過改善肺氣血屏障通透性減輕急性肺損傷的嚴重程度。
圖4
利伐沙班對急性肺損傷氣血屏障通透性的影響
a. 肺濕干重比；b. 肺泡灌洗液中的蛋白濃度；c. 肺泡灌洗液中伊文思藍濃度；d. 小鼠肺組織中伊文思藍濃度。與 PBS 組比較，*
2.4 利伐沙班抑制急性肺損傷的炎癥反應
急性肺損傷后肺泡灌洗液內炎癥細胞數量增加（圖 5a）。急性肺損傷組肺泡灌洗液內炎癥細胞數量是對照組的 8 倍，H-LPS 與 N-LPS 組相比，炎癥細胞減少 45%（P<0.05，圖 5b）。用 Western blot 檢測肺組織中 MPO 活性（圖 5c、d），用免疫組織化學方法觀察組織切片中 MPO 陽性細胞的數量，急性肺損傷后 MPO 陽性的棕色細胞數量明顯增加（圖 5e）。高劑量利伐沙班飼料喂養小鼠后，急性肺損傷的 MPO 水平明顯下降（P<0.05）。用 ELISA 方法檢測炎癥細胞因子 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 的水平，發現對照組肺泡灌洗液中 TNF-α、IL-6 和 IL-1β 含量很低；內毒素氣管內滴注后，肺泡灌洗液中炎癥因子表達增加明顯（P<0.01）；利伐沙班預處理后這些炎癥因子表達減低（P<0.05）。結果見圖5 f~h。
圖5
利伐沙班抑制急性肺損傷的炎癥反應
a. 肺泡灌洗液中炎癥細胞病理像（吉姆薩–瑞特×100）；b. 肺泡灌洗液中細胞數量；c、d. 肺組織中 MPO 含量 Western blot 檢測像和定量分析；e. 肺組織中 MPO 表達病理像（免疫組織化學×100）；f. 肺泡灌洗液中 IL-1β 含量；g. 肺泡灌洗液中 TNF-α 含量；h. 肺泡灌洗液中 IL-6 含量。與 PBS 組比較，*
2.5 利伐沙班通過 PAR-2-NF-κB 信號通路抑制炎癥反應
與 PBS 組相比，內毒素處理組小鼠肺組織中 PAR-2 表達增加，PAR-2 陽性的棕色細胞明顯增多（圖 6a）；與 N-LPS 組相比，利伐沙班可以降低肺組織中 PAR-2 和 p-P65 的蛋白表達（圖 6b~d）。這些結果表明 PAR-2 和 FXa 與急性肺損傷的病理改變相關。利伐沙班可以通過抑制 PAR-2-NF-κB 信號通路減輕內毒素誘導的肺損傷。
圖6
利伐沙班抑制炎癥信號通路 PAR-2-NF-κB 的激活
a. 肺組織 PAR-2 表達病理像（免疫組織化學染色×100 及×400）；b. 肺組織 PAR-2、P65 和 p-P65 蛋白表達 Western blot 檢測像（β-actin作為內參照）；c. 肺組織中 PAR-2 含量；d. 肺組織中 p-P65 含量。與 PBS 組比較，*
3 討論
本研究證實利伐沙班有抗凝作用，影響外源性凝血途徑，并可以抑制炎癥反應，改善內毒素引起的小鼠急性肺損傷。用含有 0.4 mg/g 利伐沙班飼料喂養小鼠，凝血功能 PT 時間明顯延長。抑制 FXα 可以減輕急性肺損傷程度，降低肺組織中炎癥因子含量，如 IL-1β、TNF-α 和 IL-6。利伐沙班抑制急性肺損傷組織中 PAR-2 表達，從而通過對核轉錄因子（nuclear factor kappa B，NF-κB）炎癥信號通路抑制改善急性肺損傷嚴重程度。
凝血級聯反應的主要功能是促進止血和減少血液丟失，在炎癥反應和組織損傷修復過程中也起重要作用。凝血蛋白酶如 FXα 和凝血酶，除了有促凝血功能以外，也可以促進多種炎癥反應[24]。急性肺損傷與肺組織內局部的炎癥反應和凝血功能異常都相關。炎癥反應和凝血功能相互促進可以進一步加重急性肺損傷，如果抑制一方面的異常可以打破這種相互促進的狀態，從而減輕急性肺損傷的病理改變。本研究發現，應用 FXα 抑制劑不僅可以抑制小鼠的外源性凝血功能，也可以抑制急性肺損傷的局部炎癥反應，因此推測它通過抑制促凝血狀態來抑制炎癥反應。既往研究已發現，內毒素氣管內滴注引起的急性肺損傷小鼠凝血功能沒有明顯變化，即急性肺損傷小鼠的 PT、APTT 和 TT 值與正常小鼠相比沒有明顯變化[5]。用含有高劑量利伐沙班飼料喂養小鼠，其體內血藥濃度可達到 141 ng/mL，遠高于治療作用人體內的血藥濃度，小鼠凝血功能中的 PT 值延長。但本研究并不能明確證實利伐沙班是否僅通過抗凝血途徑發揮抗炎作用，從而來減輕小鼠急性肺損傷的嚴重程度。
肺血管內皮細胞損傷和氣血屏障通透性增高在內毒素誘導急性肺損傷中起重要作用。急性肺損傷病變中有大量的細胞因子和炎癥因子表達增加[25]。炎癥因子促進白細胞黏附、凝血功能激活和肺氣血屏障通透性增加。肺毛細血管內皮細胞屏障的完整性在保持血管和肺組織功能穩定方面起關鍵作用[26]。本研究探究利伐沙班對炎癥信號通路 NF-κB 的作用，NF-κB 信號途徑已被證實在炎癥反應中起重要作用，本研究證明了利伐沙班對內毒素誘導急性肺損傷的抑制作用。PAR-2 可以被 TF-VIIα 復合物和 FXα 激活，同時 PAR-2 在炎癥反應和血管內皮細胞功能中起作用。本研究用急性肺損傷小鼠模型闡述 FXα 抑制劑和 PAR-2 之間的關系，發現內毒素激活 PAR-2 和促進炎癥細胞因子分泌。利伐沙班可以抑制 NF-κB 信號通路的激活，可以通過抑制 PAR-2-NF-κB 信號通路來抑制急性肺損傷的嚴重程度。
綜上所述，本研究利用內毒素氣管內滴注成功地建立了小鼠急性肺損傷模型，進一步在基礎實驗方面證實了急性肺損傷和凝血功能之間相互促進的關系。直接抑制 FXα 可以通過對炎癥信號通路 PAR-2-NF-κB 的抑制來改善急性肺損傷的炎癥反應。利伐沙班除了有抗凝作用外，也可以抑制內毒素引起的炎癥反應。關于 FXα 抑制劑改善急性肺損傷的具體機制還需進一步細胞學方面的研究。
