引用本文： 李鋒, 徐蒙蒙, 王沐昀, 陳宇清, 張海, 張妍蓓. 建立小鼠肺纖維化合并肺氣腫模型的實驗研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(6): 604-608. doi: 10.7507/1671-6205.201806007 復制
肺纖維化合并肺氣腫（combined pulmonary fibrosis and emphysema，CPFE）近年來逐漸被認為是一種獨立的疾病，主要特征為上肺野為主的肺氣腫和下肺野為主的纖維化同時存在，臨床表現為嚴重的運動性呼吸困難，肺功能指標異常，彌散能力明顯下降及活動后低氧血癥[1-2]，同時，CPFE 患者并發肺動脈高壓、肺癌的風險顯著升高。隨著吸煙人群的增多和城市空氣污染的不斷加重，CPFE 的發病率和死亡率逐年上升。細顆粒物（fine particulat matter，PM2.5）和臭氧（ozone，O3）作為主要的空氣污染物，與慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）、肺纖維化、肺癌等慢性呼吸系統疾病的發病及癥狀加重密切相關[3-4]。對小鼠進行連續 13 個月的香煙煙霧暴露聯合博來霉素（bleomycin，BLM）或小鼠 γ 皰疹病毒 68（MHV-68）經氣管滴入，可建立 CPFE 模型[5]，但此法建模時間較長，且經氣管滴入的方法易致小鼠死亡，耗時耗力。我們的既往研究表明，采用 O3 暴露的方法，O3 濃度為 2.5 ppm，每周 2 次，共計 6 周，可以建立肺氣腫小鼠模型[6-7]。同時，我們另外一項研究表明，利用 PM2.5 經鼻滴入，劑量為 7.8 mg/kg，每周 2 次，8 周，可以建立肺纖維化小鼠模型。因此，本研究探討采用 PM2.5 經鼻滴入聯合 O3 吸入的方法建立小鼠 CPEF 模型，通過對肺功能、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）炎癥細胞計數、肺組織形態學指標及肺組織勻漿羥脯氨酸含量的檢測分析，評價該方法建立 CPFE 模型的可行性。
1 材料與方法
1.1 材料
C57/BL6 小鼠 24 只，22～25 g，由上海西必普凱公司提供，飼養于本院動物中心的無特定病原體級環境中，本實驗得到醫院倫理委員會許可。臭氧制造儀 Model 300 由德國 AB Aqua Medic GmbH 公司提供。肺功能儀（Forced Maneuvers 系統）由英國 EMMS 公司提供。小鼠氣體麻醉機和異氟烷購自上海玉研儀器公司。細胞離心機（Shandon Cytospin）由美國 Thermo Fisher 公司提供。劉氏染液購自珠海貝索生物技術有限公司。羥脯氨酸試劑盒購于南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 PM2.5 采集及其懸液制備
采用嶗應 2030 型中流量 PM2.5 采樣器（青島嶗山應用技術研究所）于上海市某建筑物樓頂連續采集，采樣時間為 2017 年 1 月到 2017 年 6 月。將采集到顆粒物的玻璃纖維素濾膜剪裁后，浸入超純水中，低溫超聲震蕩，洗脫 PM2.5，然后真空冷凍干燥，收集 PM2.5，–20 ℃ 保存備用。使用前，稱取一定量的 PM2.5，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配制實驗所需濃度的 PM2.5 懸液，超聲震蕩混勻。
1.2.2 實驗方法
（1）建立 CPFE 模型：24 只 C57/BL6 小鼠適應性喂養 1 周后，隨機分為 PBS 滴入+空氣吸入組、PBS 滴入+O3 吸入組和 PM2.5 滴入+O3 吸入組，每組 8 只。小鼠被放在氣體麻醉機麻醉箱中，異氟烷霧化麻醉，PBS 滴入+空氣吸入組和 PBS 滴入+O3 吸入組給予 PBS 50 μl 經鼻滴入，PM2.5 滴入+O3 吸入組給予 PM2.5 混懸液經鼻滴入，劑量為 7.8 mg/kg[8]，滴注體積為 50 μl。24 h 后，PBS 滴入+O3 吸入組和 PM2.5 滴入+O3 吸入組小鼠置于 O3 暴露密閉箱中，暴露于臭氧制造儀產生的 O3 中，濃度為 2.5 ppm，3 h。空氣吸入組小鼠進行空氣暴露。每周 2 次，連續 8 周。
（2）肺功能測定：8 周后，小鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉 150～200 μl 后，氣管切開并插管，置入體積描記箱（Forced Maneuvers 系統），并連接電腦控制的呼吸機，呼吸頻率 150 次/min。檢測吸氣量（inspiratory capacity，IC）、功能殘氣量（functional residual capacity，FRC）、肺總量（total lung capacity，TLC）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、第 25 ms、50 ms 的用力呼氣量（forced vital capacity，FEV；FEV25，FEV50）和肺順應性（Chord compliance，Cchord）。
（3）BALF 分析：腹腔注射 0.2 ml 的 1% 戊巴比妥鈉麻醉小鼠，用 2 ml PBS 進行支氣管肺泡灌洗，回收 BALF，4℃，1 000 r/min 離心 10 min。棄上清，200 μl PBS 重懸沉淀，顯微鏡下計數，通過細胞離心機進行細胞涂片，采用劉氏染液染色。顯微鏡下計數至少 500 個細胞，并區分各類炎癥細胞的比例。
（4）組織病理分析：左肺應用 4% 福爾馬林灌注、固定，石蠟包埋，切片，片厚 4 μm，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及 Masson 染色。HE 染色評估支氣管周圍的肺部炎癥積分：0=無炎癥反應；1=輕度炎癥反應，支氣管壁、血管壁或肺泡間隔有少量炎癥細胞；2=中度炎癥反應，支氣管壁、血管壁、肺泡間隔有成片炎癥；3=重度炎癥反應，支氣管壁、血管壁、肺泡間隔有廣泛的炎癥。在顯微鏡下，測量平均內襯間隔（Lm），應用目鏡測微尺，計數 5 條線（長度 500 μm）上的肺泡間隔數[9]。Lm（μm）=500/肺泡間隔數。Masson 染色后，通過 Image J 圖像分析軟件測量氣道上皮下膠原沉積面積（thickness of subepithelial collagen layer，SEc）、氣道基底膜周長（perimeter of basement membrane，Pbm），計算氣道上皮下膠原沉積厚度（SEc/Pbm）。
（5）肺組織羥脯氨酸的測定：用堿水解法按試劑盒說明書操作測定肺組織羥脯氨酸含量，計算公式：羥脯氨酸含量（μg/mg 濕重）=（測定管吸光度–空白管吸光度）/（標準管吸光度–空白管吸光度）×標準管含量［（5 μg/ml）×水解液總體積（10 ml）/組織濕重（mg）］。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件。數據以均數±標準差（
±s）表示，各組之間的比較進行單因素方差分析，Bonferroni 檢驗或 Dunnett T3 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺功能
與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的 IC 增加，TLC 增加，Cchord 增加，FEV25/FVC 降低；PM2.5 滴入+O3 吸入組的 IC 降低，FRC 增加，TLC 增加，Cchord 降低，FEV25/FVC 與 FEV50/FVC 降低。與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的 IC 降低，FRC 增加，Cchord 降低，FEV25/FVC 與 FEV50/FVC 降低。結果見表 1。
表1
各組的肺功能指標比較（
）
2.2 BALF 細胞計數
與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的細胞總數、巨噬細胞、中性粒細胞數和嗜酸性粒細胞增加；PM2.5 滴入+O3 吸入組的細胞總數、巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數和嗜酸性粒細胞增加。與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的細胞總數、淋巴細胞、中性粒細胞增加。結果見表 2。
表2
各組的 BALF 細胞總數和分類百分比（
）
2.3 肺組織病理染色觀察
HE 染色結果顯示，與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的 Lm 增大，炎癥積分增加；PM2.5 滴入+O3 吸入組的 Lm 增大，炎癥積分增加。與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的炎癥積分增加（圖 1，表 3）。氣管 Masson 染色結果顯示，與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的 SEc/Pbm 無變化，PM2.5 滴入+O3 吸入組的 SEc/Pbm 增加；與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的 SEc/Pbm 增加（圖 2，表 3）。
圖1
肺組織病理檢查像（HE×100）
a. PBS 滴入+空氣吸入組；b. PBS 滴入+O3 吸入組；c. PM2.5 滴入+O3 吸入組
圖2
氣管病理檢查像（Masson×100）
a. PBS 滴入+空氣吸入組；b. PBS 滴入+O3 吸入組；c. PM2.5 滴入+O3 吸入組。藍色部分表示膠原沉積
2.4 肺組織羥脯氨酸含量
與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的羥脯氨酸含量無變化；PM2.5 滴入+O3 吸入組的羥脯氨酸含量增加。與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的羥脯氨酸含量增加。結果見表 3。
表3
各組的肺部炎癥積分、Lm、膠原沉積厚度及肺組織羥脯氨酸含量
3 討論
本研究采用 PM2.5 鼻腔滴入聯合 O3 吸入的方法建模，通過對建模小鼠進行肺功能測定、肺部病理分析、肺組織羥脯氨酸含量測定等方法，證明連續 8 周的 PM2.5 鼻腔滴入聯合 O3 吸入可成功建立 CPFE 模型。PM2.5 和 O3 是目前主要的空氣污染物，與慢阻肺、肺纖維化的發生發展顯著相關[3-4]。PM2.5 隨呼吸進入肺部，易侵入肺實質并沉積于肺泡，甚至進入血液循環，可激活一系列細胞內外信號路徑，誘導炎癥因子的表達和氧化應激損傷[10-11]。調查表明，長期暴露于交通污染或交通相關 PM2.5 環境中，機體的肺功能會不斷下降，主要表現在 FEV1 和 FVC 的降低[12]。已有研究顯示，長期的 PM2.5 吸入誘導小鼠出現明顯的肝纖維化表型[13]。O3 是由氮氧化物和揮發性碳氫化合物以光化學方式而產生，被吸入肺部后，可與氣道、肺的有關成分相互作用，引發氧化應激損傷和肺部炎癥反應[14]。CPFE 是最近才引起重視的一種獨立疾病，目前的相關研究不多。基于我們實驗室的前期工作基礎，利用 O3 暴露 6 周可以構建肺氣腫模型，利用 PM2.5 經鼻滴入 8 周可以構建肺纖維化模型，于是，我們以 PM2.5 鼻腔滴入聯合 O3 吸入 8 周的方法成功構建 CPFE 模型。
BALF 細胞計數分析表明，與 PBS 滴入+空氣吸入組、PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的 BALF 的細胞總數、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數均增加。以 BALF 計數為評價指標來看，與既往的研究相比較，煙草+BLM 組為 587×104/ml，煙草+MHV-68 組為（85～155）×104/ml[5]，本方法為 76.42×104/ml，可見本方法所致的肺部炎癥相對較輕，這有可能是不同研究者的 BALF 處理方法與計數方法的不同所致。從 BALF 細胞分類來看，煙草+BLM 組、煙草+MHV-86 組的單核-巨噬細胞比例為 85%～90%，中性粒細胞比例為 7.5%～15%。本方法的單核-巨噬細胞比例為 50%，中性粒細胞比例為 35.5%。這表明，本方法介導的肺部炎癥以巨噬細胞、中性粒細胞兩種細胞炎癥為主。肺組織 HE 染色顯示，PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺部炎癥積分明顯增加，肺組織炎癥細胞浸潤明顯，支氣管壁、肺血管平滑肌周圍及肺泡間隔炎癥細胞增多，這與煙草+BLM 組的肺部炎癥病理變化相一致[5]。
肺組織 HE 染色還顯示，PBS 滴入+O3 吸入組和 PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺泡破壞嚴重，肺泡腔擴大，同時肺泡平均內襯間隔（Lm）增加，表明出現肺氣腫樣改變。以 Lm 為評價指標來看，與既往的研究相比較，煙草+BLM 組、煙草+MHV-68 組的 Lm 可達 150 μm[5]，本方法為 100 μm，可見本方法所致的肺氣腫嚴重程度相對較輕。
肺組織 Masson 染色顯示，與 PBS 滴入+空氣吸入組、PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺組織出現更明顯的基質膠原沉積，廣泛分布于氣道上皮下、支氣管壁、肺血管平滑肌周圍、以及肺泡壁，這表明出現肺纖維化表型。另外，與 PBS 滴入+空氣吸入組、PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺組織羥脯氨酸含量明顯升高，羥脯氨酸在體內主要用于合成膠原纖維[15]，因此羥脯氨酸含量的升高也提示肺纖維化形成。
肺功能測定結果顯示，PBS 滴入+O3 吸入組與 PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺功能指標均明顯下降。其中 PBS 滴入+O3 吸入組的肺容量增加（表現為 IC 和 TLC 增大），肺順應性升高（表現為 Cchord 增大），呼出氣流受限（表現為 FEV25/FVC 和 FEV50/FVC 降低），與慢阻肺患者的肺功能改變一致，即表現為阻塞性通氣功能障礙。PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺容量增加（表現為 TLC 增大），但吸氣能力 IC 明顯降低，呼出氣流受限程度進一步增大（與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，FEV25/FVC 和 FEV50/FVC 進一步降低），出現限制性通氣功能障礙和阻塞性通氣功能障礙共存的現象。
綜上所述，對小鼠進行連續 8 周、每周 2 次的 PM2.5（7.8 mg/kg）經鼻滴入和 O3（2.5 ppm，3 h）吸入可成功建立 CPFE 模型。考慮到 PM2.5、石棉、二氧化硅等均屬于誘導肺纖維化的理化因素，因此本方法適用于空氣污染合并理化因素所致 CPFE 的動物模型研究。關于本方法誘導 CPFE 模型的具體機制有待于進一步研究。
肺纖維化合并肺氣腫（combined pulmonary fibrosis and emphysema，CPFE）近年來逐漸被認為是一種獨立的疾病，主要特征為上肺野為主的肺氣腫和下肺野為主的纖維化同時存在，臨床表現為嚴重的運動性呼吸困難，肺功能指標異常，彌散能力明顯下降及活動后低氧血癥[1-2]，同時，CPFE 患者并發肺動脈高壓、肺癌的風險顯著升高。隨著吸煙人群的增多和城市空氣污染的不斷加重，CPFE 的發病率和死亡率逐年上升。細顆粒物（fine particulat matter，PM2.5）和臭氧（ozone，O3）作為主要的空氣污染物，與慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）、肺纖維化、肺癌等慢性呼吸系統疾病的發病及癥狀加重密切相關[3-4]。對小鼠進行連續 13 個月的香煙煙霧暴露聯合博來霉素（bleomycin，BLM）或小鼠 γ 皰疹病毒 68（MHV-68）經氣管滴入，可建立 CPFE 模型[5]，但此法建模時間較長，且經氣管滴入的方法易致小鼠死亡，耗時耗力。我們的既往研究表明，采用 O3 暴露的方法，O3 濃度為 2.5 ppm，每周 2 次，共計 6 周，可以建立肺氣腫小鼠模型[6-7]。同時，我們另外一項研究表明，利用 PM2.5 經鼻滴入，劑量為 7.8 mg/kg，每周 2 次，8 周，可以建立肺纖維化小鼠模型。因此，本研究探討采用 PM2.5 經鼻滴入聯合 O3 吸入的方法建立小鼠 CPEF 模型，通過對肺功能、支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）炎癥細胞計數、肺組織形態學指標及肺組織勻漿羥脯氨酸含量的檢測分析，評價該方法建立 CPFE 模型的可行性。
1 材料與方法
1.1 材料
C57/BL6 小鼠 24 只，22～25 g，由上海西必普凱公司提供，飼養于本院動物中心的無特定病原體級環境中，本實驗得到醫院倫理委員會許可。臭氧制造儀 Model 300 由德國 AB Aqua Medic GmbH 公司提供。肺功能儀（Forced Maneuvers 系統）由英國 EMMS 公司提供。小鼠氣體麻醉機和異氟烷購自上海玉研儀器公司。細胞離心機（Shandon Cytospin）由美國 Thermo Fisher 公司提供。劉氏染液購自珠海貝索生物技術有限公司。羥脯氨酸試劑盒購于南京建成生物工程研究所。
1.2 方法
1.2.1 PM2.5 采集及其懸液制備
采用嶗應 2030 型中流量 PM2.5 采樣器（青島嶗山應用技術研究所）于上海市某建筑物樓頂連續采集，采樣時間為 2017 年 1 月到 2017 年 6 月。將采集到顆粒物的玻璃纖維素濾膜剪裁后，浸入超純水中，低溫超聲震蕩，洗脫 PM2.5，然后真空冷凍干燥，收集 PM2.5，–20 ℃ 保存備用。使用前，稱取一定量的 PM2.5，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）配制實驗所需濃度的 PM2.5 懸液，超聲震蕩混勻。
1.2.2 實驗方法
（1）建立 CPFE 模型：24 只 C57/BL6 小鼠適應性喂養 1 周后，隨機分為 PBS 滴入+空氣吸入組、PBS 滴入+O3 吸入組和 PM2.5 滴入+O3 吸入組，每組 8 只。小鼠被放在氣體麻醉機麻醉箱中，異氟烷霧化麻醉，PBS 滴入+空氣吸入組和 PBS 滴入+O3 吸入組給予 PBS 50 μl 經鼻滴入，PM2.5 滴入+O3 吸入組給予 PM2.5 混懸液經鼻滴入，劑量為 7.8 mg/kg[8]，滴注體積為 50 μl。24 h 后，PBS 滴入+O3 吸入組和 PM2.5 滴入+O3 吸入組小鼠置于 O3 暴露密閉箱中，暴露于臭氧制造儀產生的 O3 中，濃度為 2.5 ppm，3 h。空氣吸入組小鼠進行空氣暴露。每周 2 次，連續 8 周。
（2）肺功能測定：8 周后，小鼠腹腔注射 1% 戊巴比妥鈉 150～200 μl 后，氣管切開并插管，置入體積描記箱（Forced Maneuvers 系統），并連接電腦控制的呼吸機，呼吸頻率 150 次/min。檢測吸氣量（inspiratory capacity，IC）、功能殘氣量（functional residual capacity，FRC）、肺總量（total lung capacity，TLC）、用力肺活量（forced vital capacity，FVC）、第 25 ms、50 ms 的用力呼氣量（forced vital capacity，FEV；FEV25，FEV50）和肺順應性（Chord compliance，Cchord）。
（3）BALF 分析：腹腔注射 0.2 ml 的 1% 戊巴比妥鈉麻醉小鼠，用 2 ml PBS 進行支氣管肺泡灌洗，回收 BALF，4℃，1 000 r/min 離心 10 min。棄上清，200 μl PBS 重懸沉淀，顯微鏡下計數，通過細胞離心機進行細胞涂片，采用劉氏染液染色。顯微鏡下計數至少 500 個細胞，并區分各類炎癥細胞的比例。
（4）組織病理分析：左肺應用 4% 福爾馬林灌注、固定，石蠟包埋，切片，片厚 4 μm，進行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色及 Masson 染色。HE 染色評估支氣管周圍的肺部炎癥積分：0=無炎癥反應；1=輕度炎癥反應，支氣管壁、血管壁或肺泡間隔有少量炎癥細胞；2=中度炎癥反應，支氣管壁、血管壁、肺泡間隔有成片炎癥；3=重度炎癥反應，支氣管壁、血管壁、肺泡間隔有廣泛的炎癥。在顯微鏡下，測量平均內襯間隔（Lm），應用目鏡測微尺，計數 5 條線（長度 500 μm）上的肺泡間隔數[9]。Lm（μm）=500/肺泡間隔數。Masson 染色后，通過 Image J 圖像分析軟件測量氣道上皮下膠原沉積面積（thickness of subepithelial collagen layer，SEc）、氣道基底膜周長（perimeter of basement membrane，Pbm），計算氣道上皮下膠原沉積厚度（SEc/Pbm）。
（5）肺組織羥脯氨酸的測定：用堿水解法按試劑盒說明書操作測定肺組織羥脯氨酸含量，計算公式：羥脯氨酸含量（μg/mg 濕重）=（測定管吸光度–空白管吸光度）/（標準管吸光度–空白管吸光度）×標準管含量［（5 μg/ml）×水解液總體積（10 ml）/組織濕重（mg）］。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 統計軟件。數據以均數±標準差（
±s）表示，各組之間的比較進行單因素方差分析，Bonferroni 檢驗或 Dunnett T3 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺功能
與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的 IC 增加，TLC 增加，Cchord 增加，FEV25/FVC 降低；PM2.5 滴入+O3 吸入組的 IC 降低，FRC 增加，TLC 增加，Cchord 降低，FEV25/FVC 與 FEV50/FVC 降低。與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的 IC 降低，FRC 增加，Cchord 降低，FEV25/FVC 與 FEV50/FVC 降低。結果見表 1。
表1
各組的肺功能指標比較（
）
2.2 BALF 細胞計數
與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的細胞總數、巨噬細胞、中性粒細胞數和嗜酸性粒細胞增加；PM2.5 滴入+O3 吸入組的細胞總數、巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數和嗜酸性粒細胞增加。與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的細胞總數、淋巴細胞、中性粒細胞增加。結果見表 2。
表2
各組的 BALF 細胞總數和分類百分比（
）
2.3 肺組織病理染色觀察
HE 染色結果顯示，與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的 Lm 增大，炎癥積分增加；PM2.5 滴入+O3 吸入組的 Lm 增大，炎癥積分增加。與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的炎癥積分增加（圖 1，表 3）。氣管 Masson 染色結果顯示，與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的 SEc/Pbm 無變化，PM2.5 滴入+O3 吸入組的 SEc/Pbm 增加；與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的 SEc/Pbm 增加（圖 2，表 3）。
圖1
肺組織病理檢查像（HE×100）
a. PBS 滴入+空氣吸入組；b. PBS 滴入+O3 吸入組；c. PM2.5 滴入+O3 吸入組
圖2
氣管病理檢查像（Masson×100）
a. PBS 滴入+空氣吸入組；b. PBS 滴入+O3 吸入組；c. PM2.5 滴入+O3 吸入組。藍色部分表示膠原沉積
2.4 肺組織羥脯氨酸含量
與 PBS 滴入+空氣吸入組相比，PBS 滴入+O3 吸入組的羥脯氨酸含量無變化；PM2.5 滴入+O3 吸入組的羥脯氨酸含量增加。與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的羥脯氨酸含量增加。結果見表 3。
表3
各組的肺部炎癥積分、Lm、膠原沉積厚度及肺組織羥脯氨酸含量
3 討論
本研究采用 PM2.5 鼻腔滴入聯合 O3 吸入的方法建模，通過對建模小鼠進行肺功能測定、肺部病理分析、肺組織羥脯氨酸含量測定等方法，證明連續 8 周的 PM2.5 鼻腔滴入聯合 O3 吸入可成功建立 CPFE 模型。PM2.5 和 O3 是目前主要的空氣污染物，與慢阻肺、肺纖維化的發生發展顯著相關[3-4]。PM2.5 隨呼吸進入肺部，易侵入肺實質并沉積于肺泡，甚至進入血液循環，可激活一系列細胞內外信號路徑，誘導炎癥因子的表達和氧化應激損傷[10-11]。調查表明，長期暴露于交通污染或交通相關 PM2.5 環境中，機體的肺功能會不斷下降，主要表現在 FEV1 和 FVC 的降低[12]。已有研究顯示，長期的 PM2.5 吸入誘導小鼠出現明顯的肝纖維化表型[13]。O3 是由氮氧化物和揮發性碳氫化合物以光化學方式而產生，被吸入肺部后，可與氣道、肺的有關成分相互作用，引發氧化應激損傷和肺部炎癥反應[14]。CPFE 是最近才引起重視的一種獨立疾病，目前的相關研究不多。基于我們實驗室的前期工作基礎，利用 O3 暴露 6 周可以構建肺氣腫模型，利用 PM2.5 經鼻滴入 8 周可以構建肺纖維化模型，于是，我們以 PM2.5 鼻腔滴入聯合 O3 吸入 8 周的方法成功構建 CPFE 模型。
BALF 細胞計數分析表明，與 PBS 滴入+空氣吸入組、PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的 BALF 的細胞總數、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞計數均增加。以 BALF 計數為評價指標來看，與既往的研究相比較，煙草+BLM 組為 587×104/ml，煙草+MHV-68 組為（85～155）×104/ml[5]，本方法為 76.42×104/ml，可見本方法所致的肺部炎癥相對較輕，這有可能是不同研究者的 BALF 處理方法與計數方法的不同所致。從 BALF 細胞分類來看，煙草+BLM 組、煙草+MHV-86 組的單核-巨噬細胞比例為 85%～90%，中性粒細胞比例為 7.5%～15%。本方法的單核-巨噬細胞比例為 50%，中性粒細胞比例為 35.5%。這表明，本方法介導的肺部炎癥以巨噬細胞、中性粒細胞兩種細胞炎癥為主。肺組織 HE 染色顯示，PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺部炎癥積分明顯增加，肺組織炎癥細胞浸潤明顯，支氣管壁、肺血管平滑肌周圍及肺泡間隔炎癥細胞增多，這與煙草+BLM 組的肺部炎癥病理變化相一致[5]。
肺組織 HE 染色還顯示，PBS 滴入+O3 吸入組和 PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺泡破壞嚴重，肺泡腔擴大，同時肺泡平均內襯間隔（Lm）增加，表明出現肺氣腫樣改變。以 Lm 為評價指標來看，與既往的研究相比較，煙草+BLM 組、煙草+MHV-68 組的 Lm 可達 150 μm[5]，本方法為 100 μm，可見本方法所致的肺氣腫嚴重程度相對較輕。
肺組織 Masson 染色顯示，與 PBS 滴入+空氣吸入組、PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺組織出現更明顯的基質膠原沉積，廣泛分布于氣道上皮下、支氣管壁、肺血管平滑肌周圍、以及肺泡壁，這表明出現肺纖維化表型。另外，與 PBS 滴入+空氣吸入組、PBS 滴入+O3 吸入組相比，PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺組織羥脯氨酸含量明顯升高，羥脯氨酸在體內主要用于合成膠原纖維[15]，因此羥脯氨酸含量的升高也提示肺纖維化形成。
肺功能測定結果顯示，PBS 滴入+O3 吸入組與 PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺功能指標均明顯下降。其中 PBS 滴入+O3 吸入組的肺容量增加（表現為 IC 和 TLC 增大），肺順應性升高（表現為 Cchord 增大），呼出氣流受限（表現為 FEV25/FVC 和 FEV50/FVC 降低），與慢阻肺患者的肺功能改變一致，即表現為阻塞性通氣功能障礙。PM2.5 滴入+O3 吸入組的肺容量增加（表現為 TLC 增大），但吸氣能力 IC 明顯降低，呼出氣流受限程度進一步增大（與 PBS 滴入+O3 吸入組相比，FEV25/FVC 和 FEV50/FVC 進一步降低），出現限制性通氣功能障礙和阻塞性通氣功能障礙共存的現象。
綜上所述，對小鼠進行連續 8 周、每周 2 次的 PM2.5（7.8 mg/kg）經鼻滴入和 O3（2.5 ppm，3 h）吸入可成功建立 CPFE 模型。考慮到 PM2.5、石棉、二氧化硅等均屬于誘導肺纖維化的理化因素，因此本方法適用于空氣污染合并理化因素所致 CPFE 的動物模型研究。關于本方法誘導 CPFE 模型的具體機制有待于進一步研究。
