引用本文： 陳思, 肖華, 張偉, 孔晨, 陳長明, VenkataramanaSidhaye, 李強, 白沖. 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的氣–液界面培養. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(4): 362-368. doi: 10.7507/1671-6205.201903074 復制
呼吸道上皮細胞在維持內環境穩態和宿主防御中起關鍵作用，如物理屏障、分泌和修飾氣道表面液體層，通過黏膜纖毛擺動清除微粒，分泌固有免疫的重要組分，識別并對病原體相關分子模式進行應答、介導信號傳導，還能通過細胞凋亡及脫落來內化和清除微生物[1-2]。哺乳動物的氣管–支氣管上皮為假復層纖毛柱狀上皮，主要由纖毛細胞、杯狀細胞、刷細胞、Clara 細胞、神經內分泌細胞，以及底層間隙區散在的基底細胞（basal cells）構成[1]。其中，p63、CK5/CK14 陽性的基底細胞有增殖分化能力，能取代病損的纖毛細胞和杯狀細胞，目前被普遍認為是大氣道的干細胞/祖細胞（proximal airway stem/progenitor cells）[3]。纖毛細胞表面的纖毛結構是黏液纖毛清除防御系統（mucociliary clearance）的重要組分，它以特定的頻率和模式協調擺動，運轉和清除氣道中的異物、衰老細胞及細胞產物，從而維持呼吸道的健康[2, 4-5]。杯狀細胞因底部狹窄、頂部膨大，形似酒杯故而得名。杯狀細胞胞質內充滿過碘酸希夫（periodic acid shiff，PAS）反應染色陽性的黏原顆粒，可分泌黏蛋白（mucin，Muc），參與構成氣道黏液。氣道黏液可粘附吸入氣體中的病原體、有毒顆粒等，再通過纖毛擺動、咳嗽、噴嚏等動作排出氣道[6-7]。當前，實驗室常用的氣道上皮大多來源于腫瘤組織或建系時與腫瘤細胞融合，不具備正常氣道上皮的細胞多樣性；即便應用原代氣道上皮，也未待其充分分化，不具上皮的多重功能，用這種氣道上皮進行實驗來模擬正常氣道上皮的生物學行為存在一定局限性。
為了促進人類疾病的小鼠模型、轉基因小鼠模型的氣道上皮研究，更確切地模擬氣道上皮對致病因素及治療的生物學反應，本研究建立了一套小鼠氣管–支氣管上皮細胞分離、培養及氣–液界面（air-liquid interface，ALI）促分化的體系，使用電子顯微鏡、組織化學、免疫熒光、電生理學等技術對氣道上皮細胞特性進行研究，并且對分化后的上皮細胞的纖毛擺動頻率進行測定。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑
4 周齡健康 BALB/c 小鼠 40 只，由第二軍醫大學動物實驗中心提供。所有實驗鼠在同一環境中進行適應性飼養和觀察 1 周，再進行后續實驗。本研究已通過第二軍醫大學實驗動物倫理審查（批準號：20181220059）。Ⅰ型鼠尾膠原（美國 BD 公司），6.5 mm 0.4 μm 孔徑 Transwell 小室及 24 孔板、Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清（美國 Corning 公司），60 mm×15 mm 細胞培養皿、冰醋酸、ⅪⅤ型鏈蛋白酶、醋酸鈉、醋酸鈣、100×鏈霉素–青霉素溶液、TBS、Triton X100、TWEEN? 20、牛血清白蛋白、山羊血清（美國 Sigma 公司），PneumaCultTM-Ex Plus 基礎培養基、PneumaCultTM-Ex Plus 50× 增補劑、PneumaCultTM-ALI 基礎培養基、PneumaCultTM-ALI 10× 增補劑、PneumaCultTM-ALI 100× 維持增補劑、氫化可的松、肝素（美國 StemCell 公司），跨上皮電阻測量儀（EVOM，美國 World Precision Instruments 公司），泛角蛋白（pan-cytokeratin）抗體、細胞角蛋白 5（cytokeratin 5，CK5）單抗、山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗（美國 Abcam 公司），上皮鈣黏素（E-cadherin）單抗（美國 Cellsignaling 公司），乙酰化微管蛋白（acetylated tubulin）單抗（美國 Invitrogen 公司），含 DAPI 抗淬滅封片液（美國 EMD Millipore 公司），酒精、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、臺盼藍（美國 ThermoFisher Scientific 公司），ddH2O，玻璃底 24 孔細胞培養板（美國 MatTek 公司），小動物手術器械（德國 Roboz 公司），顯微鏡（3i Spinning Disk Confocal、Olympus Color Station、Zeiss LSM 780，場發射掃描電鏡，Hitachi 透射電鏡，美國約翰霍普金斯大學醫學院顯微鏡中心提供）。
1.2 方法
1.2.1 增殖培養基及分化培養基的配置
（1）氣道上皮細胞增殖培養基的配置：將 10 mL PneumaCultTM-Ex Plus 50× 增補劑、0.5 mL 氫化可的松及 5 mL 鏈霉素–青霉素加入 485 mL PneumaCultTM-Ex Plus 基礎培養基，配置后 4 ℃ 保存，有效期 4 周。
（2）氣道上皮細胞分化培養基的配置：將 50 mL PneumaCultTM-ALI 10× 增補劑、5 mL 100×維持增補劑、1 mL 肝素、2.5 mL 氫化可的松及 5 mL 鏈霉素–青霉素加入 436.5 mL PneumaCultTM-ALI 基礎培養基，配置后 4 ℃ 保存，有效期 2 周。
1.2.2 Transwell 小室膠原包被
（1）0.02 mmol/L 冰醋酸的配制：按 1∶700 比例以無菌水稀釋冰醋酸（57 μL GAA∶50 mL 無菌水）。
（2）膠原溶液的配制：585 μL 鼠尾膠原原液與 50 mL 0.02 mmol/L 冰醋酸溶液混合，最終工作液濃度為 50 μg/mL。
（3）Transwell 小室的膠原包被：將配置的膠原溶液按照 100 μL/孔加入 Transwell 小室，37 ℃ 孵育至少 2 h，移除殘余膠原溶液，PBS 洗 2 次，4 ℃ 儲存備用。
1.2.3 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的分離
（1）雙抗 PBS 溶液的配置：將 100× 鏈霉素–青霉素溶液與 PBS 溶液按 1∶100 配置，4 ℃ 冰箱長期保存，使用前可以 37 ℃ 水浴鍋預熱。
（2）ⅪⅤ型鏈蛋白酶裂解液的配置：ⅪⅤ型鏈蛋白酶儲存液用含 0.01 mmol/L 醋酸鈉及0.005 mmol/L 醋酸鈣的無菌水配置，工作濃度為 20 mg/mL，分裝后可長期儲存于 –20 ℃。ⅪⅤ型鏈蛋白酶工作液：以預冷 PBS 稀釋至 1 mg/mL，4 ℃ 保存，有效期 2 周。
（3）成纖維細胞完全培養基的配置：按鏈霉素–青霉素雙抗∶胎牛血清∶DMEM=1∶10∶100 比例配制。
（4）氣管–支氣管的分離：取 BALB/c 小鼠經 CO2 窒息處死，固定于手術臺，頸部胸部噴灑酒精，避開口鼻部位。無菌條件下作頸部正中切口剪開皮膚，向雙側鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，直鑷夾住喉部，向近端牽拉，見氣管分叉后，依次斷離左右主支氣管，近端沿環狀軟骨斷離，盡量去除氣管–支氣管周圍的肌肉組織及結締組織，置于預熱的含鏈霉素–青霉素的 PBS 中。
（5）氣管組織的消化：沿長徑縱向剪開氣管–支氣管，用加樣槍以 PBS 反復輕柔吹洗，清除管腔內黏液。取 3 只 15 mL 離心管，分別加入 3 mL 預冷ⅪⅤ型鏈蛋白酶，后置入 5 根氣管–支氣管，4 ℃ 冰箱過夜，分別于 12、14、16 h 后取出，加入 3 mL 預熱 DMEM（含 10% 胎牛血清及鏈霉素青霉素）終止消化，來回震蕩，使上皮細胞脫離氣管支架。
1.2.4 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的原代培養
（1）差速貼壁法去除成纖維細胞：離心收集細胞，以 6 mL 成纖維細胞完全培養基重懸，接入 60 mm × 15 mm 細胞培養皿，細胞培養箱內培養 4 h 后，成纖維細胞因附著能力大于上皮細胞，提前貼壁而被除去，轉移未貼壁細胞，離心收集。取 0.1 mL 細胞懸液，臺盼藍染色后計數，計算活細胞率。
（2）增殖期培養：以氣道上皮細胞增殖培養基重懸，細胞計數后調整濃度為 5×105/mL，每個 6 mmTranswell 小室內接種 200 μL 細胞懸液，另在小室外每孔添加 1 mL 增殖培養基。
（3）分化期培養：在細胞融合率達 100% 后，移除 Transwell 小室內外培養基，在小室外加入 1 mL 氣道上皮細胞分化培養基，進行 ALI 培養。
1.2.5 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的形態學觀察
培養后不同時間點于顯微鏡下觀察并記錄細胞生長狀況。
1.2.6 上皮細胞跨膜電阻的測定
按照跨上皮電阻測量儀的使用說明書及 Srinivasan 等[8]的方法測量上皮細胞跨膜電阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）。具體操作：在小室內也添加 ALI 培養基，將電阻儀的短、長兩電極分別置于小室內、外，液面沒過電極頭，測量時電極垂直于細胞層，電極條勿觸底以免損傷細胞完整性而影響測量結果。每個小室測量 3 個 TEER 有效值，取其平均值。以未接種細胞的 Transwell 小室為空白對照，測得電阻值為 TEER空白，細胞層 TEER校正值=（TEER實測值–TEER空白值）×有效膜面積，單位為 Ω·cm2。本實驗使用的 Transwell 小室的有效膜面積為 0.33 cm2。
1.2.7 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的鑒定
（1）電鏡觀察超微結構：將細胞連帶 Transwell 膜一同切下，經 PBS 漂洗后，置于固定液，后續具體操作由約翰霍普金斯大學醫學院顯微鏡中心工作人員協助進行，分為兩部分。① 掃描電鏡觀察：PBS 充分漂洗 3 次，經 2.5% 戊二醛固定 4 h；PBS 漂洗 3 次，每次 15 min；經 50%、70%、90%、100% 酒精梯度脫水（各 15 min，100% 酒精脫水 3 次）；醋酸異戊酯置換，CO2 零界點干燥，離子濺射儀鍍金；場發射掃描電鏡上機觀察。② 透射電鏡觀察：2.5% 戊二醛固定 24 h，1% 鋨酸固定 4 h，乙醇及丙酮逐級脫水，環氧樹脂浸透包埋，超薄切片，Hitachi 透射電鏡觀察超微結構。
（2）細胞蘇木精–伊紅染色形態觀察：分別取 ALI 分化培養前、后的 Transwell 小室，PBS 清洗，經 4% PFA 固定、蔗糖脫水，OCT 包埋后行垂直面冰凍切片。常規蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，光學顯微鏡下觀察并記錄形態學變化。
（3）免疫熒光法鑒定表面標志：取冰凍切片，室溫干燥 2 h，用組化筆在載玻片上樣本周圍畫圈；PBS 清洗切片 3 次，每次 5 min；用含 0.3% Triton 的 TBS 破膜 10 min，傾去；滴加封閉液（含 5% 牛血清白蛋白，10% 山羊血清的 PBS）后置于濕盒，4 ℃ 過夜；PBST（含 0.2% Tween 的 PBS）清洗 2 次，每次 5 min；1∶200 比例稀釋一抗（泛角蛋白、E-cadherin、CK5、acetylated tubulin），200 μL/切片，對照組加等量 PBS，置于濕盒，4 ℃ 過夜或室溫 3 h 以上；PBST 清洗 3 次，每次 5 min；1∶400 比例稀釋山羊抗鼠/兔熒光二抗，200 μL/切片（含對照組），室溫下濕盒內避光染 2 h；PBST 洗 3 次，每次 5 min；載玻片上標本處滴加含 DAPI 防淬滅封片液后封片，Zeiss LSM 780 激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。
1.2.8 纖毛擺動頻率的測定
（1）小鼠氣管–支氣管上皮細胞纖毛擺動頻率（ciliary beat frequency，CBF）的測定：將已分化的小鼠氣管–支氣管上皮細胞 Transwell 小室置于玻璃底 24 孔細胞培養板，小室外加入 1 mL ALI 培養基。將培養板置于轉盤式共聚焦顯微鏡（Leica spinning disk confocal）外置溫箱（37 ℃，5% CO2）的載物臺上。在 32× 放大倍數物鏡下，用高清顯微鏡相機（Hamamatsu）以 100 Hz 頻率拍攝共計 250 張影像，形成高速延時視頻影像。每個 Transwell 小室選取隨機 5 處位置進行拍攝，后用 MATLAB_R2018b 腳本文件對每個視頻影像內的上皮細胞 CBF 進行分析，生成頻率熱圖，利用快速傅里葉變換來提取活動像素比率。
（2）小鼠氣管上皮纖毛 CBF 的測定：按 1.2.3 中方法獲取小鼠氣管–支氣管，沿長徑縱向剪開后進一步截取為若干 4 mm×4 mm 大小的組織塊。管徑面朝上置于玻璃底 24 孔細胞培養板，滴加 1 滴 ALI 培養基后即可開始觀察拍攝。具體拍攝及分析方法同上。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 24.0 統計軟件。符合正態分布的數據以均數±標準差（
±s）表示，兩組比較使用獨立樣本 t 檢驗，多組間用 One way ANOVA 進行單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的分離結果
小鼠氣管–支氣管組織經鏈蛋白酶冷消化 14 h 即可同時保證最終收集到的細胞數量及活力，因此后續實驗采用的消化時間均為 14 h。結果見表 1。
表1
鏈蛋白酶冷消化不同時長所得細胞數量及活力（n=5，
）
2.2 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的培養及光鏡下形態學觀察
光學顯微鏡下，新分離的上皮細胞呈圓形、透亮、分散度好；24 h 后可見部分貼壁細胞團，體積較小（圖 1a）；72 h 后見細胞已鋪展、增殖，呈多角形、鑲嵌狀，輪廓清晰、折光性好（圖 1b），此時細胞已牢固貼壁，可進行首次換液；6 d 左右，細胞增殖顯著，融合率已達 90%，細胞排列緊密，呈上皮細胞特殊的“鋪路石”狀（圖 1c）。
圖1
原代培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞光學顯微鏡下表現
a. 接種 24 h 后，部分貼壁細胞團，體積較小；b. 72 h 后，細胞已牢固貼壁，呈多角形、鑲嵌狀，輪廓清晰、折光性好；c. 6 d 后，細胞融合生長，排列緊密，呈“鋪路石”狀
2.3 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的 TEER 隨培養時間的變化
培養 1 周后，TEER實測值 大于 1 000 Ω，提示上皮完全融合；第 2 周開始，移除 Transwell 小室內外的增殖培養基，小室外改用氣道上皮分化培養基進行 ALI 分化培養，可見 TEER 呈先上升后下降趨勢，ALI 培養 3 周后 TEER 值趨于穩態。根據 Transwell 的有效膜面積（0.33 cm2）對 TEER 進行校正，結果見圖 2、表 2。
表2
小鼠氣管–支氣管上皮細胞的 TEER 的實測值及校正值（n=3，
）
圖2
小鼠氣管–支氣管上皮細胞 TEER校正值隨培養時間的變化
2.4 培養細胞 HE 染色形態學觀察以及免疫熒光染色鑒定結果
垂直面切片 HE 染色可見增殖期培養的細胞為單層，較扁平（圖 3a）；ALI 培養 3 周后細胞看似堆疊，細胞層增厚，部分細胞出現纖毛結構（圖 3b）；ALI 培養前后，泛角蛋白染色鑒定上皮細胞純度，可見所有細胞胞質均呈綠色，提示泛角蛋白染色陽性率均大于 99%（圖 3c、d）；ALI 培養后的第 3 周，分化后的細胞清晰可見底層 CK5 陽性表達的基底細胞（圖 3e）、纖毛結構 acetylated tubulin 陽性的纖毛細胞（圖 3f），以及細胞間黏著連接的標志物 E-cadherin 蛋白染色陽性（圖 3g）。
圖3
培養細胞 HE 染色形態學觀察以及免疫熒光染色鑒定結果
a. HE 染色，增殖期培養第 1 周，細胞為單層，較扁平；b. HE 染色，增殖期培養第 4 周（ALI 培養第 3 周），細胞層增厚，似有堆疊，部分細胞出現纖毛結構；c、d. 免疫熒光染色，分別為增殖期培養第 1 周及第 4 周（ALI 培養第 3 周），細胞胞質均呈綠色，提示泛角蛋白染色陽性；e ~ g. 免疫熒光染色，ALI 培養第 3 周，其中，e 圖顯示底層清晰可見 CK5 陽性表達（黃色熒光）的基底細胞，f 圖可見纖毛結構 acetylated tubulin 陽性（粉色熒光）的纖毛細胞，g 圖可見細胞間 E-cadherin 蛋白染色陽性（紅色熒光）
2.5 電鏡鑒定
ALI 培養后的第 3 周，透射電鏡下可見細胞間連接緊密，部分細胞近表面處可見基體（basal body），纖毛由基體處伸出。放大后可見纖毛截面呈“9+2”型，即外圍 9 組雙聯體微管和一對中心微管（圖 4a）。掃描電鏡下可見部分細胞表面有纖毛長出，成簇分布，具有纖毛柱狀上皮的特征（圖 4b）。
圖4
小鼠氣管–支氣管上皮細胞 ALI 培養第 3 周時的透射及掃描電鏡下表現
a. 透射電鏡下見細胞有纖毛長出，并能看見基體結構；b. 掃描電鏡下見細胞表面有成簇分布的纖毛，符合纖毛柱狀上皮特征
2.6 CBF 測定
小鼠氣管在體及原代培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞的纖毛擺動，原始影像經 MATLAB 軟件分析后生成熱圖及平均 CBF（圖 5），原代培養上皮細胞的 CBF 為（16.47±0.80）Hz，小鼠氣管在體的 CBF 為（16.67±0.76）Hz，經過兩獨立樣本均數 t 檢驗，原代培養細胞與氣管在體的 CBF 比較，差異無統計學意義（n=10，P>0.05）。
圖5
小鼠氣管在體及 ALI 原代培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞的 CBF 比較
a. 小鼠氣管的 CBF 原始影像分析熱圖；b. 原代 ALI 培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞的 CBF 原始影像分析熱圖；c. 兩組 CBF 比較。兩組 CBF 比較，差異無統計學意義（
3 討論
細胞極性（polarity）是真核生物細胞的基本特征，也是包括組織發育和氣管形成等眾多生命活動的基礎。上皮細胞的異常去極化與上皮細胞–間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及腫瘤的發生發展相關[9-10]。上皮細胞正常生理功能的實現取決于細胞分化程度以及細胞極性的形成與維持，且受細胞–細胞和細胞–基質相互作用產生的細胞外信號調節[11]。細胞極性對于保持原始組織的超微結構、離子轉運、基因表達和組織特征性生物分子的分泌是必需的。使用無極性和（或）低分化的原代培養細胞和永生化細胞系對于上皮細胞研究來說價值有限。
ALI 培養下細胞改為由底部吸收營養物質，這與氣管–支氣管上皮細胞的天然生長環境接近，并能有效分化出具有不同功能的細胞類型，如基細胞、纖毛細胞、杯狀細胞等。纖毛是基于細胞微管的一種亞細胞結構，纖毛的有序擺動可以將呼吸道中的灰塵和細菌排出[5, 12-14]。本方法所培養出的假復層纖毛柱狀上皮細胞的纖毛結構上呈常見的“9+2”型，具有擺動功能，且擺動頻率與在體氣管相仿。應用該模型可進一步研究氣道黏液–纖毛清除功能，以及生物/化學環境暴露對其產生的影響。溫度是影響 CBF 測量的重要因素[5]，該顯微鏡有外置的溫箱（37 ℃，CO2，濕度），能很好地擬合在體情況，保證測量的準確性。
氣道上皮是呼吸道防御機制的一道天然物理屏障，細胞跨上皮電阻測量反映生物屏障對帶電離子的通透性，電阻值與屏障的通透性成反比，是測量氣道上皮通透性的敏感指標之一。但根據我們的觀察，在培養的前 4 周（第 1 周為增殖培養，第 2 周開始為 ALI 分化培養），培養細胞的 TEER 值還處于波動狀態，ALI 培養后 3 周方趨于穩態。因此，如需進行各種病原體感染和（或）藥物治療對生物屏障通透性的相關實驗，建議在 ALI 培養 3 周后進行。
與既往文獻相比[15-23]，本實驗所采用的培養方式簡便，無需進行氣管結扎、腔內灌注酶溶液等繁瑣操作，也不需要通過流式細胞學技術進行分選。經過低溫酶消化法所獲得細胞的活力及純度較高；差速培養可進一步減少成纖維細胞的污染；另外，所用培養基不含有血清成分，也可有效抑制成纖維細胞增殖分裂。除外 ALI 培養，未來還可以基質膠為載體進行 3D 培養，使細胞在類似于機體環境的三維空間結構中增殖、遷移和分化，形成三維復合類器官結構[24-25]；抑或作為種子細胞，移植于脫細胞氣管支架或組織工程氣管，進行再生醫學研究[26-27]。除了應用分化后的細胞進行實驗，還能夠研究病原體/環境、藥物對細胞增殖、遷移、分化的影響。
該研究也有一定局限性。研究未能明確初始 24 h 內的貼壁細胞僅為基底細胞，還是纖毛細胞、杯狀細胞等退分化為基底細胞，當前中外文獻也無研究詳述[28-29]，有待進一步實驗。
綜上所述，經低溫鏈蛋白酶消化、ALI 培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞在表型特征和生理功能上都接近在體狀態，對于研究氣道上皮的增殖、分化、功能以及對環境致病因素的生物學反應等都有重要意義。
呼吸道上皮細胞在維持內環境穩態和宿主防御中起關鍵作用，如物理屏障、分泌和修飾氣道表面液體層，通過黏膜纖毛擺動清除微粒，分泌固有免疫的重要組分，識別并對病原體相關分子模式進行應答、介導信號傳導，還能通過細胞凋亡及脫落來內化和清除微生物[1-2]。哺乳動物的氣管–支氣管上皮為假復層纖毛柱狀上皮，主要由纖毛細胞、杯狀細胞、刷細胞、Clara 細胞、神經內分泌細胞，以及底層間隙區散在的基底細胞（basal cells）構成[1]。其中，p63、CK5/CK14 陽性的基底細胞有增殖分化能力，能取代病損的纖毛細胞和杯狀細胞，目前被普遍認為是大氣道的干細胞/祖細胞（proximal airway stem/progenitor cells）[3]。纖毛細胞表面的纖毛結構是黏液纖毛清除防御系統（mucociliary clearance）的重要組分，它以特定的頻率和模式協調擺動，運轉和清除氣道中的異物、衰老細胞及細胞產物，從而維持呼吸道的健康[2, 4-5]。杯狀細胞因底部狹窄、頂部膨大，形似酒杯故而得名。杯狀細胞胞質內充滿過碘酸希夫（periodic acid shiff，PAS）反應染色陽性的黏原顆粒，可分泌黏蛋白（mucin，Muc），參與構成氣道黏液。氣道黏液可粘附吸入氣體中的病原體、有毒顆粒等，再通過纖毛擺動、咳嗽、噴嚏等動作排出氣道[6-7]。當前，實驗室常用的氣道上皮大多來源于腫瘤組織或建系時與腫瘤細胞融合，不具備正常氣道上皮的細胞多樣性；即便應用原代氣道上皮，也未待其充分分化，不具上皮的多重功能，用這種氣道上皮進行實驗來模擬正常氣道上皮的生物學行為存在一定局限性。
為了促進人類疾病的小鼠模型、轉基因小鼠模型的氣道上皮研究，更確切地模擬氣道上皮對致病因素及治療的生物學反應，本研究建立了一套小鼠氣管–支氣管上皮細胞分離、培養及氣–液界面（air-liquid interface，ALI）促分化的體系，使用電子顯微鏡、組織化學、免疫熒光、電生理學等技術對氣道上皮細胞特性進行研究，并且對分化后的上皮細胞的纖毛擺動頻率進行測定。
1 材料與方法
1.1 主要材料及試劑
4 周齡健康 BALB/c 小鼠 40 只，由第二軍醫大學動物實驗中心提供。所有實驗鼠在同一環境中進行適應性飼養和觀察 1 周，再進行后續實驗。本研究已通過第二軍醫大學實驗動物倫理審查（批準號：20181220059）。Ⅰ型鼠尾膠原（美國 BD 公司），6.5 mm 0.4 μm 孔徑 Transwell 小室及 24 孔板、Dulbecco 改良 Eagle 培養基（Dulbecco's modified Eagle medium，DMEM）、胎牛血清（美國 Corning 公司），60 mm×15 mm 細胞培養皿、冰醋酸、ⅪⅤ型鏈蛋白酶、醋酸鈉、醋酸鈣、100×鏈霉素–青霉素溶液、TBS、Triton X100、TWEEN? 20、牛血清白蛋白、山羊血清（美國 Sigma 公司），PneumaCultTM-Ex Plus 基礎培養基、PneumaCultTM-Ex Plus 50× 增補劑、PneumaCultTM-ALI 基礎培養基、PneumaCultTM-ALI 10× 增補劑、PneumaCultTM-ALI 100× 維持增補劑、氫化可的松、肝素（美國 StemCell 公司），跨上皮電阻測量儀（EVOM，美國 World Precision Instruments 公司），泛角蛋白（pan-cytokeratin）抗體、細胞角蛋白 5（cytokeratin 5，CK5）單抗、山羊抗兔熒光二抗、山羊抗鼠熒光二抗（美國 Abcam 公司），上皮鈣黏素（E-cadherin）單抗（美國 Cellsignaling 公司），乙酰化微管蛋白（acetylated tubulin）單抗（美國 Invitrogen 公司），含 DAPI 抗淬滅封片液（美國 EMD Millipore 公司），酒精、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、臺盼藍（美國 ThermoFisher Scientific 公司），ddH2O，玻璃底 24 孔細胞培養板（美國 MatTek 公司），小動物手術器械（德國 Roboz 公司），顯微鏡（3i Spinning Disk Confocal、Olympus Color Station、Zeiss LSM 780，場發射掃描電鏡，Hitachi 透射電鏡，美國約翰霍普金斯大學醫學院顯微鏡中心提供）。
1.2 方法
1.2.1 增殖培養基及分化培養基的配置
（1）氣道上皮細胞增殖培養基的配置：將 10 mL PneumaCultTM-Ex Plus 50× 增補劑、0.5 mL 氫化可的松及 5 mL 鏈霉素–青霉素加入 485 mL PneumaCultTM-Ex Plus 基礎培養基，配置后 4 ℃ 保存，有效期 4 周。
（2）氣道上皮細胞分化培養基的配置：將 50 mL PneumaCultTM-ALI 10× 增補劑、5 mL 100×維持增補劑、1 mL 肝素、2.5 mL 氫化可的松及 5 mL 鏈霉素–青霉素加入 436.5 mL PneumaCultTM-ALI 基礎培養基，配置后 4 ℃ 保存，有效期 2 周。
1.2.2 Transwell 小室膠原包被
（1）0.02 mmol/L 冰醋酸的配制：按 1∶700 比例以無菌水稀釋冰醋酸（57 μL GAA∶50 mL 無菌水）。
（2）膠原溶液的配制：585 μL 鼠尾膠原原液與 50 mL 0.02 mmol/L 冰醋酸溶液混合，最終工作液濃度為 50 μg/mL。
（3）Transwell 小室的膠原包被：將配置的膠原溶液按照 100 μL/孔加入 Transwell 小室，37 ℃ 孵育至少 2 h，移除殘余膠原溶液，PBS 洗 2 次，4 ℃ 儲存備用。
1.2.3 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的分離
（1）雙抗 PBS 溶液的配置：將 100× 鏈霉素–青霉素溶液與 PBS 溶液按 1∶100 配置，4 ℃ 冰箱長期保存，使用前可以 37 ℃ 水浴鍋預熱。
（2）ⅪⅤ型鏈蛋白酶裂解液的配置：ⅪⅤ型鏈蛋白酶儲存液用含 0.01 mmol/L 醋酸鈉及0.005 mmol/L 醋酸鈣的無菌水配置，工作濃度為 20 mg/mL，分裝后可長期儲存于 –20 ℃。ⅪⅤ型鏈蛋白酶工作液：以預冷 PBS 稀釋至 1 mg/mL，4 ℃ 保存，有效期 2 周。
（3）成纖維細胞完全培養基的配置：按鏈霉素–青霉素雙抗∶胎牛血清∶DMEM=1∶10∶100 比例配制。
（4）氣管–支氣管的分離：取 BALB/c 小鼠經 CO2 窒息處死，固定于手術臺，頸部胸部噴灑酒精，避開口鼻部位。無菌條件下作頸部正中切口剪開皮膚，向雙側鈍性分離頜下腺及肌肉，暴露氣管，直鑷夾住喉部，向近端牽拉，見氣管分叉后，依次斷離左右主支氣管，近端沿環狀軟骨斷離，盡量去除氣管–支氣管周圍的肌肉組織及結締組織，置于預熱的含鏈霉素–青霉素的 PBS 中。
（5）氣管組織的消化：沿長徑縱向剪開氣管–支氣管，用加樣槍以 PBS 反復輕柔吹洗，清除管腔內黏液。取 3 只 15 mL 離心管，分別加入 3 mL 預冷ⅪⅤ型鏈蛋白酶，后置入 5 根氣管–支氣管，4 ℃ 冰箱過夜，分別于 12、14、16 h 后取出，加入 3 mL 預熱 DMEM（含 10% 胎牛血清及鏈霉素青霉素）終止消化，來回震蕩，使上皮細胞脫離氣管支架。
1.2.4 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的原代培養
（1）差速貼壁法去除成纖維細胞：離心收集細胞，以 6 mL 成纖維細胞完全培養基重懸，接入 60 mm × 15 mm 細胞培養皿，細胞培養箱內培養 4 h 后，成纖維細胞因附著能力大于上皮細胞，提前貼壁而被除去，轉移未貼壁細胞，離心收集。取 0.1 mL 細胞懸液，臺盼藍染色后計數，計算活細胞率。
（2）增殖期培養：以氣道上皮細胞增殖培養基重懸，細胞計數后調整濃度為 5×105/mL，每個 6 mmTranswell 小室內接種 200 μL 細胞懸液，另在小室外每孔添加 1 mL 增殖培養基。
（3）分化期培養：在細胞融合率達 100% 后，移除 Transwell 小室內外培養基，在小室外加入 1 mL 氣道上皮細胞分化培養基，進行 ALI 培養。
1.2.5 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的形態學觀察
培養后不同時間點于顯微鏡下觀察并記錄細胞生長狀況。
1.2.6 上皮細胞跨膜電阻的測定
按照跨上皮電阻測量儀的使用說明書及 Srinivasan 等[8]的方法測量上皮細胞跨膜電阻（trans-epithelial electrical resistance，TEER）。具體操作：在小室內也添加 ALI 培養基，將電阻儀的短、長兩電極分別置于小室內、外，液面沒過電極頭，測量時電極垂直于細胞層，電極條勿觸底以免損傷細胞完整性而影響測量結果。每個小室測量 3 個 TEER 有效值，取其平均值。以未接種細胞的 Transwell 小室為空白對照，測得電阻值為 TEER空白，細胞層 TEER校正值=（TEER實測值–TEER空白值）×有效膜面積，單位為 Ω·cm2。本實驗使用的 Transwell 小室的有效膜面積為 0.33 cm2。
1.2.7 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的鑒定
（1）電鏡觀察超微結構：將細胞連帶 Transwell 膜一同切下，經 PBS 漂洗后，置于固定液，后續具體操作由約翰霍普金斯大學醫學院顯微鏡中心工作人員協助進行，分為兩部分。① 掃描電鏡觀察：PBS 充分漂洗 3 次，經 2.5% 戊二醛固定 4 h；PBS 漂洗 3 次，每次 15 min；經 50%、70%、90%、100% 酒精梯度脫水（各 15 min，100% 酒精脫水 3 次）；醋酸異戊酯置換，CO2 零界點干燥，離子濺射儀鍍金；場發射掃描電鏡上機觀察。② 透射電鏡觀察：2.5% 戊二醛固定 24 h，1% 鋨酸固定 4 h，乙醇及丙酮逐級脫水，環氧樹脂浸透包埋，超薄切片，Hitachi 透射電鏡觀察超微結構。
（2）細胞蘇木精–伊紅染色形態觀察：分別取 ALI 分化培養前、后的 Transwell 小室，PBS 清洗，經 4% PFA 固定、蔗糖脫水，OCT 包埋后行垂直面冰凍切片。常規蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色后，光學顯微鏡下觀察并記錄形態學變化。
（3）免疫熒光法鑒定表面標志：取冰凍切片，室溫干燥 2 h，用組化筆在載玻片上樣本周圍畫圈；PBS 清洗切片 3 次，每次 5 min；用含 0.3% Triton 的 TBS 破膜 10 min，傾去；滴加封閉液（含 5% 牛血清白蛋白，10% 山羊血清的 PBS）后置于濕盒，4 ℃ 過夜；PBST（含 0.2% Tween 的 PBS）清洗 2 次，每次 5 min；1∶200 比例稀釋一抗（泛角蛋白、E-cadherin、CK5、acetylated tubulin），200 μL/切片，對照組加等量 PBS，置于濕盒，4 ℃ 過夜或室溫 3 h 以上；PBST 清洗 3 次，每次 5 min；1∶400 比例稀釋山羊抗鼠/兔熒光二抗，200 μL/切片（含對照組），室溫下濕盒內避光染 2 h；PBST 洗 3 次，每次 5 min；載玻片上標本處滴加含 DAPI 防淬滅封片液后封片，Zeiss LSM 780 激光共聚焦顯微鏡下觀察結果。
1.2.8 纖毛擺動頻率的測定
（1）小鼠氣管–支氣管上皮細胞纖毛擺動頻率（ciliary beat frequency，CBF）的測定：將已分化的小鼠氣管–支氣管上皮細胞 Transwell 小室置于玻璃底 24 孔細胞培養板，小室外加入 1 mL ALI 培養基。將培養板置于轉盤式共聚焦顯微鏡（Leica spinning disk confocal）外置溫箱（37 ℃，5% CO2）的載物臺上。在 32× 放大倍數物鏡下，用高清顯微鏡相機（Hamamatsu）以 100 Hz 頻率拍攝共計 250 張影像，形成高速延時視頻影像。每個 Transwell 小室選取隨機 5 處位置進行拍攝，后用 MATLAB_R2018b 腳本文件對每個視頻影像內的上皮細胞 CBF 進行分析，生成頻率熱圖，利用快速傅里葉變換來提取活動像素比率。
（2）小鼠氣管上皮纖毛 CBF 的測定：按 1.2.3 中方法獲取小鼠氣管–支氣管，沿長徑縱向剪開后進一步截取為若干 4 mm×4 mm 大小的組織塊。管徑面朝上置于玻璃底 24 孔細胞培養板，滴加 1 滴 ALI 培養基后即可開始觀察拍攝。具體拍攝及分析方法同上。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 24.0 統計軟件。符合正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，兩組比較使用獨立樣本 t 檢驗，多組間用 One way ANOVA 進行單因素方差分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的分離結果
小鼠氣管–支氣管組織經鏈蛋白酶冷消化 14 h 即可同時保證最終收集到的細胞數量及活力，因此后續實驗采用的消化時間均為 14 h。結果見表 1。
表1
鏈蛋白酶冷消化不同時長所得細胞數量及活力（n=5，）
2.2 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的培養及光鏡下形態學觀察
光學顯微鏡下，新分離的上皮細胞呈圓形、透亮、分散度好；24 h 后可見部分貼壁細胞團，體積較小（圖 1a）；72 h 后見細胞已鋪展、增殖，呈多角形、鑲嵌狀，輪廓清晰、折光性好（圖 1b），此時細胞已牢固貼壁，可進行首次換液；6 d 左右，細胞增殖顯著，融合率已達 90%，細胞排列緊密，呈上皮細胞特殊的“鋪路石”狀（圖 1c）。
圖1
原代培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞光學顯微鏡下表現
a. 接種 24 h 后，部分貼壁細胞團，體積較小；b. 72 h 后，細胞已牢固貼壁，呈多角形、鑲嵌狀，輪廓清晰、折光性好；c. 6 d 后，細胞融合生長，排列緊密，呈“鋪路石”狀
2.3 小鼠氣管–支氣管上皮細胞的 TEER 隨培養時間的變化
培養 1 周后，TEER實測值 大于 1 000 Ω，提示上皮完全融合；第 2 周開始，移除 Transwell 小室內外的增殖培養基，小室外改用氣道上皮分化培養基進行 ALI 分化培養，可見 TEER 呈先上升后下降趨勢，ALI 培養 3 周后 TEER 值趨于穩態。根據 Transwell 的有效膜面積（0.33 cm2）對 TEER 進行校正，結果見圖 2、表 2。
表2
小鼠氣管–支氣管上皮細胞的 TEER 的實測值及校正值（n=3，）
圖2
小鼠氣管–支氣管上皮細胞 TEER校正值隨培養時間的變化
2.4 培養細胞 HE 染色形態學觀察以及免疫熒光染色鑒定結果
垂直面切片 HE 染色可見增殖期培養的細胞為單層，較扁平（圖 3a）；ALI 培養 3 周后細胞看似堆疊，細胞層增厚，部分細胞出現纖毛結構（圖 3b）；ALI 培養前后，泛角蛋白染色鑒定上皮細胞純度，可見所有細胞胞質均呈綠色，提示泛角蛋白染色陽性率均大于 99%（圖 3c、d）；ALI 培養后的第 3 周，分化后的細胞清晰可見底層 CK5 陽性表達的基底細胞（圖 3e）、纖毛結構 acetylated tubulin 陽性的纖毛細胞（圖 3f），以及細胞間黏著連接的標志物 E-cadherin 蛋白染色陽性（圖 3g）。
圖3
培養細胞 HE 染色形態學觀察以及免疫熒光染色鑒定結果
a. HE 染色，增殖期培養第 1 周，細胞為單層，較扁平；b. HE 染色，增殖期培養第 4 周（ALI 培養第 3 周），細胞層增厚，似有堆疊，部分細胞出現纖毛結構；c、d. 免疫熒光染色，分別為增殖期培養第 1 周及第 4 周（ALI 培養第 3 周），細胞胞質均呈綠色，提示泛角蛋白染色陽性；e ~ g. 免疫熒光染色，ALI 培養第 3 周，其中，e 圖顯示底層清晰可見 CK5 陽性表達（黃色熒光）的基底細胞，f 圖可見纖毛結構 acetylated tubulin 陽性（粉色熒光）的纖毛細胞，g 圖可見細胞間 E-cadherin 蛋白染色陽性（紅色熒光）
2.5 電鏡鑒定
ALI 培養后的第 3 周，透射電鏡下可見細胞間連接緊密，部分細胞近表面處可見基體（basal body），纖毛由基體處伸出。放大后可見纖毛截面呈“9+2”型，即外圍 9 組雙聯體微管和一對中心微管（圖 4a）。掃描電鏡下可見部分細胞表面有纖毛長出，成簇分布，具有纖毛柱狀上皮的特征（圖 4b）。
圖4
小鼠氣管–支氣管上皮細胞 ALI 培養第 3 周時的透射及掃描電鏡下表現
a. 透射電鏡下見細胞有纖毛長出，并能看見基體結構；b. 掃描電鏡下見細胞表面有成簇分布的纖毛，符合纖毛柱狀上皮特征
2.6 CBF 測定
小鼠氣管在體及原代培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞的纖毛擺動，原始影像經 MATLAB 軟件分析后生成熱圖及平均 CBF（圖 5），原代培養上皮細胞的 CBF 為（16.47±0.80）Hz，小鼠氣管在體的 CBF 為（16.67±0.76）Hz，經過兩獨立樣本均數 t 檢驗，原代培養細胞與氣管在體的 CBF 比較，差異無統計學意義（n=10，P>0.05）。
圖5
小鼠氣管在體及 ALI 原代培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞的 CBF 比較
a. 小鼠氣管的 CBF 原始影像分析熱圖；b. 原代 ALI 培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞的 CBF 原始影像分析熱圖；c. 兩組 CBF 比較。兩組 CBF 比較，差異無統計學意義（
3 討論
細胞極性（polarity）是真核生物細胞的基本特征，也是包括組織發育和氣管形成等眾多生命活動的基礎。上皮細胞的異常去極化與上皮細胞–間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）及腫瘤的發生發展相關[9-10]。上皮細胞正常生理功能的實現取決于細胞分化程度以及細胞極性的形成與維持，且受細胞–細胞和細胞–基質相互作用產生的細胞外信號調節[11]。細胞極性對于保持原始組織的超微結構、離子轉運、基因表達和組織特征性生物分子的分泌是必需的。使用無極性和（或）低分化的原代培養細胞和永生化細胞系對于上皮細胞研究來說價值有限。
ALI 培養下細胞改為由底部吸收營養物質，這與氣管–支氣管上皮細胞的天然生長環境接近，并能有效分化出具有不同功能的細胞類型，如基細胞、纖毛細胞、杯狀細胞等。纖毛是基于細胞微管的一種亞細胞結構，纖毛的有序擺動可以將呼吸道中的灰塵和細菌排出[5, 12-14]。本方法所培養出的假復層纖毛柱狀上皮細胞的纖毛結構上呈常見的“9+2”型，具有擺動功能，且擺動頻率與在體氣管相仿。應用該模型可進一步研究氣道黏液–纖毛清除功能，以及生物/化學環境暴露對其產生的影響。溫度是影響 CBF 測量的重要因素[5]，該顯微鏡有外置的溫箱（37 ℃，CO2，濕度），能很好地擬合在體情況，保證測量的準確性。
氣道上皮是呼吸道防御機制的一道天然物理屏障，細胞跨上皮電阻測量反映生物屏障對帶電離子的通透性，電阻值與屏障的通透性成反比，是測量氣道上皮通透性的敏感指標之一。但根據我們的觀察，在培養的前 4 周（第 1 周為增殖培養，第 2 周開始為 ALI 分化培養），培養細胞的 TEER 值還處于波動狀態，ALI 培養后 3 周方趨于穩態。因此，如需進行各種病原體感染和（或）藥物治療對生物屏障通透性的相關實驗，建議在 ALI 培養 3 周后進行。
與既往文獻相比[15-23]，本實驗所采用的培養方式簡便，無需進行氣管結扎、腔內灌注酶溶液等繁瑣操作，也不需要通過流式細胞學技術進行分選。經過低溫酶消化法所獲得細胞的活力及純度較高；差速培養可進一步減少成纖維細胞的污染；另外，所用培養基不含有血清成分，也可有效抑制成纖維細胞增殖分裂。除外 ALI 培養，未來還可以基質膠為載體進行 3D 培養，使細胞在類似于機體環境的三維空間結構中增殖、遷移和分化，形成三維復合類器官結構[24-25]；抑或作為種子細胞，移植于脫細胞氣管支架或組織工程氣管，進行再生醫學研究[26-27]。除了應用分化后的細胞進行實驗，還能夠研究病原體/環境、藥物對細胞增殖、遷移、分化的影響。
該研究也有一定局限性。研究未能明確初始 24 h 內的貼壁細胞僅為基底細胞，還是纖毛細胞、杯狀細胞等退分化為基底細胞，當前中外文獻也無研究詳述[28-29]，有待進一步實驗。
綜上所述，經低溫鏈蛋白酶消化、ALI 培養的小鼠氣管–支氣管上皮細胞在表型特征和生理功能上都接近在體狀態，對于研究氣道上皮的增殖、分化、功能以及對環境致病因素的生物學反應等都有重要意義。
