引用本文： 李麗芳, 原新慧, 凌繼祖, 段艷妮, 余勤. 間歇低氧導致大鼠腎臟損傷以及依達拉奉的干預作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(4): 331-338. doi: 10.7507/1671-6205.201808036 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是臨床較常見的一種嚴重影響公眾健康的睡眠呼吸障礙性疾病。中重度 OSAHS 在女性中患病率為 23.4%，在男性中為 49.7%[1]，呈逐年上升的趨勢。其夜間反復低氧復氧的特征，類似于缺血再灌注損傷，而腎臟是一個高灌注高血流量臟器，易發生缺血缺氧性損傷。研究表明間歇低氧（intermittent hypoxia，IH）使機體處于氧化應激狀態，可參與腎臟早期損傷的發生、發展過程[2]。腎損傷分子-1（kidney injury molecule 1，KIM-1）是在研究大鼠腎臟缺血再灌注損傷基因再生修復的過程中發現的，主要表達于近端腎小管上皮細胞的Ⅰ型跨膜蛋白[3]。KIM-1 在正常生理條件下表達較少，當腎小管受到缺血缺氧性損傷時表達增多[4-5]，可作為早期診斷急性腎損傷引起腎小管損傷的敏感性和特異性標志物[6-8]。但關于 KIM-1 在 OSAHS 并發腎臟損傷方面的研究尚少。依達拉奉是目前臨床應用較廣泛的自由基清除劑，具有消除自由基、抑制脂質過氧化的作用，可抑制腦細胞的過氧化，減輕腦缺血引起的腦水腫及組織損傷[9]。研究認為依達拉奉除可清除氧自由基堆積外，亦可對細胞凋亡具有重要意義，但其廣泛應用于腦血管疾病，對腎臟損傷方面研究較少。本研究擬使用 Wistar 大鼠建立 IH 模型，在周期性缺氧和復氧以及依達拉奉干預條件下，通過光鏡、電鏡及免疫組織化學觀察大鼠腎臟損傷情況，采用化學法檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和抑制羥自由基能力等指標，觀察大鼠腎臟是否處于氧化應激狀態，并采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）觀察凋亡調控因子 Bcl-2、Caspase-3、Bax 在 mRNA 水平上表達情況，探討其在 IH 并發腎臟損害機制過程中的作用。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與儀器
1.1.1 實驗動物
清潔級健康雄性 Wistar 大鼠 80 只，3 周，體重（110±10）g，購于蘭州大學基礎醫學院實驗動物中心，基礎飼料購于北京科澳協力飼料有限公司，實驗前于安靜環境、自然光照、溫度 16～21 ℃、日溫差≤8 ℃、濕度 40%～55% 條件下適應性喂養 1 周。
1.1.2 實驗主要試劑
生物素-鏈酶卵白素免疫組織化學檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），KIM-1 抗體（北京博奧森生物技術有限公司），依達拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司），MDA 測試盒、羥自由基測定試劑盒、SOD 測定試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（南京建成科技有限公司），逆轉錄反應試劑盒（Takara 公司），SYBR?PremixExTaqTMⅡ（寶生物工程（大連）有限公司）。
1.1.3 實驗主要儀器
密閉式大鼠飼養籠（上海雨晨生物技術有限公司），電磁式空氣壓縮機（浙江森森實業公司），數顯時間繼電器（上海一開集團日科電氣公司），電磁閥（浙江德力西電氣股份有限公司），氣體減壓閥（上海沃原自控閥門有限公司），氣體流量計（安徽桐城有機玻璃儀器有限公司），CY-12C 測氧儀（建德市梅城電化學分析儀器廠），醫用氧氣（濃度>99.5%）（蘭州方圓建化公司），氮氣（濃度>99.9%）（蘭州市城關區光華物資供應站）。
1.2 方法
1.2.1 動物分組
實驗前 1 d 將實驗動物稱重并用傳統標記法標記后，采用隨機數字表法將 80 只大鼠分為正常對照組（NC 組）、間歇低氧組（IH）、間歇低氧+依達拉奉組（IH+NE 組）、間歇低氧+生理鹽水組（IH+NS 組），每組各 20 只。
1.2.2 模型制備
依據文獻[2, 10-12]的方法設計 IH 大鼠模型，IH 程序設定為低氧和復氧交替循環，每一循環周期為 120 s，即 40 s 低氧期和 80 s 復氧期，每小時循環周期為 30 次。首先為 40 s 低氧期，前 30 s 向模擬艙內輸入純氮氣，使模擬艙內氧濃度由 21% 逐漸降至 6%～7%，后 10 s 為靜息期，無氣體輸入，維持艙內氧濃度穩定于 6%～7%，形成低氧暴露；低氧期結束后進入 80 s 復氧期，向模擬艙內輸入純氧氣 20 s，待艙內氧濃度逐漸升高至 21%，持續輸入 60 s 壓縮空氣，使艙內氧濃度維持在 21%，形成常氧環境，如此循環。常氧程序設定為向動物飼養艙內間歇輸入正常空氣，輸入時間及流量同 IH 程序。各艙內氧濃度由 CY-12C 測氧儀實時監控。NC 組持續處于常氧環境，無低氧干預。IH 組、IH+NE 組及 IH+NS 組每天給予 8 h 低氧暴露。IH+NE 組每天于實驗開始前測量大鼠體重，給予依達拉奉溶液經腹腔注射進行干預。依據文獻[13-14]的方法，應用 5 mg/kg 劑量的依達拉奉對減輕脂質過氧化、提高機體內源性抗氧化能力、改善腎功能療效最好，故本實驗依達拉奉的劑量為 5 mg/kg。IH+NS 組給予等量生理鹽水經腹腔注射進行平衡對照，腹腔注射后觀察有無明顯不良反應后開始通氣造模。時間為每日 9 時至 17 時，持續 4 周，此過程中無實驗動物死亡。本實驗設計符合蘭州大學第一醫院動物實驗倫理學標準。
1.2.3 組織處理與標本采集
造模 4 周后，將大鼠禁食水 8 h，進行腹腔麻醉（10% 水合氯醛 3 mL/kg），每組隨機抽取 6 只大鼠進行麻醉，真空采血管采取主動脈血約 6 mL 送蘭州大學第一醫院檢驗科。使用全自動生化分析儀檢測尿素氮、血肌酐等指標。取血后，打開腹腔，用冰鹽水經主動脈反復灌洗腎臟至顏色蒼白后，快速暴露大鼠左右腎臟組織并取出，在冰板上去除包膜，取左腎置于 3% 的多聚甲醛溶液中固定用于蘇木精–伊紅染色和免疫組織化學檢測，取右腎腎皮質置于 2.5% 戊二醛溶液中固定用于電鏡觀察。同樣方法采取各組剩余大鼠腎臟組織并置于預先標記好的凍存管中，經液氮速凍后保存于–80 ℃ 冰箱中，用于檢測氧化應激指標 SOD、MDA、羥自由基及凋亡調控因子 Bcl-2、Caspase-3、Bax。
1.2.4 各組大鼠腎臟組織蘇木精–伊紅染色
取出 3% 多聚甲醛固定的腎臟組織，經脫水（70% 乙醇過夜，共 12 h；80% 乙醇 1 h；95% 乙醇Ⅰ、95% 乙醇Ⅱ各 1 h；無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各 40 min）、透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各 15 min）、浸蠟（浸蠟Ⅰ、浸蠟Ⅱ各 1 h）、包埋、切片（厚度約 4 μm）、裱片、攤片、烤片（恒溫箱 100 ℃ 約 60 min）、蘇木精–伊紅染色（切片常規脫蠟至水、蘇木精中浸泡 4 min、1% 鹽酸酒精中分化 2～3 s，返藍 5 min、伊紅溶液中浸泡 30 s、常規梯度脫水）、透明、封片。鏡下觀察并攝片，取各組 8 張標本片在光學顯微鏡下以相同倍數（×400）分別選取不同部位攝片。
1.2.5 各組大鼠腎臟組織透射電鏡觀察
取出 2.5% 戊二醛固定的腎臟組織，切成 1 mm×1 mm×1 mm 組織塊，1% 鋨酸固定液固定，磷酸緩沖液沖洗，酒精逐級脫水，環氧樹脂浸透、包埋、聚合，切片機切片，制成 1～10 μm 的薄片切片，再用甲胺苯藍染色，再次切片，制成厚度為 60～80 nm 的超薄切片，經醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色后，在透射電子顯微鏡下觀察。
1.2.6 免疫組織化學檢測各組大鼠腎臟組織 KIM-1 蛋白表達
將制作好的腎臟組織蠟塊用石蠟切片機切成約 4 μm 厚的石蠟切片，固定于多聚賴氨酸玻片上，進行烤片（恒溫箱 60 ℃ 約 60 min），常規脫蠟脫水，0.01 mol/L PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，每張切片均勻滴加 3% 過氧化氫溶液，以消除內源性過氧化物酶活性，0.01 mol/L PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，現配 pH 6.0 的檸檬酸抗原修復液進行高壓鍋抗原修復，0.01 mol/L PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，分別滴加封閉用正常山羊血清工作液，15 min 后傾去，勿洗，分別滴加兔抗大鼠 KIM-1 抗體（1∶100 PBS 稀釋），陰性對照組加入正常鼠血清。4 ℃ 冰箱過夜，約 17 h。PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，分別加入二抗（生物素標記山羊抗兔 IgG 工作液），37 ℃ 恒溫箱孵育 15 min 后取出，PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，分別加入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37 ℃ 恒溫箱孵育 15 min 后取出，PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，用二氨基聯苯胺顯色。顯色 1 min 后，在光鏡下觀察，形成紅色反應物后即用蒸餾水充分沖洗終止反應，蘇木精復染，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。光學顯微鏡下觀察并采集圖片。用圖像分析系統（Image-Pro Plus 6.0）測量平均灰度值并分析。
1.2.7 實時熒光定量 PCR 法測定各組大鼠腎臟組織中 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 表達
（1）總 RNA 提取與逆轉錄：從–80 ℃ 低溫冰箱中取出腎臟組織，迅速用 Trizol 試劑進行研磨，依次加入氯仿、異丙醇、乙醇抽提總 RNA，并檢測總 RNA 濃度和純度，使波長 260 nm 和 280 nm 下吸光度比值在 1.7～2.0 視為純度高。根據 Takara 試劑盒方法合成 cDNA。所得 cDNA 保存于–20 ℃ 用于 PCR 擴增。（2）PCR 擴增：Bcl-2、Caspase-3、Bax、內參照 β-actin 引物用 DNA Club 軟件設計，由寶生物工程有限公司合成，序列如下：Bcl-2 上游引物 5′-GACTGAGTACCTGAACCGGCATC-3′，下游引物 5′-CTGAGCAGCGTCTTCAGAGACA-3′；Caspase-3 上游引物 5′-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3′，下游引物 5′-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3′；Bax 上游引物 5′-AGGACGCATCCACCAAGAAGC-3′，下游引物 5'-GGTTCTGATCAGCTCGGGGCA-3′；β-actin 上游引物 5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。反應體系：SYBR?PremixExTaqTMII（2×）6.25 μL，上下游引物各 0.5 μL，DNA 模板 1 μL，補足滅菌蒸餾水至 12.5 μL。使用 PCR 擴增儀進行擴增，擴增條件：第一步預變性（95 ℃ 下 30 s）；二步 PCR 反應（40 個循環，95 ℃ 下 5 s，60 ℃ 下 30 s）。分別得到擴增曲線、溶解曲線和待測樣本表達量，應用分析軟件 Rotor-Gene3000 判斷溶解曲線特異性及擴增曲線是否為陽性，采用 2?△△Ct相對定量分析法計算出各組 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 含量。
1.2.8 各組大鼠腎臟組織中 MDA 含量、抑制羥自由基能力和 SOD 活力的測定
MDA 含量檢測采用硫代巴比妥酸法，用 UV-1700 紫外可見分光光度計，在波長為 532 nm 處測定大鼠腎臟組織上清液吸光度值，然后根據試劑盒說明書的計算公式算出組織中 MDA 含量，結果以 nmol/mg prot 表示。抑制羥自由基能力采用最常見的 Fenton 反應，在波長 550 nm 處用可見分光光度計測定大鼠腎臟組織上清液吸光度值，運用公式計算得到抑制羥自由基能力，結果以 U/mg prot 表示。規定每毫克組織蛋白在 37 ℃ 下反應 1 min，使反應體系中 H2O2 的濃度降低 1 mmol/L 為一個抑制羥自由基能力單位。抑制羥自由基能力越高，則反映大鼠腎臟組織中羥自由基的含量越低。SOD 活力檢測采用 WST-1 法，用酶標儀在波長為 450 nm 處測定大鼠腎臟組織上清液吸光度值，然后依據試劑盒說明書的公式計算出組織中 SOD 活力，結果以 U/mg prot 表示。大鼠腎臟組織勻漿蛋白濃度采用 BCA 法測定。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。符合正態分布的數據以均數±標準差（
±s）表示，采用單因素方差分析，并做 LSD 法兩兩組間比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組大鼠腎臟組織血清中尿素氮、肌酐指標
四組間血尿素氮差異無統計學意義（P>0.05）。四組間血肌酐差異有統計學意義（P<0.01）。IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，差異均有統計學意義（P<0.01）；IH+NS 組與 IH 組相比，血肌酐差異無統計學意義（P>0.05）；IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1。
表1
各組大鼠各檢測指標結果（
，n=6）
2.2 各組大鼠腎臟組織病理變化
NC 組大鼠腎臟組織形態正常，未見明顯異常。IH 組大鼠腎臟組織可見大部分腎小管上皮細胞高度腫脹變性，結構紊亂，管腔狹窄以致消失等，以近曲腎小管為著，腎小球未見明顯異常。IH+NE 組大鼠腎臟組織可見小部分近曲腎小管上皮細胞水腫，腎小球未見明顯異常。IH+NS 組大鼠腎臟組織可見大部分腎小管上皮細胞腫脹，管腔狹窄，以及氣球樣改變等。結果見圖 1。
圖1
腎臟組織病理像（蘇木精–伊紅×400）
a. NC 組：腎小球、腎小管未見明顯異常；b. IH 組：腎小管上皮細胞高度腫脹變形，管腔變窄甚至消失；c. IH+NE 組：腎小管上皮細胞輕度水腫；d. IH+NS 組：腎小管上皮細胞高度腫脹變形，管腔變窄
2.3 各組大鼠腎臟組織中腎小管超微結構變化
IH 組、IH+NE 組和 IH+NS 組大鼠腎臟組織改變均以近曲小管為主，NC 組大鼠腎臟組織腎小球和腎小管上皮刷狀緣及細胞器均無明顯變化。IH 組和 IH+NS 組可見腎小管上皮刷狀緣變稀疏并大量脫落，細胞器溶解，腎小球未見明顯變化。IH+NE 組可見少量細胞器腫脹、線粒體疏松，未見腎小管上皮刷狀緣稀疏并脫落，腎小球未見明顯變化。結果見圖 2。
圖2
腎臟組織透射電鏡像
a. NC 組：腎小球、腎小管未見明顯異常；b. IH 組：腎小管上皮刷狀緣變稀疏并大量脫落，細胞器溶解；c. IH+NE 組：少量細胞器腫脹、線粒體疏松；d. IH+NS 組：腎小管上皮刷狀緣變稀疏并大量脫落，細胞器溶解
2.4 各組大鼠腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達
四組間腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達比較，差異有統計學意義（P<0.01）。IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。IH+NS 組與 IH 組相比，腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達差異無統計學意義（P>0.05）。IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達均降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1 和圖 3。
圖3
腎臟組織 KIM-1 蛋白免疫組織化學檢測病理像（×400）
a. NC 組：正常腎小球及腎小管極少量表達；b. IH 組：腎小球無表達，腎小管大量表達；c. IH+NE 組：腎小球無表達，腎小管少量表達；d. IH+NS 組：腎小球無表達，腎小管大量表達
2.5 IH 對大鼠腎臟組織中 MDA 含量、SOD 活力和抑制羥自由基能力的影響
四組間腎臟組織 MDA 含量和 SOD 活力比較，差異有統計學意義（P<0.01）。IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，MDA 含量均顯著升高而 SOD 活力均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。IH+NS 組與 IH 組相比，腎臟組織 MDA 含量和 SOD 活力差異均無統計學意義（P>0.05）。IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，MDA 含量均明顯降低而 SOD 活力均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1。
四組間腎臟組織抑制羥自由基能力比較，差異有統計學意義（P<0.01）。IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，腎臟組織抑制羥自由基能力均顯著降低，表明腎臟組織中羥自由基的含量高，差異均有統計學意義（P<0.01）；IH+NS 組與 IH 組相比，腎臟組織中抑制羥自由基能力差異無統計學意義（P>0.05）；IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，腎臟組織抑制羥自由基能力均明顯升高，表明腎臟組織中羥自由基的含量明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1。
2.6 實時熒光定量 PCR 檢測各組大鼠腎臟組織中 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 表達及 Bcl-2/ Bax 比值
IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，大鼠腎臟組織 Bcl-2 mRNA 表達減少，Caspase-3 和 Bax mRNA 表達增多，Bcl-2/Bax 比值降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。IH+NS 組與 IH 組相比，大鼠腎臟組織中 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 表達差異無統計學意義（P>0.05）。IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，大鼠腎臟組織 Bcl-2 mRNA 表達明顯上調，Caspase-3 和 Bax mRNA 表達明顯下調，Bcl-2/Bax 比值升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1。
3 討論
OSAHS 常累及全身多個系統并造成多器官損害，嚴重者甚至發生猝死，顯著降低了人們的生活質量。目前研究認為 IH 導致的氧化應激損傷是 OSAHS 靶器官損傷的主要機制，并且氧化應激可進一步介導炎癥反應、細胞凋亡等一系列損傷，因此研究抗氧化劑對 IH 動物模型保護機制是極其必要的。為此，我們通過建立 IH 大鼠模型來詳細研究 IH 是如何損害腎臟功能及其相關機制，以及通過依達拉奉干預來驗證是否可以改善腎臟損傷。
研究發現 IH 可導致大鼠腎臟組織細胞形態學發生顯著改變，主要表現在光鏡下腎小管上皮細胞高度腫脹變形，管腔變窄甚至消失，而腎小球未見明顯異常，經依達拉奉干預后上述癥狀均顯著改善。透射電鏡下發現 IH 可導致近曲腎小管上皮刷狀緣變稀疏并大量脫落，細胞器溶解，腎小球未見明顯變化；依達拉奉干預后可見少量細胞器腫脹、線粒體疏松，未見腎小管上皮刷狀緣稀疏并脫落。以上結果說明 IH 可損傷腎臟組織細胞，而依達拉奉干預后可減輕腎臟組織細胞損傷和變性。
既往研究表明血清胱蛋白酶抑制劑（cysaitin C）水平及尿系列酶活性是 OSAHS 患者中腎臟損傷的敏感指標[15-16]。由于腎損傷早期在 OSAHS 患者中比較隱匿，無明顯臨床表現，易導致診斷延誤，從而影響最佳治療時期。KIM-1 是主要表達于腎臟近曲腎小管上皮細胞的一種跨膜糖蛋白，在正常大鼠和人腎臟組織中表達量甚微，在腎臟缺血、缺氧性損傷后的早期可顯著表達于損傷后再生的近曲小管上皮中，是反映腎小管損傷的標志物之一[17-18]。因此，我們建立 IH 大鼠模型，研究腎臟 IH 過程中的病理變化特點，了解 KIM-1 能否作為早期診斷腎臟早期損傷的臨床敏感指標。結果發現 IH 組大鼠腎臟組織 KIM-1 蛋白水平較 NC 組明顯升高，經依達拉奉干預后明顯降低。這表明在腎臟損傷早期，腎組織表達 KIM-1 迅速升高，因此可作為腎臟早期損傷重要的生物學標志物。
氧自由基是指由氧衍生出來的自由基及其產物，包括過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子等，羥自由基被公認是生物系統中最具活性的活性氧物種，能導致生物體內 DNA、蛋白質和脂質氧化損傷。SOD 屬于金屬酶，主要作用是歧化氧自由基，及時清除機體生成的過量的自由基，以防止自由基對組織細胞產生毒害作用，從而保護細胞免受氧自由基的攻擊。SOD 活力可間接反映機體清除氧自由基的能力。自由基攻擊膜脂中的不飽和脂肪酸，使其發生氧化，脂質過氧化產物 MDA 就會升高。脂質過氧化是造成生物體氧化損傷的主要原因。通過測定體內 MDA 含量，可間接反映體內自由基對機體的損傷程度[19]。本研究結果顯示，IH 組和 IH+NS 組大鼠腎臟組織 SOD 活力顯著降低，MDA 含量顯著升高，抑制羥自由基能力降低即羥自由基的含量升高。說明 IH 時，腎臟組織羥自由基的增多，攻擊生物膜，因此脂質過氧化物生成增多；同時，自由基增多也加速細胞凋亡，為了清除過多的羥自由基，SOD 水平也下降。通過依達拉奉干預后 IH 組大鼠腎臟組織 SOD 活力顯著升高，MDA 含量和羥自由基的含量均明顯降低。這說明依達拉奉可以降低自由基，提高腎臟組織的抗氧化能力，對細胞具有保護作用。
細胞凋亡由基因控制的細胞主動的、受到嚴密調控的死亡過程。Bcl-2、Bax 是重要的凋亡調節相關基因。Bcl-2 是第一個被確認有抑制凋亡作用的基因，主要通過羧基端的信號錨定序列跨線粒體膜而發揮作用，在線粒體上可直接調節膜上通透性轉換孔來調節線粒體膜的通透性，以阻止細胞色素 C 釋放入胞質而抑制細胞凋亡[20-23]。Bax 基因是近年來新發現的一種凋亡促進基因，屬 Bcl-2 同一家族基因，活化的 Bax 主要使線粒體和脂質體通透性增加，啟動凋亡信號，具有促凋亡作用[24-25]。相對于 Bax，Bcl-2 含量相對較多時發揮抗凋亡作用，當 Bax 含量相對較多時則表現為凋亡作用增強。因此，細胞是否通過此途徑導致凋亡，取決于 Bcl-2 與 Bax 的比值變化。本研究發現，經 IH 處理后，大鼠腎臟組織 Bcl-2 mRNA 表達減少，Bax mRNA 表達增多，Bcl-2/Bax 比值降低；而經過依達拉奉干預后，大鼠腎臟組織 Bcl-2 mRNA 表達明顯上調，Bax mRNA 表達明顯下調，Bcl-2/Bax 比值升高。Caspase-3 是細胞凋亡過程的最終執行者，它的激活可直接導致細胞發生凋亡。Caspase-3 的激活因素主要包括缺氧、缺血、氧自由基、鈣超載等，當以上這些因素刺激線粒體時，引起細胞色素 C 從線粒體膜釋放到胞質中，導致 Caspase-9 的活化，進而激活 Caspase-3，導致細胞凋亡開始[26-27]。本研究 PCR 結果發現 IH+NE 組大鼠腎臟組織中 Caspase-3 mRNA 表達量明顯低于 IH 組，這說明 Caspase-3 的上游環節受到抑制。因此，IH 后大鼠腎臟組織處于凋亡高水平狀態，而依達拉奉可在一定程度上改善這種狀態，這表明依達拉奉可能通過調控 Bcl-2/Bax 比值及 Caspase-3 途徑而實現抗細胞凋亡作用。
綜上，IH 可通過氧化應激和調控 Bcl-2、Caspase-3、Bax 等凋亡調控因子導致腎臟損傷。此外，IH 可以使腎小管上皮細胞 KIM-1 的表達量增加，KIM-1 可作為評估腎臟早期損傷的較敏感及特異性的標志物。經依達拉奉干預后腎臟損傷均在一定程度上有所改善，故依達拉奉可能通過清除氧自由基、提高抗氧化能力、調控 Bcl-2/Bax 及 Caspase-3 介導的細胞凋亡，從而抵抗 IH 所致腎臟損傷。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndrome，OSAHS）是臨床較常見的一種嚴重影響公眾健康的睡眠呼吸障礙性疾病。中重度 OSAHS 在女性中患病率為 23.4%，在男性中為 49.7%[1]，呈逐年上升的趨勢。其夜間反復低氧復氧的特征，類似于缺血再灌注損傷，而腎臟是一個高灌注高血流量臟器，易發生缺血缺氧性損傷。研究表明間歇低氧（intermittent hypoxia，IH）使機體處于氧化應激狀態，可參與腎臟早期損傷的發生、發展過程[2]。腎損傷分子-1（kidney injury molecule 1，KIM-1）是在研究大鼠腎臟缺血再灌注損傷基因再生修復的過程中發現的，主要表達于近端腎小管上皮細胞的Ⅰ型跨膜蛋白[3]。KIM-1 在正常生理條件下表達較少，當腎小管受到缺血缺氧性損傷時表達增多[4-5]，可作為早期診斷急性腎損傷引起腎小管損傷的敏感性和特異性標志物[6-8]。但關于 KIM-1 在 OSAHS 并發腎臟損傷方面的研究尚少。依達拉奉是目前臨床應用較廣泛的自由基清除劑，具有消除自由基、抑制脂質過氧化的作用，可抑制腦細胞的過氧化，減輕腦缺血引起的腦水腫及組織損傷[9]。研究認為依達拉奉除可清除氧自由基堆積外，亦可對細胞凋亡具有重要意義，但其廣泛應用于腦血管疾病，對腎臟損傷方面研究較少。本研究擬使用 Wistar 大鼠建立 IH 模型，在周期性缺氧和復氧以及依達拉奉干預條件下，通過光鏡、電鏡及免疫組織化學觀察大鼠腎臟損傷情況，采用化學法檢測丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力和抑制羥自由基能力等指標，觀察大鼠腎臟是否處于氧化應激狀態，并采用聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）觀察凋亡調控因子 Bcl-2、Caspase-3、Bax 在 mRNA 水平上表達情況，探討其在 IH 并發腎臟損害機制過程中的作用。
1 材料與方法
1.1 材料、試劑與儀器
1.1.1 實驗動物
清潔級健康雄性 Wistar 大鼠 80 只，3 周，體重（110±10）g，購于蘭州大學基礎醫學院實驗動物中心，基礎飼料購于北京科澳協力飼料有限公司，實驗前于安靜環境、自然光照、溫度 16～21 ℃、日溫差≤8 ℃、濕度 40%～55% 條件下適應性喂養 1 周。
1.1.2 實驗主要試劑
生物素-鏈酶卵白素免疫組織化學檢測試劑盒（北京中杉金橋生物技術有限公司），KIM-1 抗體（北京博奧森生物技術有限公司），依達拉奉注射液（南京先聲東元制藥有限公司），MDA 測試盒、羥自由基測定試劑盒、SOD 測定試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（南京建成科技有限公司），逆轉錄反應試劑盒（Takara 公司），SYBR?PremixExTaqTMⅡ（寶生物工程（大連）有限公司）。
1.1.3 實驗主要儀器
密閉式大鼠飼養籠（上海雨晨生物技術有限公司），電磁式空氣壓縮機（浙江森森實業公司），數顯時間繼電器（上海一開集團日科電氣公司），電磁閥（浙江德力西電氣股份有限公司），氣體減壓閥（上海沃原自控閥門有限公司），氣體流量計（安徽桐城有機玻璃儀器有限公司），CY-12C 測氧儀（建德市梅城電化學分析儀器廠），醫用氧氣（濃度>99.5%）（蘭州方圓建化公司），氮氣（濃度>99.9%）（蘭州市城關區光華物資供應站）。
1.2 方法
1.2.1 動物分組
實驗前 1 d 將實驗動物稱重并用傳統標記法標記后，采用隨機數字表法將 80 只大鼠分為正常對照組（NC 組）、間歇低氧組（IH）、間歇低氧+依達拉奉組（IH+NE 組）、間歇低氧+生理鹽水組（IH+NS 組），每組各 20 只。
1.2.2 模型制備
依據文獻[2, 10-12]的方法設計 IH 大鼠模型，IH 程序設定為低氧和復氧交替循環，每一循環周期為 120 s，即 40 s 低氧期和 80 s 復氧期，每小時循環周期為 30 次。首先為 40 s 低氧期，前 30 s 向模擬艙內輸入純氮氣，使模擬艙內氧濃度由 21% 逐漸降至 6%～7%，后 10 s 為靜息期，無氣體輸入，維持艙內氧濃度穩定于 6%～7%，形成低氧暴露；低氧期結束后進入 80 s 復氧期，向模擬艙內輸入純氧氣 20 s，待艙內氧濃度逐漸升高至 21%，持續輸入 60 s 壓縮空氣，使艙內氧濃度維持在 21%，形成常氧環境，如此循環。常氧程序設定為向動物飼養艙內間歇輸入正常空氣，輸入時間及流量同 IH 程序。各艙內氧濃度由 CY-12C 測氧儀實時監控。NC 組持續處于常氧環境，無低氧干預。IH 組、IH+NE 組及 IH+NS 組每天給予 8 h 低氧暴露。IH+NE 組每天于實驗開始前測量大鼠體重，給予依達拉奉溶液經腹腔注射進行干預。依據文獻[13-14]的方法，應用 5 mg/kg 劑量的依達拉奉對減輕脂質過氧化、提高機體內源性抗氧化能力、改善腎功能療效最好，故本實驗依達拉奉的劑量為 5 mg/kg。IH+NS 組給予等量生理鹽水經腹腔注射進行平衡對照，腹腔注射后觀察有無明顯不良反應后開始通氣造模。時間為每日 9 時至 17 時，持續 4 周，此過程中無實驗動物死亡。本實驗設計符合蘭州大學第一醫院動物實驗倫理學標準。
1.2.3 組織處理與標本采集
造模 4 周后，將大鼠禁食水 8 h，進行腹腔麻醉（10% 水合氯醛 3 mL/kg），每組隨機抽取 6 只大鼠進行麻醉，真空采血管采取主動脈血約 6 mL 送蘭州大學第一醫院檢驗科。使用全自動生化分析儀檢測尿素氮、血肌酐等指標。取血后，打開腹腔，用冰鹽水經主動脈反復灌洗腎臟至顏色蒼白后，快速暴露大鼠左右腎臟組織并取出，在冰板上去除包膜，取左腎置于 3% 的多聚甲醛溶液中固定用于蘇木精–伊紅染色和免疫組織化學檢測，取右腎腎皮質置于 2.5% 戊二醛溶液中固定用于電鏡觀察。同樣方法采取各組剩余大鼠腎臟組織并置于預先標記好的凍存管中，經液氮速凍后保存于–80 ℃ 冰箱中，用于檢測氧化應激指標 SOD、MDA、羥自由基及凋亡調控因子 Bcl-2、Caspase-3、Bax。
1.2.4 各組大鼠腎臟組織蘇木精–伊紅染色
取出 3% 多聚甲醛固定的腎臟組織，經脫水（70% 乙醇過夜，共 12 h；80% 乙醇 1 h；95% 乙醇Ⅰ、95% 乙醇Ⅱ各 1 h；無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ各 40 min）、透明（二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各 15 min）、浸蠟（浸蠟Ⅰ、浸蠟Ⅱ各 1 h）、包埋、切片（厚度約 4 μm）、裱片、攤片、烤片（恒溫箱 100 ℃ 約 60 min）、蘇木精–伊紅染色（切片常規脫蠟至水、蘇木精中浸泡 4 min、1% 鹽酸酒精中分化 2～3 s，返藍 5 min、伊紅溶液中浸泡 30 s、常規梯度脫水）、透明、封片。鏡下觀察并攝片，取各組 8 張標本片在光學顯微鏡下以相同倍數（×400）分別選取不同部位攝片。
1.2.5 各組大鼠腎臟組織透射電鏡觀察
取出 2.5% 戊二醛固定的腎臟組織，切成 1 mm×1 mm×1 mm 組織塊，1% 鋨酸固定液固定，磷酸緩沖液沖洗，酒精逐級脫水，環氧樹脂浸透、包埋、聚合，切片機切片，制成 1～10 μm 的薄片切片，再用甲胺苯藍染色，再次切片，制成厚度為 60～80 nm 的超薄切片，經醋酸鈾、枸櫞酸鉛雙染色后，在透射電子顯微鏡下觀察。
1.2.6 免疫組織化學檢測各組大鼠腎臟組織 KIM-1 蛋白表達
將制作好的腎臟組織蠟塊用石蠟切片機切成約 4 μm 厚的石蠟切片，固定于多聚賴氨酸玻片上，進行烤片（恒溫箱 60 ℃ 約 60 min），常規脫蠟脫水，0.01 mol/L PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，每張切片均勻滴加 3% 過氧化氫溶液，以消除內源性過氧化物酶活性，0.01 mol/L PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，現配 pH 6.0 的檸檬酸抗原修復液進行高壓鍋抗原修復，0.01 mol/L PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，分別滴加封閉用正常山羊血清工作液，15 min 后傾去，勿洗，分別滴加兔抗大鼠 KIM-1 抗體（1∶100 PBS 稀釋），陰性對照組加入正常鼠血清。4 ℃ 冰箱過夜，約 17 h。PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，分別加入二抗（生物素標記山羊抗兔 IgG 工作液），37 ℃ 恒溫箱孵育 15 min 后取出，PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，分別加入辣根酶標記鏈酶卵白素工作液，37 ℃ 恒溫箱孵育 15 min 后取出，PBS 溶液輕柔沖洗，5 min×3 次，用二氨基聯苯胺顯色。顯色 1 min 后，在光鏡下觀察，形成紅色反應物后即用蒸餾水充分沖洗終止反應，蘇木精復染，常規梯度酒精脫水，二甲苯透明，封片。光學顯微鏡下觀察并采集圖片。用圖像分析系統（Image-Pro Plus 6.0）測量平均灰度值并分析。
1.2.7 實時熒光定量 PCR 法測定各組大鼠腎臟組織中 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 表達
（1）總 RNA 提取與逆轉錄：從–80 ℃ 低溫冰箱中取出腎臟組織，迅速用 Trizol 試劑進行研磨，依次加入氯仿、異丙醇、乙醇抽提總 RNA，并檢測總 RNA 濃度和純度，使波長 260 nm 和 280 nm 下吸光度比值在 1.7～2.0 視為純度高。根據 Takara 試劑盒方法合成 cDNA。所得 cDNA 保存于–20 ℃ 用于 PCR 擴增。（2）PCR 擴增：Bcl-2、Caspase-3、Bax、內參照 β-actin 引物用 DNA Club 軟件設計，由寶生物工程有限公司合成，序列如下：Bcl-2 上游引物 5′-GACTGAGTACCTGAACCGGCATC-3′，下游引物 5′-CTGAGCAGCGTCTTCAGAGACA-3′；Caspase-3 上游引物 5′-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3′，下游引物 5′-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3′；Bax 上游引物 5′-AGGACGCATCCACCAAGAAGC-3′，下游引物 5'-GGTTCTGATCAGCTCGGGGCA-3′；β-actin 上游引物 5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′，下游引物 5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。反應體系：SYBR?PremixExTaqTMII（2×）6.25 μL，上下游引物各 0.5 μL，DNA 模板 1 μL，補足滅菌蒸餾水至 12.5 μL。使用 PCR 擴增儀進行擴增，擴增條件：第一步預變性（95 ℃ 下 30 s）；二步 PCR 反應（40 個循環，95 ℃ 下 5 s，60 ℃ 下 30 s）。分別得到擴增曲線、溶解曲線和待測樣本表達量，應用分析軟件 Rotor-Gene3000 判斷溶解曲線特異性及擴增曲線是否為陽性，采用 2?△△Ct相對定量分析法計算出各組 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 含量。
1.2.8 各組大鼠腎臟組織中 MDA 含量、抑制羥自由基能力和 SOD 活力的測定
MDA 含量檢測采用硫代巴比妥酸法，用 UV-1700 紫外可見分光光度計，在波長為 532 nm 處測定大鼠腎臟組織上清液吸光度值，然后根據試劑盒說明書的計算公式算出組織中 MDA 含量，結果以 nmol/mg prot 表示。抑制羥自由基能力采用最常見的 Fenton 反應，在波長 550 nm 處用可見分光光度計測定大鼠腎臟組織上清液吸光度值，運用公式計算得到抑制羥自由基能力，結果以 U/mg prot 表示。規定每毫克組織蛋白在 37 ℃ 下反應 1 min，使反應體系中 H2O2 的濃度降低 1 mmol/L 為一個抑制羥自由基能力單位。抑制羥自由基能力越高，則反映大鼠腎臟組織中羥自由基的含量越低。SOD 活力檢測采用 WST-1 法，用酶標儀在波長為 450 nm 處測定大鼠腎臟組織上清液吸光度值，然后依據試劑盒說明書的公式計算出組織中 SOD 活力，結果以 U/mg prot 表示。大鼠腎臟組織勻漿蛋白濃度采用 BCA 法測定。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 統計軟件。符合正態分布的數據以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析，并做 LSD 法兩兩組間比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組大鼠腎臟組織血清中尿素氮、肌酐指標
四組間血尿素氮差異無統計學意義（P>0.05）。四組間血肌酐差異有統計學意義（P<0.01）。IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，差異均有統計學意義（P<0.01）；IH+NS 組與 IH 組相比，血肌酐差異無統計學意義（P>0.05）；IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1。
表1
各組大鼠各檢測指標結果（，n=6）
2.2 各組大鼠腎臟組織病理變化
NC 組大鼠腎臟組織形態正常，未見明顯異常。IH 組大鼠腎臟組織可見大部分腎小管上皮細胞高度腫脹變性，結構紊亂，管腔狹窄以致消失等，以近曲腎小管為著，腎小球未見明顯異常。IH+NE 組大鼠腎臟組織可見小部分近曲腎小管上皮細胞水腫，腎小球未見明顯異常。IH+NS 組大鼠腎臟組織可見大部分腎小管上皮細胞腫脹，管腔狹窄，以及氣球樣改變等。結果見圖 1。
圖1
腎臟組織病理像（蘇木精–伊紅×400）
a. NC 組：腎小球、腎小管未見明顯異常；b. IH 組：腎小管上皮細胞高度腫脹變形，管腔變窄甚至消失；c. IH+NE 組：腎小管上皮細胞輕度水腫；d. IH+NS 組：腎小管上皮細胞高度腫脹變形，管腔變窄
2.3 各組大鼠腎臟組織中腎小管超微結構變化
IH 組、IH+NE 組和 IH+NS 組大鼠腎臟組織改變均以近曲小管為主，NC 組大鼠腎臟組織腎小球和腎小管上皮刷狀緣及細胞器均無明顯變化。IH 組和 IH+NS 組可見腎小管上皮刷狀緣變稀疏并大量脫落，細胞器溶解，腎小球未見明顯變化。IH+NE 組可見少量細胞器腫脹、線粒體疏松，未見腎小管上皮刷狀緣稀疏并脫落，腎小球未見明顯變化。結果見圖 2。
圖2
腎臟組織透射電鏡像
a. NC 組：腎小球、腎小管未見明顯異常；b. IH 組：腎小管上皮刷狀緣變稀疏并大量脫落，細胞器溶解；c. IH+NE 組：少量細胞器腫脹、線粒體疏松；d. IH+NS 組：腎小管上皮刷狀緣變稀疏并大量脫落，細胞器溶解
2.4 各組大鼠腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達
四組間腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達比較，差異有統計學意義（P<0.01）。IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達均顯著升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。IH+NS 組與 IH 組相比，腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達差異無統計學意義（P>0.05）。IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，腎臟組織中 KIM-1 蛋白的表達均降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1 和圖 3。
圖3
腎臟組織 KIM-1 蛋白免疫組織化學檢測病理像（×400）
a. NC 組：正常腎小球及腎小管極少量表達；b. IH 組：腎小球無表達，腎小管大量表達；c. IH+NE 組：腎小球無表達，腎小管少量表達；d. IH+NS 組：腎小球無表達，腎小管大量表達
2.5 IH 對大鼠腎臟組織中 MDA 含量、SOD 活力和抑制羥自由基能力的影響
四組間腎臟組織 MDA 含量和 SOD 活力比較，差異有統計學意義（P<0.01）。IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，MDA 含量均顯著升高而 SOD 活力均顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01）。IH+NS 組與 IH 組相比，腎臟組織 MDA 含量和 SOD 活力差異均無統計學意義（P>0.05）。IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，MDA 含量均明顯降低而 SOD 活力均明顯升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1。
四組間腎臟組織抑制羥自由基能力比較，差異有統計學意義（P<0.01）。IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，腎臟組織抑制羥自由基能力均顯著降低，表明腎臟組織中羥自由基的含量高，差異均有統計學意義（P<0.01）；IH+NS 組與 IH 組相比，腎臟組織中抑制羥自由基能力差異無統計學意義（P>0.05）；IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，腎臟組織抑制羥自由基能力均明顯升高，表明腎臟組織中羥自由基的含量明顯降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1。
2.6 實時熒光定量 PCR 檢測各組大鼠腎臟組織中 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 表達及 Bcl-2/ Bax 比值
IH 組和 IH+NS 組與 NC 組相比，大鼠腎臟組織 Bcl-2 mRNA 表達減少，Caspase-3 和 Bax mRNA 表達增多，Bcl-2/Bax 比值降低，差異均有統計學意義（P<0.01）。IH+NS 組與 IH 組相比，大鼠腎臟組織中 Bcl-2、Caspase-3、Bax mRNA 表達差異無統計學意義（P>0.05）。IH+NE 組與 IH 組和 IH+NS 組相比，大鼠腎臟組織 Bcl-2 mRNA 表達明顯上調，Caspase-3 和 Bax mRNA 表達明顯下調，Bcl-2/Bax 比值升高，差異均有統計學意義（P<0.01）。結果見表 1。
3 討論
OSAHS 常累及全身多個系統并造成多器官損害，嚴重者甚至發生猝死，顯著降低了人們的生活質量。目前研究認為 IH 導致的氧化應激損傷是 OSAHS 靶器官損傷的主要機制，并且氧化應激可進一步介導炎癥反應、細胞凋亡等一系列損傷，因此研究抗氧化劑對 IH 動物模型保護機制是極其必要的。為此，我們通過建立 IH 大鼠模型來詳細研究 IH 是如何損害腎臟功能及其相關機制，以及通過依達拉奉干預來驗證是否可以改善腎臟損傷。
研究發現 IH 可導致大鼠腎臟組織細胞形態學發生顯著改變，主要表現在光鏡下腎小管上皮細胞高度腫脹變形，管腔變窄甚至消失，而腎小球未見明顯異常，經依達拉奉干預后上述癥狀均顯著改善。透射電鏡下發現 IH 可導致近曲腎小管上皮刷狀緣變稀疏并大量脫落，細胞器溶解，腎小球未見明顯變化；依達拉奉干預后可見少量細胞器腫脹、線粒體疏松，未見腎小管上皮刷狀緣稀疏并脫落。以上結果說明 IH 可損傷腎臟組織細胞，而依達拉奉干預后可減輕腎臟組織細胞損傷和變性。
既往研究表明血清胱蛋白酶抑制劑（cysaitin C）水平及尿系列酶活性是 OSAHS 患者中腎臟損傷的敏感指標[15-16]。由于腎損傷早期在 OSAHS 患者中比較隱匿，無明顯臨床表現，易導致診斷延誤，從而影響最佳治療時期。KIM-1 是主要表達于腎臟近曲腎小管上皮細胞的一種跨膜糖蛋白，在正常大鼠和人腎臟組織中表達量甚微，在腎臟缺血、缺氧性損傷后的早期可顯著表達于損傷后再生的近曲小管上皮中，是反映腎小管損傷的標志物之一[17-18]。因此，我們建立 IH 大鼠模型，研究腎臟 IH 過程中的病理變化特點，了解 KIM-1 能否作為早期診斷腎臟早期損傷的臨床敏感指標。結果發現 IH 組大鼠腎臟組織 KIM-1 蛋白水平較 NC 組明顯升高，經依達拉奉干預后明顯降低。這表明在腎臟損傷早期，腎組織表達 KIM-1 迅速升高，因此可作為腎臟早期損傷重要的生物學標志物。
氧自由基是指由氧衍生出來的自由基及其產物，包括過氧化氫、羥自由基、超氧陰離子等，羥自由基被公認是生物系統中最具活性的活性氧物種，能導致生物體內 DNA、蛋白質和脂質氧化損傷。SOD 屬于金屬酶，主要作用是歧化氧自由基，及時清除機體生成的過量的自由基，以防止自由基對組織細胞產生毒害作用，從而保護細胞免受氧自由基的攻擊。SOD 活力可間接反映機體清除氧自由基的能力。自由基攻擊膜脂中的不飽和脂肪酸，使其發生氧化，脂質過氧化產物 MDA 就會升高。脂質過氧化是造成生物體氧化損傷的主要原因。通過測定體內 MDA 含量，可間接反映體內自由基對機體的損傷程度[19]。本研究結果顯示，IH 組和 IH+NS 組大鼠腎臟組織 SOD 活力顯著降低，MDA 含量顯著升高，抑制羥自由基能力降低即羥自由基的含量升高。說明 IH 時，腎臟組織羥自由基的增多，攻擊生物膜，因此脂質過氧化物生成增多；同時，自由基增多也加速細胞凋亡，為了清除過多的羥自由基，SOD 水平也下降。通過依達拉奉干預后 IH 組大鼠腎臟組織 SOD 活力顯著升高，MDA 含量和羥自由基的含量均明顯降低。這說明依達拉奉可以降低自由基，提高腎臟組織的抗氧化能力，對細胞具有保護作用。
細胞凋亡由基因控制的細胞主動的、受到嚴密調控的死亡過程。Bcl-2、Bax 是重要的凋亡調節相關基因。Bcl-2 是第一個被確認有抑制凋亡作用的基因，主要通過羧基端的信號錨定序列跨線粒體膜而發揮作用，在線粒體上可直接調節膜上通透性轉換孔來調節線粒體膜的通透性，以阻止細胞色素 C 釋放入胞質而抑制細胞凋亡[20-23]。Bax 基因是近年來新發現的一種凋亡促進基因，屬 Bcl-2 同一家族基因，活化的 Bax 主要使線粒體和脂質體通透性增加，啟動凋亡信號，具有促凋亡作用[24-25]。相對于 Bax，Bcl-2 含量相對較多時發揮抗凋亡作用，當 Bax 含量相對較多時則表現為凋亡作用增強。因此，細胞是否通過此途徑導致凋亡，取決于 Bcl-2 與 Bax 的比值變化。本研究發現，經 IH 處理后，大鼠腎臟組織 Bcl-2 mRNA 表達減少，Bax mRNA 表達增多，Bcl-2/Bax 比值降低；而經過依達拉奉干預后，大鼠腎臟組織 Bcl-2 mRNA 表達明顯上調，Bax mRNA 表達明顯下調，Bcl-2/Bax 比值升高。Caspase-3 是細胞凋亡過程的最終執行者，它的激活可直接導致細胞發生凋亡。Caspase-3 的激活因素主要包括缺氧、缺血、氧自由基、鈣超載等，當以上這些因素刺激線粒體時，引起細胞色素 C 從線粒體膜釋放到胞質中，導致 Caspase-9 的活化，進而激活 Caspase-3，導致細胞凋亡開始[26-27]。本研究 PCR 結果發現 IH+NE 組大鼠腎臟組織中 Caspase-3 mRNA 表達量明顯低于 IH 組，這說明 Caspase-3 的上游環節受到抑制。因此，IH 后大鼠腎臟組織處于凋亡高水平狀態，而依達拉奉可在一定程度上改善這種狀態，這表明依達拉奉可能通過調控 Bcl-2/Bax 比值及 Caspase-3 途徑而實現抗細胞凋亡作用。
綜上，IH 可通過氧化應激和調控 Bcl-2、Caspase-3、Bax 等凋亡調控因子導致腎臟損傷。此外，IH 可以使腎小管上皮細胞 KIM-1 的表達量增加，KIM-1 可作為評估腎臟早期損傷的較敏感及特異性的標志物。經依達拉奉干預后腎臟損傷均在一定程度上有所改善，故依達拉奉可能通過清除氧自由基、提高抗氧化能力、調控 Bcl-2/Bax 及 Caspase-3 介導的細胞凋亡，從而抵抗 IH 所致腎臟損傷。
