白細胞介素-25 及其受體對過敏性哮喘患者嗜酸性粒細胞的調控作用_《中國呼吸與危重監護雜志》

作者：

杜威 ^1,2 , 杜娟 ^1,2 , 周俊 ^1,2 , 時國朝 ^1,2 ,  湯葳 ^1,2

1. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院呼吸與危重癥醫學科（上海 ?200025）;
2. 上海交通大學醫學院呼吸病研究所（上海 ?200025）;

關鍵詞：

哮喘過敏原激發嗜酸性粒細胞白細胞介素-25 白細胞介素-25 受體

DOI：

10.7507/1671-6205.201805012

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摘要 全文 圖表 視頻 參考文獻 施引文獻 補充材料

目的研究白細胞介素-25（IL-25）在過敏性哮喘患者的過敏原激發過程中，對嗜酸性粒細胞（Eos）表面受體表達的影響及其潛在機制。方法 15 例過敏性哮喘患者進行過敏原激發試驗，激發前后測定外周血 Eos 表面 IL-25 受體的表達情況和血漿及 Eos 胞內 IL-25 表達水平。此外，對外周血提取的 Eos 在體外以 IL-25 進行刺激，測定 Eos 細胞 IL-5 和 IL-13 的表達及脫顆粒情況，以及其在嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin）環境中的遷移情況。通過重復測量方差分析方法進行數據分析，兩兩比較采用 Tukey 多組比較方法。結果在過敏原激發前后外周血中表達 IL-17RB 的 Eos 數量分別為（7 426±2 824）/10⁶ 白細胞和（19 446±5 593）/10⁶ 白細胞，同時表達 IL-17RA/RB 的 Eos 數量分別為（4 508±1 360）/10⁶ 白細胞和（9 025±3 166）/10⁶ 白細胞，激發前后相比差異均有統計學意義（P 均<0.001）。激發后 7 h 和 24 h，血漿 IL-25 的水平較激發前均顯著上升［激發前，（650±45）pg/ml；激發后 7 h，（851±43）pg/ml；激發后 24 h，（813±56）pg/ml。三組組間比較，差異有統計學意義（P<0.001）］。激發后 24 h 外周血 Eos 胞內表達 IL-25 的數目顯著增加［（10 398±1 909）/10⁶ 白細胞和（147 684±46 222）/10⁶ 白細胞，P<0.05）］。在體外實驗中，Eos 細胞經 IL-25 刺激后釋放過氧化物酶［（1.26±0.40）ng/ml 和（12.5±4.20）ng/ml，P<0.05）］以及胞內表達 IL-5 和 IL-13 水平均顯著上升。IL-25 預處理后能夠顯著增強 Eos 細胞對 eotaxin 的趨化反應（趨化細胞數分別為 36±3 和 69±5，P<0.05）。結論 IL-25/IL-25 受體通路在過敏性哮喘患者中可能促進了 Eos 細胞的聚集、活化和趨化，從而促進了過敏性哮喘嗜酸性粒細胞性炎癥反應。

引用本文： 杜威, 杜娟, 周俊, 時國朝, 湯葳. 白細胞介素-25 及其受體對過敏性哮喘患者嗜酸性粒細胞的調控作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(3): 247-253. doi: 10.7507/1671-6205.201805012 復制

在過敏性哮喘患者中，嗜酸性粒細胞（eosinophil，Eos）是導致氣道炎癥的主要細胞成分之一^[1-2]，但在哮喘發生發展中該類細胞的遷移和活化機制仍存在爭議。白細胞介素-25（interleukin-25，IL-25）是屬于 IL-17 家族的促炎因子，具有維持 2 型免疫反應的作用^[3]，其受體 IL-17RA/RB 由 IL-17RA（信號亞單位）和 IL-17RB（與特定細胞因子結合的亞單位）2 個亞單位構成^[4]。在過敏性疾病的動物模型^[5-6]和體外試驗^[7]中已經基本明確 IL-25 能夠促進 Eos 的聚集和活化，我們既往的研究也已經發現無癥狀的過敏性哮喘患者相比健康人群其體內的成熟 Eos 細胞表面的 IL-17RA 和 IL-17RB 的表達以及血漿 IL-25 的表達均顯著升高^[8]。但在哮喘患者急性發作過程中 IL-25 及其受體的作用和表達情況變化目前仍不明確。因此在本研究中，我們測定了哮喘患者在吸入過敏原激發后其外周血 Eos 細胞中 IL-25 及其受體表達的動態變化情況，還探究了 IL-25 對 Eos 細胞的細胞因子生成、脫顆粒和趨化能力的作用，從而更加深入地了解過敏性哮喘中 IL-25 如何引起氣道 Eos 浸潤和炎癥反應。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇 2017 年至2018 年門診收治、符合 GINA 支氣管哮喘診斷標準的輕中度過敏性哮喘患者^[9]，經過知情同意后納入該研究。患者年齡 19～52 歲，未使用過糖皮質激素，僅間斷使用 β2 受體激動劑治療，且均不吸煙，以排除吸煙和糖皮質激素治療對疾病診斷和試驗結果的影響^[8-9]。同時患者皮膚點刺試驗中至少一種吸入過敏原陽性（點刺試驗陽性指出現 2 mm×2 mm 的風團且組胺反應陽性而溶劑反應陰性），從而保證后續試驗的進行且進一步證實患者為過敏性哮喘^[8-9]。該研究通過研究者所在單位倫理委員會審查批準。

1.2 方法

1.2.1 過敏原及溶劑吸入激發反應

過敏原激發試驗按照既往研究中的描述進行^[10]。該研究是一項隨機對照交叉試驗，以過敏原為試驗組，過敏原溶劑作為對照組。其中用于試驗的吸入過敏原選擇在點刺試驗中導致最大風團的過敏原或在臨床病史中暴露后出現哮喘癥狀的過敏原。受試者于激發前后采集外周血以進行后續實驗。

1.2.2 細胞標本準備和免疫熒光染色

采集患者全血至乙二胺四乙酸管中，裂解液裂解紅細胞，熒光激活細胞分選儀（fluorescence activated cell sorter，FACS）緩沖液［磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）中加入 0.1% 的疊氮化鈉和 0.5% 的牛血清白蛋白中重懸白細胞］。為了檢測 Eos 表面的 IL-25 受體表達情況，細胞通過 V450-CD45、APC-CD16、FITC-IL-17RA、PE-IL-17RB 或 FITC-IgG1，以及 PE-IgG2B 等抗體進行標記。為了檢測胞內細胞因子表達水平，細胞首先通過 V450-CD45 和 APC-CD16（或 V450-CD3、Alexa Fluor 700-CD4 和 APC-CRTH2）進行預染色并在 4% 多聚甲醛中重懸 10 min，緩沖液洗滌 2 次后以皂苷緩沖液破膜（Hanks 平衡鹽緩沖液中加入 1% 皂苷和 0.05% NaN₃），再通過 FITC 標記的 IL-25 或 IgG1 同型對照抗體標記染色（20 ℃ 下 30 min），然后再加入 1% 多聚甲醛并送流式細胞檢測。所用抗體均購自美國 R&D Systems 公司。

1.2.3 檢測血漿 IL-25 水平

血漿 IL-25 的表達水平通過購買的酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）試劑盒（美國 Peprotech 公司）進行檢測，方法參考文獻[8, 11]。

1.2.4 Eos 脫顆粒分析

即 Eos 過氧化物酶檢測。過敏性哮喘患者外周血（100 ml）經過 AccuPrep 分層后采集粒細胞層并通過磁珠分選出 Eos（美國 Miltenyi Biotech 公司）。分選出的細胞純度>95%，存活率>90%。這些細胞在 24 孔板（1×10⁶/ml）中進行培養（RPMI 培養基）并分為加入和不加入 IL-25（1 ng/ml；R&D Systems）處理細胞，在分析結束前 2 h 進行處理。細胞處理后再在 1% 多聚甲醛中重懸，取上清液通過 ELISA 法檢測 Eos 過氧化物酶含量（美國 Cloud Clone 公司）。

1.2.5 IL-25 刺激 Th2 型細胞因子表達

Eos 進行富集后培養于 24 孔板中（1×10⁶/ml），并加入 IL-25 或空白對照試劑 18 h。細胞培養結束前 6 h 加入高爾基體拮抗劑莫能霉素（美國 BioLegend 公司）。細胞活性通過臺盼藍染色進行檢測。細胞培養結束后采集細胞樣本并通過前述免疫染色及流式細胞方法檢測胞內細胞因子表達情況。在該過程中，Eos 純度應>95%，活性>90%。

1.2.6 成熟 Eos 的趨化能力

行跨膜移行試驗。Eos 純化后在 RPMI 培養液中培養 2 h，并在其中加入 1 pg/ml 的 IL-25 或溶劑。細胞趨化能力通過 48 孔 Boyden 小室進行評估，方法參考文獻[12]。嗜酸性粒細胞趨化因子（eotaxin，1 nmol/L，美國 R&D Systems 公司）加至下方小室，而 Eos（3×10⁶/ml）加入上方小室。通過隨機選取 10 個 40 倍光鏡下視野進行計數，從而得出 Eos 數目。

1.2.7 流式細胞術

細胞以 LSR II 流式細胞儀（美國 Becton Dickinson 儀器系統）進行檢測，并以 FACSDiva 軟件程序（美國 Becton Dickinson 生物公司）獲取數據。設門策略參考文獻[8]。數據分析采用 FlowJo 9.3.2（美國 Tree Star 公司）軟件，從而獲得 IL-25 受體及細胞內 IL-25 的表達水平。

1.3 統計學方法

數據分析使用 Graphpad Prism 5 軟件（Graphpad Software Inc.，美國）。正態分布數據采用均數±標準誤（±SEM）表示。使第 1 秒用力呼氣容積（forced expiratory volume in onesecond，FEV₁）下降 20% 所需乙酰膽堿濃度（PC₂₀）采用幾何均數和幾何標準誤進行表示。對于 IL-25 受體在 Eos 表面的表達差異以及其他所有體外試驗數據，主要通過重復測量方差分析（analysis of variance，ANOVA）方法進行數據分析。兩兩比較采用 Tukey 多組比較方法。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氣道生理和氣道炎癥

共納入 15 例患者。患者皮膚點刺試驗均陽性，FEV₁ 占預計值百分比（FEV₁%pred）≥70%。在吸入過敏原后患者都出現了雙相氣道反應，即在吸入后 3 h 內 FEV₁ 下降≥20%（速發相哮喘反應），而在吸入后 3～7 h FEV₁ 再次下降≥15%（遲發相哮喘反應）。受試者的基線指標見表 1。相比于吸入溶劑，吸入過敏原的患者無論在哮喘的速發相反應和遲發相反應中均存在 FEV₁ 的顯著下降（表 2）。而患者在使用過敏原激發后 24 h 會出現 PC₂₀ 的顯著降低和痰 Eos 的顯著增高（表 2）。此外，激發后 24 h 患者外周血成熟 Eos 絕對數目顯著上升［（38±6）×10³/ml 和（64±9）×10³/ml，基線水平和激發后，P<0.05，表 2］。

表1 15 例輕度過敏性哮喘患者基線資料

表選項

下載CSV

性別	年齡（歲）	FEV₁%pred （%）	乙酰膽堿激發前 PC₂₀（g/L）	吸入過敏原	FEV₁ 下降比例（%）	乙酰膽堿激發后 PC₂₀（g/L）
男	19	81	0.31	貓	35	31	0.16
男	25	114	10.31	屋塵螨	22	31	0.92
女	19	117	20.80	貓	22	18	5.97
女	49	97	1.07	屋塵螨	31	37	1.24
男	44	73	16.00	草	41	22	3.31
女	41	94	0.83	豚草	42	16	0.38
女	47	90	0.60	貓	47	20	0.43
女	20	92	3.19	樹	24	36	3.26
男	52	100	6.99	屋塵螨	36	18	5.74
男	27	97	2.71	豚草	42	16	2.7
女	21	98	16.00	馬	40	28	1.33
女	19	80	5.82	豚草	29	23	2.81
男	49	90	16.00	屋塵螨	33	25	0.11
女	24	116	0.38	屋塵螨	23	25	0.36
女	25	108	15.48	屋塵螨	38	21	4.26

表2 受試者的肺功能和痰液細胞情況

表選項

下載CSV

項目	過敏原激發	溶劑對照激發
速發相哮喘反應中 FEV₁ 百分比改變（%，±SEM）	–33.67±2.12^a	–3.40±1.51
遲發相哮喘反應中 FEV₁ 百分比改變（%，±SEM）	–24.47±1.77^a	–3.40±3.26
乙酰膽堿 PC₂₀[mg/ml，幾何均數（標準誤）]
激發前	7.77（1.88）	6.36（2.39）
激發后 24 h	2.20（0.51）^b	6.30（2.40）
總痰細胞數（×10⁶/ml，±SEM）
激發前	3.62±0.64	5.02±1.16
激發后 24 h	6.59±1.27^b	4.48±1.07
痰 Eos 百分比（%，±SEM）
激發前	4.68±1.63	1.50±0.49
激發后 24 h	12.26±2.68^a，b	2.79±1.06
血 Eos 數（×10³/ml，±SEM）
激發前	38±6	88±27
激發后 24 h	64±9^b	94±31
^a相比溶劑對照 P<0.05，^b相比于基線 P<0.05

2.2 過敏原誘導 IL-25 受體表達水平改變

在過敏原激發后 24 h，外周血中表達 IL-17RB［（7 426±2 824）/10⁶ 白細胞和（19 446±5 593）/10⁶ 白細胞，激發前和激發后，P<0.01］和 IL-17RA/RB［（4 508±1 360）/10⁶ 白細胞和（9 025±3 166）/10⁶ 白細胞，P<0.001］的成熟 Eos 數目顯著增多（圖 1），而 IL-17RA 的表達無此變化。

圖1 輕度過敏性哮喘患者體內成熟 Eos 過敏原激發后表面 IL-25 受體成分表達的變化情況　

a、b、c 分別代表 IL-17RA 陽性、IL-17RB 和 IL-17RA/RB 陽性 Eos 數目。過敏原激發后 IL-17RB 陽性和 IL-17RA/RB 陽性外周血 Eos 數目顯著增加。水平線表示均數。^*過敏原組激發前后對比，P<0.05；^#過敏原組和對照組相比，P<0.05

圖選項

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