引用本文： 張嘉賓, 戈艷蕾, 劉聰輝, 張盼盼, 王紅陽, 朱曉穎, 李洪力, 李真真. 慢性間歇低氧大鼠肺組織中 C/EBP 同源蛋白的表達變化及依達拉奉的干預作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(4): 327-330. doi: 10.7507/1671-6205.201809023 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是呼吸科的一種常見慢性疾病，也是一種常見的睡眠障礙性疾病[1-2]。OSAHS 患者特征性夜間反復低氧復氧，使人體處于慢性間歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）狀態，可引起全身多個臟器功能的嚴重損傷，如高血壓、冠心病、心律失常、腦血管意外、糖與脂類代謝紊亂及肺動脈高壓等[3-6]。但其具體發病機制尚不十分明確。因此，本研究通過建立 28 天間歇低氧大鼠模型，模擬 OSAHS 患者 CIH 狀態，觀察阻塞性睡眠呼吸暫停模式間歇低氧大鼠肺組織病理變化。此外，研究顯示在正常情況下 C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）在細胞中很少表達，但在缺氧條件下其表達會上調[7-10]。因此，本研究應用免疫組織化學方法檢測大鼠肺組織中 CHOP 蛋白，探討 CHOP 蛋白在間歇低氧大鼠肺組織的表達變化，以及依達拉奉的干預作用，為 OSAHS 對人體肺組織影響的發生機制及依達拉奉的干預作用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
采用隨機數字表法將 120 只成年雄性 Wistar 大鼠分成正常對照組（UC 組）、慢性間歇低氧組（CIH 組）、依達拉奉干預組（NE 組）和生理鹽水組（NS 組）。參照文獻[11]制備間歇低氧大鼠模型。每日上午 7 時，將 UC 組放置于與 CIH 組相同的有機玻璃飼養箱內，持續注入空氣 120 s，氧氣（O2）體積分數維持在 210 mL/L，控制流速壓力為 0.8 MPa。將 CIH 組置于有機玻璃飼養箱內，首先給予氮氣（N2）30 s 使 O2 體積分數低至 50 mL/L，流速壓力為 0.15 MPa，其次注入空氣 40 s 恢復 O2 體積分數至 210 mL/L，流速壓力控制在 0.8 MPa，然后繼續注入空氣 50 s 使 O2 體積分數維持在 210 mL/L，流速壓力為 0.8 MPa，使低氧箱內 O2 體積分數在 50～210 mL/L 之間形成周期交替，每 120 s 為 1 個循環周期，造成間歇低氧環境；NE 組和 NS 組除暴露于同上的 CIH 組環境外，NE 組每日給予依達拉奉（3 mg/kg）尾靜脈注射；NS 組每日給予等量生理鹽水注射。各組大鼠生活條件及飼養條件相同。各組分別在建立模型的第 3、7、14、21、28 d 處死大鼠。本實驗經本院實驗動物倫理委員會批準（LX2018151）。
1.2 方法
各組大鼠均經腹腔麻醉后開胸，生理鹽水快速將心、肺血管沖洗干凈，取出雙肺，將左側肺浸入 4% 多聚甲醛中固定，隨后進行石蠟包埋、切片，用于蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及免疫組織化學法染色。固定包埋后肺組織切片，再經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、HE 染色，逐步染色后光鏡下觀察肺組織病理形態變化。
采用免疫組織化學法檢測大鼠肺組織中 CHOP 的表達，光學顯微鏡下觀察細胞胞漿呈棕黃色或淺黃色為陽性細胞，提示 CHOP 蛋白的表達。各組大鼠隨機抽取 3 張切片，按照免疫組織化學法試劑盒說明書進行操作。運用 Motic 醫學圖像分析系統對結果進行分析，以每張切片的積分光密度（integral optical density，IOD）值代表蛋白相對表達水平，檢測 IOD 值，并做好統計。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 16.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示，同一組間及同一時間點多組間比較采用單因素方差分析，經檢驗有統計學意義后用最小顯著差異法進行兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠肺組織形態變化
UC 組大鼠肺組織未見明顯病理改變。CIH 組、NE 組、NS 組大鼠肺組織上皮細胞出現明顯水腫、充血，肺泡間隔增寬，局部可見炎性細胞浸潤；且隨間歇低氧時間延長，肺組織損傷呈加重趨勢。但 NE 組大鼠肺組織損傷程度明顯輕于 CIH 組及 NS 組。結果見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理學檢查像（HE×400）
a. UC 組；b. CIH 組；c. NE 組；d. NS 組。UC 組大鼠肺組織未見明顯病理改變；CIH 組、NE 組、NS 組大鼠肺組織上皮細胞出現水腫、充血，肺泡間隔增寬，局部可見炎性細胞浸潤；NE 組大鼠肺組織損傷程度輕于 CIH 組及 NS 組
2.2 大鼠肺組織 CHOP 蛋白表達
免疫組織化學染色結果顯示 UC 組肺泡上皮細胞僅見少數陽性細胞表達，而 CIH 組、NE 組、NS 組大鼠肺泡上皮細胞陽性細胞增多，且隨時間延長，陽性細胞表達增多；NE 組陽性細胞的表達低于 CIH 組及 NS 組。圖像分析結果顯示，與 UC 組比較，CIH 組 CHOP 蛋白 IOD 值升高（P<0.05）；與 CIH 組比較，NE 組 CHOP 蛋白 IOD 值降低（P<0.05）；NS 組與 CIH 組比較 CHOP 蛋白 IOD 值無明顯變化（P>0.05）；隨時間歇低氧時間的延長，大鼠肺組織中 CHOP 的表達逐漸增多。結果見圖 2 和表 1。
圖2
各組大鼠肺組織 CHOP 蛋白表達（免疫組織化學×400）
a. UC 組；b. CIH 組；c. NE 組；d. NS 組。UC 組肺泡上皮細胞僅見少數陽性細胞表達；CIH 組、NE 組、NS 組大鼠肺泡上皮細胞陽性細胞明顯增多；NE 組陽性細胞的表達明顯低于 CIH 組及 NS 組
表1
各組大鼠肺組織 CHOP 蛋白 IOD 值比較（n=6，
）
3 討論
OSAHS 是最常見的睡眠呼吸疾病，由于反復發作的夜間間歇性缺氧和睡眠結構破壞，引起一系列靶器官功能受損，導致 OSAHS 患者生活質量受到嚴重影響。隨著國內外學者對 OSAHS 不斷深入研究，發現 OSAHS 對呼吸系統同樣存在損傷作用，但其具體發病機制及病理改變尚不十分清楚。為進一探討 OSAHS 對肺組織損傷的影響及可能的機制，本研究建立了模擬 OSAHS 患者夜間低氧狀態的大鼠模型。結果顯示，CIH 組大鼠肺組織出現明顯病理形態異常變化，并且隨低氧時間延長肺組織病理形態改變逐漸加重，說明 CIH 確實可導致大鼠肺組織損傷，提示 CIH 可能是 OSAHS 患者出現肺組織損傷的因素之一。
眾所周知，內質網是真核細胞中非常重要的細胞器，當內質網遭受持續性外界刺激時就可以導致內質網應激反應的發生，從而進一步參與多種疾病的發生、發展，如代謝性疾病、腎臟疾病、腦認知障礙性疾病等[12-14]。參與內質網應激發生的已知外界刺激包括鈣超負荷、ATP 缺乏、缺氧等。然而在諸多誘導內質網應激發生的外界因素當中，缺氧是最常見也是最重要的因素之一[15]。CHOP 為內質網應激的標志性蛋白[16-17]，也是參與細胞凋亡的重要蛋白，因此當內質網應激發生時，CHOP 蛋白的表達增強，進一步導致細胞損傷。本研究應用免疫組織化學法檢測大鼠肺組織中 CHOP 蛋白的表達，結果顯示 UC 組大鼠肺組織中僅見少量 CHOP 蛋白表達，而 CIH 組大鼠肺組織 CHOP 蛋白表達明顯增多；且隨著間歇低氧時間的延長，CHOP 蛋白的表達增多。以上結果說明 CIH 可導致大鼠肺組織 CHOP 表達增多，提示 CHOP 蛋白的表達對 CIH 大鼠肺組織損傷起到一定作用。
作為氧自由基有效清除劑，依達拉奉目前已廣泛應用于臨床[18]。其對呼吸系統疾病，如肺部缺血再灌注損傷、急性肺損傷等均有一定的肺組織保護作用[19-20]，但依達拉奉對 CIH 肺組織損傷的保護作用及其機制少有報道。本研究結果顯示，UC 組大鼠肺組織未見明顯病理形態改變；CIH 組、NE 組及 NS 組大鼠肺組織均出現肺泡間隔增寬、水腫、結構破壞，少量炎性細胞浸潤表現等異常改變；NE 組與 CIH 組及 NS 組比較，其病理形態改變程度相對較輕。進一步檢測大鼠肺組織 CHOP 表達情況，UC 組僅見少量陽性細胞表達，CIH 組、NE 組及 NS 組大鼠肺組織陽性細胞數量明顯增多；圖像分析結果發現 NE 組與 CIH 組及 NS 組比較，CHOP 蛋白的表達明顯降低；且隨時間歇低氧時間的延長，大鼠肺組織中 CHOP 的表達逐漸增多。以上實驗結果說明依達拉奉對 CIH 大鼠肺組織損傷起到一定保護作用，且依達拉奉可能通過抑制 CHOP 蛋白的表達發揮其對肺組織的保護作用。
綜上所述，CIH 大鼠肺組織中 CHOP 蛋白表達增強，CHOP 蛋白的高表達對 CIH 大鼠并發肺組織損傷起到一定作用，依達拉奉可能通過抑制 CHOP 的表達對 CIH 大鼠肺組織起到一定保護作用。但動物實驗不能完全代表人體實際病理生理過程，28 d 的間歇低氧與臨床多年的 OSAHS 有顯著區別。因此，本研究只為 OSAHS 合并肺組織損傷發生機制及依達拉奉的干預作用提供動物實驗依據，為以后的研究打下基礎。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是呼吸科的一種常見慢性疾病，也是一種常見的睡眠障礙性疾病[1-2]。OSAHS 患者特征性夜間反復低氧復氧，使人體處于慢性間歇低氧（chronic intermittent hypoxia，CIH）狀態，可引起全身多個臟器功能的嚴重損傷，如高血壓、冠心病、心律失常、腦血管意外、糖與脂類代謝紊亂及肺動脈高壓等[3-6]。但其具體發病機制尚不十分明確。因此，本研究通過建立 28 天間歇低氧大鼠模型，模擬 OSAHS 患者 CIH 狀態，觀察阻塞性睡眠呼吸暫停模式間歇低氧大鼠肺組織病理變化。此外，研究顯示在正常情況下 C/EBP 同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）在細胞中很少表達，但在缺氧條件下其表達會上調[7-10]。因此，本研究應用免疫組織化學方法檢測大鼠肺組織中 CHOP 蛋白，探討 CHOP 蛋白在間歇低氧大鼠肺組織的表達變化，以及依達拉奉的干預作用，為 OSAHS 對人體肺組織影響的發生機制及依達拉奉的干預作用提供實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
采用隨機數字表法將 120 只成年雄性 Wistar 大鼠分成正常對照組（UC 組）、慢性間歇低氧組（CIH 組）、依達拉奉干預組（NE 組）和生理鹽水組（NS 組）。參照文獻[11]制備間歇低氧大鼠模型。每日上午 7 時，將 UC 組放置于與 CIH 組相同的有機玻璃飼養箱內，持續注入空氣 120 s，氧氣（O2）體積分數維持在 210 mL/L，控制流速壓力為 0.8 MPa。將 CIH 組置于有機玻璃飼養箱內，首先給予氮氣（N2）30 s 使 O2 體積分數低至 50 mL/L，流速壓力為 0.15 MPa，其次注入空氣 40 s 恢復 O2 體積分數至 210 mL/L，流速壓力控制在 0.8 MPa，然后繼續注入空氣 50 s 使 O2 體積分數維持在 210 mL/L，流速壓力為 0.8 MPa，使低氧箱內 O2 體積分數在 50～210 mL/L 之間形成周期交替，每 120 s 為 1 個循環周期，造成間歇低氧環境；NE 組和 NS 組除暴露于同上的 CIH 組環境外，NE 組每日給予依達拉奉（3 mg/kg）尾靜脈注射；NS 組每日給予等量生理鹽水注射。各組大鼠生活條件及飼養條件相同。各組分別在建立模型的第 3、7、14、21、28 d 處死大鼠。本實驗經本院實驗動物倫理委員會批準（LX2018151）。
1.2 方法
各組大鼠均經腹腔麻醉后開胸，生理鹽水快速將心、肺血管沖洗干凈，取出雙肺，將左側肺浸入 4% 多聚甲醛中固定，隨后進行石蠟包埋、切片，用于蘇木精–伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及免疫組織化學法染色。固定包埋后肺組織切片，再經二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水、HE 染色，逐步染色后光鏡下觀察肺組織病理形態變化。
采用免疫組織化學法檢測大鼠肺組織中 CHOP 的表達，光學顯微鏡下觀察細胞胞漿呈棕黃色或淺黃色為陽性細胞，提示 CHOP 蛋白的表達。各組大鼠隨機抽取 3 張切片，按照免疫組織化學法試劑盒說明書進行操作。運用 Motic 醫學圖像分析系統對結果進行分析，以每張切片的積分光密度（integral optical density，IOD）值代表蛋白相對表達水平，檢測 IOD 值，并做好統計。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 16.0 統計軟件。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，同一組間及同一時間點多組間比較采用單因素方差分析，經檢驗有統計學意義后用最小顯著差異法進行兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠肺組織形態變化
UC 組大鼠肺組織未見明顯病理改變。CIH 組、NE 組、NS 組大鼠肺組織上皮細胞出現明顯水腫、充血，肺泡間隔增寬，局部可見炎性細胞浸潤；且隨間歇低氧時間延長，肺組織損傷呈加重趨勢。但 NE 組大鼠肺組織損傷程度明顯輕于 CIH 組及 NS 組。結果見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理學檢查像（HE×400）
a. UC 組；b. CIH 組；c. NE 組；d. NS 組。UC 組大鼠肺組織未見明顯病理改變；CIH 組、NE 組、NS 組大鼠肺組織上皮細胞出現水腫、充血，肺泡間隔增寬，局部可見炎性細胞浸潤；NE 組大鼠肺組織損傷程度輕于 CIH 組及 NS 組
2.2 大鼠肺組織 CHOP 蛋白表達
免疫組織化學染色結果顯示 UC 組肺泡上皮細胞僅見少數陽性細胞表達，而 CIH 組、NE 組、NS 組大鼠肺泡上皮細胞陽性細胞增多，且隨時間延長，陽性細胞表達增多；NE 組陽性細胞的表達低于 CIH 組及 NS 組。圖像分析結果顯示，與 UC 組比較，CIH 組 CHOP 蛋白 IOD 值升高（P<0.05）；與 CIH 組比較，NE 組 CHOP 蛋白 IOD 值降低（P<0.05）；NS 組與 CIH 組比較 CHOP 蛋白 IOD 值無明顯變化（P>0.05）；隨時間歇低氧時間的延長，大鼠肺組織中 CHOP 的表達逐漸增多。結果見圖 2 和表 1。
圖2
各組大鼠肺組織 CHOP 蛋白表達（免疫組織化學×400）
a. UC 組；b. CIH 組；c. NE 組；d. NS 組。UC 組肺泡上皮細胞僅見少數陽性細胞表達；CIH 組、NE 組、NS 組大鼠肺泡上皮細胞陽性細胞明顯增多；NE 組陽性細胞的表達明顯低于 CIH 組及 NS 組
表1
各組大鼠肺組織 CHOP 蛋白 IOD 值比較（n=6，）
3 討論
OSAHS 是最常見的睡眠呼吸疾病，由于反復發作的夜間間歇性缺氧和睡眠結構破壞，引起一系列靶器官功能受損，導致 OSAHS 患者生活質量受到嚴重影響。隨著國內外學者對 OSAHS 不斷深入研究，發現 OSAHS 對呼吸系統同樣存在損傷作用，但其具體發病機制及病理改變尚不十分清楚。為進一探討 OSAHS 對肺組織損傷的影響及可能的機制，本研究建立了模擬 OSAHS 患者夜間低氧狀態的大鼠模型。結果顯示，CIH 組大鼠肺組織出現明顯病理形態異常變化，并且隨低氧時間延長肺組織病理形態改變逐漸加重，說明 CIH 確實可導致大鼠肺組織損傷，提示 CIH 可能是 OSAHS 患者出現肺組織損傷的因素之一。
眾所周知，內質網是真核細胞中非常重要的細胞器，當內質網遭受持續性外界刺激時就可以導致內質網應激反應的發生，從而進一步參與多種疾病的發生、發展，如代謝性疾病、腎臟疾病、腦認知障礙性疾病等[12-14]。參與內質網應激發生的已知外界刺激包括鈣超負荷、ATP 缺乏、缺氧等。然而在諸多誘導內質網應激發生的外界因素當中，缺氧是最常見也是最重要的因素之一[15]。CHOP 為內質網應激的標志性蛋白[16-17]，也是參與細胞凋亡的重要蛋白，因此當內質網應激發生時，CHOP 蛋白的表達增強，進一步導致細胞損傷。本研究應用免疫組織化學法檢測大鼠肺組織中 CHOP 蛋白的表達，結果顯示 UC 組大鼠肺組織中僅見少量 CHOP 蛋白表達，而 CIH 組大鼠肺組織 CHOP 蛋白表達明顯增多；且隨著間歇低氧時間的延長，CHOP 蛋白的表達增多。以上結果說明 CIH 可導致大鼠肺組織 CHOP 表達增多，提示 CHOP 蛋白的表達對 CIH 大鼠肺組織損傷起到一定作用。
作為氧自由基有效清除劑，依達拉奉目前已廣泛應用于臨床[18]。其對呼吸系統疾病，如肺部缺血再灌注損傷、急性肺損傷等均有一定的肺組織保護作用[19-20]，但依達拉奉對 CIH 肺組織損傷的保護作用及其機制少有報道。本研究結果顯示，UC 組大鼠肺組織未見明顯病理形態改變；CIH 組、NE 組及 NS 組大鼠肺組織均出現肺泡間隔增寬、水腫、結構破壞，少量炎性細胞浸潤表現等異常改變；NE 組與 CIH 組及 NS 組比較，其病理形態改變程度相對較輕。進一步檢測大鼠肺組織 CHOP 表達情況，UC 組僅見少量陽性細胞表達，CIH 組、NE 組及 NS 組大鼠肺組織陽性細胞數量明顯增多；圖像分析結果發現 NE 組與 CIH 組及 NS 組比較，CHOP 蛋白的表達明顯降低；且隨時間歇低氧時間的延長，大鼠肺組織中 CHOP 的表達逐漸增多。以上實驗結果說明依達拉奉對 CIH 大鼠肺組織損傷起到一定保護作用，且依達拉奉可能通過抑制 CHOP 蛋白的表達發揮其對肺組織的保護作用。
綜上所述，CIH 大鼠肺組織中 CHOP 蛋白表達增強，CHOP 蛋白的高表達對 CIH 大鼠并發肺組織損傷起到一定作用，依達拉奉可能通過抑制 CHOP 的表達對 CIH 大鼠肺組織起到一定保護作用。但動物實驗不能完全代表人體實際病理生理過程，28 d 的間歇低氧與臨床多年的 OSAHS 有顯著區別。因此，本研究只為 OSAHS 合并肺組織損傷發生機制及依達拉奉的干預作用提供動物實驗依據，為以后的研究打下基礎。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
