引用本文： 葛海燕, 朱惠莉, 夏世金, 宋元林, 白春學. 水通道蛋白 1 對內皮祖細胞遷移功能的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(3): 290-295. doi: 10.7507/1671-6205.201804037 復制
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接和間接因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全[1]。由于缺乏有效的治療措施，其病死率仍高達 40%，嚴重威脅著患者的生命安全。了解其發病進程，尋求合適治療手段，提高危重 ALI 的救治率非常重要[2]。肺泡-毛細血管屏障功能及完整性在 ALI 的發生發展及病情轉歸方面具有重要意義。毛細血管內皮屏障是細胞間物質交換的基礎，血管內皮細胞的損傷及基底膜的損傷均能引起內皮功能的完整性受損[3-4]。內皮細胞的遷移在 ALI 修復中發揮重要作用。而內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPC）是血管內皮細胞的前體細胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復。研究顯示，EPC 在心腦血管疾病、腫瘤血管形成及損傷愈合等方面均發揮重要作用[5-7]。
水通道蛋白 1（aquaporin 1，AQP1）屬于膜主體蛋白家族，早期發現其主要功能是介導滲透壓驅動下的跨膜水轉運[8-9]，現在發現 AQP1 廣泛表達于許多器官的內皮細胞上，在肺臟表達于所有毛細血管內皮細胞及淋巴管的細胞膜上[10]。缺失 AQP1 基因對內皮細胞及腫瘤細胞的遷移、增殖等生物學功能有重要影響。應用缺血再灌注損傷模型復制的腎小管上皮損傷模型中，缺失 AQP1 基因使腎小管上皮細胞修復能力下降，體外研究表明其遷移能力下降，表現為細胞膜足突的形成減少。在缺血缺氧、心臟停搏等疾病中心臟內皮細胞中的 AQP1 表達降低，且可能與缺氧相關的 miR214 調節有關[11]。在各種病理生理條件下，如損傷、器官再生等，AQP1 具有損傷修復功能[12]。關于 AQP1 對 EPC 的功能影響目前尚未有研究。對其進行研究有助于從更早階段分析 AQP1 對損傷修復的影響，以期為降低 ALI 的死亡率尋求對策。本研究通過體外分離 AQP1 野生型（wild-type，WT）和敲除型（knockout-type，KO）小鼠骨髓間充質干細胞 （mesenchymal stem cell，MSC）并定向培養內皮祖細胞，應用免疫熒光法檢測細胞表面抗原 CD133、CD31、CD34 及 Flk-1 鑒定 EPC，通過無標記活細胞動態分析（live cell kinetic imaging and quantification，Cell IQ）技術、Transwell 遷移實驗及劃痕實驗比較 AQP1 WT 和 KO 小鼠中 EPC 的功能差異，旨在從更早階段分析 AQP1 對損傷修復的影響，為 ALI 損傷修復提供新的治療思路。
1 材料與方法
1.1 動物
AQP1 KO 小鼠（CD1 系）由加州大學舊金山分校醫學研究所贈送，復旦大學附屬中山醫院呼吸科保種鑒定。選取 4～6 周齡 AQP1 WT 小鼠及 KO 小鼠，每組各 6 只。研究經復旦大學動物倫理委員會批準，按照實驗動物處理指南處理小鼠。
1.2 方法
1.2.1 EPC 培養
小鼠麻醉處死后迅速置于 75% 酒精中浸泡 15 min。置于超凈臺上將小鼠雙下肢股骨、脛骨分離取出，浸泡于含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的磷酸緩沖鹽溶液（phophate-buffered saline，PBS）中保存。應用 1 ml 注射器沖洗出小鼠的骨髓，并收集骨髓細胞置于 15 ml 離心管中。按照 6 ml 骨髓細胞加入 4 ml 淋巴細胞分離液的比例，離心 15 min 后收集中間層白膜，PBS 洗滌細胞后應用含 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培養基進行培養。7 d 后進行傳代置于經纖連蛋白包被預處理的培養瓶中，并應用 LONZA 專用內皮細胞培養基培養 14 d 后傳代備用。相差顯微鏡觀察 EPC 形態。
1.2.2 細胞表面抗原免疫熒光檢測鑒定
選擇干細胞的表面標志 CD133 及 CD31，以及內皮細胞的表面標志 CD34 及 Flk-1 對 EPC 進行檢測鑒定。選擇傳代后第 7 d 和第 14 d 的 EPC 進行細胞表面抗原免疫熒光法鑒定。應用經人纖維連接蛋白包被的無菌載玻片作為載體，將細胞接種于含無菌載玻片的 6 孔板內，用含 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培養基進行培養。分別培養 3 d 后取出載玻片，并以用 4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 漂洗 3 次，封閉血清封閉 30 min 后，分別加入大鼠抗小鼠 CD133（1∶100）、兔抗小鼠 CD31（1∶100），以及大鼠抗小鼠 CD34（1∶100）、大鼠抗小鼠 Flk-1（1∶100）抗體于 4 ℃ 孵育過夜。第 2 d，用 PBS 漂洗 3 次后，加入羊抗大鼠 IgG-FITC 抗體（1∶400）及羊抗兔 IgG-PE 抗體（1∶200）于常溫下孵育 1 h。PBS 漂洗 2 遍后封片。于熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.2.3 Transwell 實驗檢測 EPC 遷移能力
用 50 mg/L Matrigel 膠 1∶8 稀釋液包被 Transwell 小室底部膜上室面，4 ℃ 風干。將 200 μl 槍頭的尖端剪掉，吸取纖連蛋白均勻涂抹于小室的下室面。EPC 無血清培養 12 h 后，消化離心，用含 BSA 的無血清培養基重懸。調整細胞密度至 1×105/ml，取細胞懸液 200 μl 加入 Transwell 小室，下室加入 500 μl 含 FBS 的培養基，常規培養 36 h 后，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞。結晶紫染色后，400 倍高倍視野下選擇 6 個視野進行拍照計數，取平均值。
1.2.4 Cell IQ 實驗
應用法國 Manual Tracking 活細胞工作系統進行細胞實時監測，并利用機器自帶的圖像分析軟件進行分析。接種 EPC 細胞并應用 Cell IQ 系統進行實時監測。Cell IQ 系統按照設定間隔時間每 15 min 自動拍照并計算細胞總數。每組包含 6 個重復圖像。
1.2.5 細胞劃痕實驗
傳代后的細胞培養 24 h 后，去除培養基，用尖端相同的 10 μl 槍頭劃直線，培養基清洗 3 次以去除刮起的漂浮細胞，加入低血清培養基（1%），放置于 Cell IQ 活細胞工作站中，每組選擇 3 個視野進行連續觀測，每隔 15 min 采集圖像 1 次，連續觀測 48 h，測量計算遷移距離并分析。每組實驗重復 6 次。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組差別比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠 EPC 的培養及鑒定
從小鼠大腿骨和脛骨骨髓分離出單個核細胞，應用 MSC 培養基培養 7 d。如圖所示，最初細胞保持懸浮狀態，但在 7 d 內逐漸黏附貼壁。MSC 細胞傳代后，放置于經纖連蛋白包被預處理的培養瓶中，并更換培養基為內皮細胞專用培養基進行培養，7 d 后細胞逐漸分化貼壁，14 d 后細胞繼續增殖、形態為梭形或多邊形，并融合成鋪路石樣的 EPC 細胞（圖 1）。
圖1
骨髓中分離出的單個核細胞在細胞培養不同時間點的相差顯微鏡像（×200）
a. MSC 培養第 1 d；b. MSC 培養第 7 d；c. EPC 培養第 7 d；d. EPC 培養第 14 d
選擇干細胞的表面標志 CD133 及 CD31，以及內皮細胞的表面標志 CD34 及 Flk-1 分不同時間點對 EPC 進行檢測鑒定，結果發現在應用內皮細胞專用培養基培養 7 d 后細胞 CD133 及 CD31 表達陽性，隨著培養時間的延長在 14 d 時 CD34 及 Flk-1 出現表達陽性（圖 2）。上述結果提示，經 MSC 內皮分化培養后的 EPC，最初表現出干細胞特征，隨著培養的延長，逐漸表現出內皮細胞特征。
圖2
對不同時間點 EPC 進行內皮細胞表面標志物的免疫熒光鑒定
a. 免疫熒光檢測像（×400），其中綠色表示不同內皮細胞表面標志物陽性結果，藍色表示 DAPI 核染色；b. 免疫熒光檢測結果分析
2.2 在不同組別 EPC 中 AQP1 的表達驗證
對 AQP1 WT 和 KO 小鼠經第一次傳代的 EPC 細胞進行 AQP1 免疫熒光檢測結果發現，僅在 AQP1 WT 小鼠中 AQP1 表達陽性（圖 3）。
圖3
AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 細胞中 AQP1 表達的免疫 熒光檢測像（×400）
a. KO 小鼠；b. WT 小鼠
2.3 不同組別 EPC 增殖和遷移能力比較
Cell IQ 結果顯示，培養 72 h 的 AQP1 WT 小鼠與 KO 小鼠 EPC 細胞增殖數目無顯著差異（圖 4）。進一步的 Transwell 檢測結果顯示，AQP1 KO 小鼠 EPC 遷移能力較 WT 小鼠明顯減弱（圖 5）。細胞劃痕實驗檢測結果顯示，AQP1 KO 小鼠 EPC 的劃痕愈合能力明顯低于 WT 小鼠（圖 6）。
圖4
Cell IQ 檢測 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 細胞增殖能力
圖5
Transwell 檢測 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 細胞侵襲能力
a. Transwell 檢測像（×400）；b. Transwell 檢測結果分析
圖6
Cell IQ 檢測 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 細胞劃痕愈合 能力
3 討論
ALI 臨床上表現為進行性低氧血癥和呼吸窘迫，由于缺乏有效的治療措施導致其病死率高[13]。ALI 是各種直接和間接因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全，其共同的基礎是肺泡毛細血管膜急性損傷[14]。
我們前期研究發現 AQP1 在小鼠肺缺血再灌注損傷中表達增加，并且與內皮細胞標志物 CD31 共定位，AQP1 KO 小鼠肺組織有較明顯的白細胞浸潤、膠原沉積、微血管通透性增加及血管生成因子表達減少，這提示 AQP1 缺失抑制血管生成延緩了再灌注肺組織的修復過程[15]。而 EPC 是血管內皮細胞的前體細胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復。AQP1 對 EPC 的增殖遷移功能是否有影響，目前未有研究。對此進行研究有助于從更早階段分析 AQP1 對損傷修復的影響，為降低 ALI 尤其是老年危重 ALI 的死亡率尋求新的治療方法。
AQP 是一類位于細胞膜上的可介導水轉運的蛋白家族。AQP1 是最早發現的 AQP 家族成員，早期發現其主要功能是介導滲透壓驅動下的跨膜水轉運，分別參與了乳汁生成、軟骨容積管理、滑液分泌、尿液濃縮、腦脊液平衡、房水平衡、膽汁分泌等多個生理及病理過程。而在呼吸系統，AQP1 參與包括氣道內氣體的水化、胎兒肺水的吸收、心力衰竭、肺損傷肺水腫的形成、各種病理條件下胸膜液體的分泌和聚集等過程。最近的研究發現，AQP1 多在全身各系統的微血管內皮細胞中表達，在損傷修復、血管生成的過程中發揮了非常重要的調節作用。Saadoun 等[16]在 2005 年發表于 Nature 的一項研究應用 AQP1 KO 小鼠和細胞培養體系，首次證明細胞膜 AQP 在血管生成和細胞遷移中發揮重要作用。內皮細胞損傷后無論從其結構還是功能等各方面都會引起一系列的改變。Mun 等[17]研究認為內皮細胞中的板式剪切力變化可以誘導 AQP1 的表達增加，該研究通過檢測內皮細胞的板式剪切力發現其可以增加 AQP1 的表達量，而應用 siRNA AQP1 處理后可以減輕內皮細胞的損傷反應。另外，AQP1 還與肝硬化患者肝血竇肝動脈毛細血管增殖相關，在對照組 AQP1 主要定位于肝門靜脈、肝小動脈、膽管區等處，肝血竇處毛細血管含量較少，而在肝硬化患者肝血竇處的內皮細胞上 AQP1 表達顯著增加，增加肝硬化的微血管抵抗[18]。而另外一項對肝硬化的研究同樣表明，在肝硬化纖維區小的血管源性的以及新生血管系統中 AQP1 表達增高，促進成纖維生長因子誘導肝臟內皮細胞動態膜起泡，從而促進其在基質中侵襲[19]。我們前期的研究也發現 AQP1 在小鼠肺缺血再灌注損傷中表達增加，并且與內皮細胞標志物 CD31 共定位，AQP1 KO 小鼠肺組織有較明顯的白細胞浸潤、膠原沉積、微血管通透性增加及血管生成因子表達減少，這提示 AQP1 缺失抑制血管生成，延緩了再灌注肺組織的修復過程。
EPC 是可以分化為成熟內皮細胞的前體細胞，參與血管生成、損傷修復等各種修復過程[6]。目前有關 EPC 的培養方法選擇眾多，可以從骨髓、臍血、外周血等來源提取并分離 EPC，而在骨髓中其含量最高。我們的研究選取了 4～6 周齡小鼠的股骨、脛骨分離獲取單核細胞，并應用特定的內皮細胞專用培養基進行誘導分化，該培養方法具有高效、簡便的特點。在我們的研究中，骨髓分離中出單個核細胞后，首先應用 MSC 培養基培養 7 d，最初細胞保持懸浮狀態，但在 7 d 內逐漸黏附貼壁。MSC 細胞傳代后，放置于經纖連蛋白包被預處理的培養瓶中，并更換培養基為內皮細胞專用培養基進行培養，7 d 后細胞逐漸分化貼壁，14 d 后細胞繼續增殖，形態為梭形或多邊形，并融合成典型的鋪路石樣的 EPC 細胞。關于 EPC 的鑒定目前也缺乏公認的金標準。綜合文獻檢索及預實驗結果[20-21]，我們選擇了細胞形態學鑒定和細胞表面抗原鑒定的方法。鑒定結果顯示，內皮分化培養后的 EPC，最初表現出 CD133 及 CD31 陽性的干細胞特征，隨著培養時間的延長，逐漸表現出 CD34 及 Flk-1 陽性的內皮細胞樣特征。
對 EPC 培養鑒定成功后，我們進一步研究了 AQP1 不同狀態下 EPC 的功能差異研究，應用 Cell IQ 技術對 EPC 進行增殖能力檢測，結果發現培養 72 h 的 AQP1 WT 小鼠與 KO 小鼠 EPC 細胞增殖數目無顯著差異。而進一步應用 Transwell 檢測發現，AQP1 KO 小鼠 EPC 遷移能力較 WT 小鼠明顯減弱，且 AQP1 KO 小鼠 EPC 的劃痕愈合能力明顯低于 WT 小鼠。結果提示 AQP1 影響可 EPC 的侵襲遷移能力而非增殖能力。該結果也與先前內皮細胞在損傷修復中 AQP1 主要影響內皮細胞遷移能力相一致。
綜上，本研究通過培養并鑒定 EPC，應用 Cell IQ、Transwell 遷移實驗及劃痕實驗比較 AQP1 WT 和 KO 小鼠中 EPC 的功能差異。研究發現 AQP1 可影響 EPC 的侵襲遷移能力而非增殖能力。本研究從更早階段分析 AQP1 對損傷修復的影響，對于 ALI 的防治具有重要意義。后續可模擬體外 ALI 缺氧復氧模型并進一步觀察 AQP1 對 EPC 的功能影響機制。
急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是各種直接和間接因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全[1]。由于缺乏有效的治療措施，其病死率仍高達 40%，嚴重威脅著患者的生命安全。了解其發病進程，尋求合適治療手段，提高危重 ALI 的救治率非常重要[2]。肺泡-毛細血管屏障功能及完整性在 ALI 的發生發展及病情轉歸方面具有重要意義。毛細血管內皮屏障是細胞間物質交換的基礎，血管內皮細胞的損傷及基底膜的損傷均能引起內皮功能的完整性受損[3-4]。內皮細胞的遷移在 ALI 修復中發揮重要作用。而內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPC）是血管內皮細胞的前體細胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復。研究顯示，EPC 在心腦血管疾病、腫瘤血管形成及損傷愈合等方面均發揮重要作用[5-7]。
水通道蛋白 1（aquaporin 1，AQP1）屬于膜主體蛋白家族，早期發現其主要功能是介導滲透壓驅動下的跨膜水轉運[8-9]，現在發現 AQP1 廣泛表達于許多器官的內皮細胞上，在肺臟表達于所有毛細血管內皮細胞及淋巴管的細胞膜上[10]。缺失 AQP1 基因對內皮細胞及腫瘤細胞的遷移、增殖等生物學功能有重要影響。應用缺血再灌注損傷模型復制的腎小管上皮損傷模型中，缺失 AQP1 基因使腎小管上皮細胞修復能力下降，體外研究表明其遷移能力下降，表現為細胞膜足突的形成減少。在缺血缺氧、心臟停搏等疾病中心臟內皮細胞中的 AQP1 表達降低，且可能與缺氧相關的 miR214 調節有關[11]。在各種病理生理條件下，如損傷、器官再生等，AQP1 具有損傷修復功能[12]。關于 AQP1 對 EPC 的功能影響目前尚未有研究。對其進行研究有助于從更早階段分析 AQP1 對損傷修復的影響，以期為降低 ALI 的死亡率尋求對策。本研究通過體外分離 AQP1 野生型（wild-type，WT）和敲除型（knockout-type，KO）小鼠骨髓間充質干細胞 （mesenchymal stem cell，MSC）并定向培養內皮祖細胞，應用免疫熒光法檢測細胞表面抗原 CD133、CD31、CD34 及 Flk-1 鑒定 EPC，通過無標記活細胞動態分析（live cell kinetic imaging and quantification，Cell IQ）技術、Transwell 遷移實驗及劃痕實驗比較 AQP1 WT 和 KO 小鼠中 EPC 的功能差異，旨在從更早階段分析 AQP1 對損傷修復的影響，為 ALI 損傷修復提供新的治療思路。
1 材料與方法
1.1 動物
AQP1 KO 小鼠（CD1 系）由加州大學舊金山分校醫學研究所贈送，復旦大學附屬中山醫院呼吸科保種鑒定。選取 4～6 周齡 AQP1 WT 小鼠及 KO 小鼠，每組各 6 只。研究經復旦大學動物倫理委員會批準，按照實驗動物處理指南處理小鼠。
1.2 方法
1.2.1 EPC 培養
小鼠麻醉處死后迅速置于 75% 酒精中浸泡 15 min。置于超凈臺上將小鼠雙下肢股骨、脛骨分離取出，浸泡于含胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）的磷酸緩沖鹽溶液（phophate-buffered saline，PBS）中保存。應用 1 ml 注射器沖洗出小鼠的骨髓，并收集骨髓細胞置于 15 ml 離心管中。按照 6 ml 骨髓細胞加入 4 ml 淋巴細胞分離液的比例，離心 15 min 后收集中間層白膜，PBS 洗滌細胞后應用含 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培養基進行培養。7 d 后進行傳代置于經纖連蛋白包被預處理的培養瓶中，并應用 LONZA 專用內皮細胞培養基培養 14 d 后傳代備用。相差顯微鏡觀察 EPC 形態。
1.2.2 細胞表面抗原免疫熒光檢測鑒定
選擇干細胞的表面標志 CD133 及 CD31，以及內皮細胞的表面標志 CD34 及 Flk-1 對 EPC 進行檢測鑒定。選擇傳代后第 7 d 和第 14 d 的 EPC 進行細胞表面抗原免疫熒光法鑒定。應用經人纖維連接蛋白包被的無菌載玻片作為載體，將細胞接種于含無菌載玻片的 6 孔板內，用含 10% FBS 的杜氏改良 Eagle 培養基進行培養。分別培養 3 d 后取出載玻片，并以用 4% 多聚甲醛固定 15 min，PBS 漂洗 3 次，封閉血清封閉 30 min 后，分別加入大鼠抗小鼠 CD133（1∶100）、兔抗小鼠 CD31（1∶100），以及大鼠抗小鼠 CD34（1∶100）、大鼠抗小鼠 Flk-1（1∶100）抗體于 4 ℃ 孵育過夜。第 2 d，用 PBS 漂洗 3 次后，加入羊抗大鼠 IgG-FITC 抗體（1∶400）及羊抗兔 IgG-PE 抗體（1∶200）于常溫下孵育 1 h。PBS 漂洗 2 遍后封片。于熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.2.3 Transwell 實驗檢測 EPC 遷移能力
用 50 mg/L Matrigel 膠 1∶8 稀釋液包被 Transwell 小室底部膜上室面，4 ℃ 風干。將 200 μl 槍頭的尖端剪掉，吸取纖連蛋白均勻涂抹于小室的下室面。EPC 無血清培養 12 h 后，消化離心，用含 BSA 的無血清培養基重懸。調整細胞密度至 1×105/ml，取細胞懸液 200 μl 加入 Transwell 小室，下室加入 500 μl 含 FBS 的培養基，常規培養 36 h 后，用棉簽擦去基質膠和上室內的細胞。結晶紫染色后，400 倍高倍視野下選擇 6 個視野進行拍照計數，取平均值。
1.2.4 Cell IQ 實驗
應用法國 Manual Tracking 活細胞工作系統進行細胞實時監測，并利用機器自帶的圖像分析軟件進行分析。接種 EPC 細胞并應用 Cell IQ 系統進行實時監測。Cell IQ 系統按照設定間隔時間每 15 min 自動拍照并計算細胞總數。每組包含 6 個重復圖像。
1.2.5 細胞劃痕實驗
傳代后的細胞培養 24 h 后，去除培養基，用尖端相同的 10 μl 槍頭劃直線，培養基清洗 3 次以去除刮起的漂浮細胞，加入低血清培養基（1%），放置于 Cell IQ 活細胞工作站中，每組選擇 3 個視野進行連續觀測，每隔 15 min 采集圖像 1 次，連續觀測 48 h，測量計算遷移距離并分析。每組實驗重復 6 次。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 21.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，多組差別比較應用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 小鼠 EPC 的培養及鑒定
從小鼠大腿骨和脛骨骨髓分離出單個核細胞，應用 MSC 培養基培養 7 d。如圖所示，最初細胞保持懸浮狀態，但在 7 d 內逐漸黏附貼壁。MSC 細胞傳代后，放置于經纖連蛋白包被預處理的培養瓶中，并更換培養基為內皮細胞專用培養基進行培養，7 d 后細胞逐漸分化貼壁，14 d 后細胞繼續增殖、形態為梭形或多邊形，并融合成鋪路石樣的 EPC 細胞（圖 1）。
圖1
骨髓中分離出的單個核細胞在細胞培養不同時間點的相差顯微鏡像（×200）
a. MSC 培養第 1 d；b. MSC 培養第 7 d；c. EPC 培養第 7 d；d. EPC 培養第 14 d
選擇干細胞的表面標志 CD133 及 CD31，以及內皮細胞的表面標志 CD34 及 Flk-1 分不同時間點對 EPC 進行檢測鑒定，結果發現在應用內皮細胞專用培養基培養 7 d 后細胞 CD133 及 CD31 表達陽性，隨著培養時間的延長在 14 d 時 CD34 及 Flk-1 出現表達陽性（圖 2）。上述結果提示，經 MSC 內皮分化培養后的 EPC，最初表現出干細胞特征，隨著培養的延長，逐漸表現出內皮細胞特征。
圖2
對不同時間點 EPC 進行內皮細胞表面標志物的免疫熒光鑒定
a. 免疫熒光檢測像（×400），其中綠色表示不同內皮細胞表面標志物陽性結果，藍色表示 DAPI 核染色；b. 免疫熒光檢測結果分析
2.2 在不同組別 EPC 中 AQP1 的表達驗證
對 AQP1 WT 和 KO 小鼠經第一次傳代的 EPC 細胞進行 AQP1 免疫熒光檢測結果發現，僅在 AQP1 WT 小鼠中 AQP1 表達陽性（圖 3）。
圖3
AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 細胞中 AQP1 表達的免疫 熒光檢測像（×400）
a. KO 小鼠；b. WT 小鼠
2.3 不同組別 EPC 增殖和遷移能力比較
Cell IQ 結果顯示，培養 72 h 的 AQP1 WT 小鼠與 KO 小鼠 EPC 細胞增殖數目無顯著差異（圖 4）。進一步的 Transwell 檢測結果顯示，AQP1 KO 小鼠 EPC 遷移能力較 WT 小鼠明顯減弱（圖 5）。細胞劃痕實驗檢測結果顯示，AQP1 KO 小鼠 EPC 的劃痕愈合能力明顯低于 WT 小鼠（圖 6）。
圖4
Cell IQ 檢測 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 細胞增殖能力
圖5
Transwell 檢測 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 細胞侵襲能力
a. Transwell 檢測像（×400）；b. Transwell 檢測結果分析
圖6
Cell IQ 檢測 AQP1 WT 和 KO 小鼠 EPC 細胞劃痕愈合 能力
3 討論
ALI 臨床上表現為進行性低氧血癥和呼吸窘迫，由于缺乏有效的治療措施導致其病死率高[13]。ALI 是各種直接和間接因素導致的肺泡上皮細胞及毛細血管內皮細胞損傷，造成彌漫性肺間質及肺泡水腫，導致急性低氧性呼吸功能不全，其共同的基礎是肺泡毛細血管膜急性損傷[14]。
我們前期研究發現 AQP1 在小鼠肺缺血再灌注損傷中表達增加，并且與內皮細胞標志物 CD31 共定位，AQP1 KO 小鼠肺組織有較明顯的白細胞浸潤、膠原沉積、微血管通透性增加及血管生成因子表達減少，這提示 AQP1 缺失抑制血管生成延緩了再灌注肺組織的修復過程[15]。而 EPC 是血管內皮細胞的前體細胞，在生理或病理因素刺激下，可從骨髓動員到外周血參與損傷血管的修復。AQP1 對 EPC 的增殖遷移功能是否有影響，目前未有研究。對此進行研究有助于從更早階段分析 AQP1 對損傷修復的影響，為降低 ALI 尤其是老年危重 ALI 的死亡率尋求新的治療方法。
AQP 是一類位于細胞膜上的可介導水轉運的蛋白家族。AQP1 是最早發現的 AQP 家族成員，早期發現其主要功能是介導滲透壓驅動下的跨膜水轉運，分別參與了乳汁生成、軟骨容積管理、滑液分泌、尿液濃縮、腦脊液平衡、房水平衡、膽汁分泌等多個生理及病理過程。而在呼吸系統，AQP1 參與包括氣道內氣體的水化、胎兒肺水的吸收、心力衰竭、肺損傷肺水腫的形成、各種病理條件下胸膜液體的分泌和聚集等過程。最近的研究發現，AQP1 多在全身各系統的微血管內皮細胞中表達，在損傷修復、血管生成的過程中發揮了非常重要的調節作用。Saadoun 等[16]在 2005 年發表于 Nature 的一項研究應用 AQP1 KO 小鼠和細胞培養體系，首次證明細胞膜 AQP 在血管生成和細胞遷移中發揮重要作用。內皮細胞損傷后無論從其結構還是功能等各方面都會引起一系列的改變。Mun 等[17]研究認為內皮細胞中的板式剪切力變化可以誘導 AQP1 的表達增加，該研究通過檢測內皮細胞的板式剪切力發現其可以增加 AQP1 的表達量，而應用 siRNA AQP1 處理后可以減輕內皮細胞的損傷反應。另外，AQP1 還與肝硬化患者肝血竇肝動脈毛細血管增殖相關，在對照組 AQP1 主要定位于肝門靜脈、肝小動脈、膽管區等處，肝血竇處毛細血管含量較少，而在肝硬化患者肝血竇處的內皮細胞上 AQP1 表達顯著增加，增加肝硬化的微血管抵抗[18]。而另外一項對肝硬化的研究同樣表明，在肝硬化纖維區小的血管源性的以及新生血管系統中 AQP1 表達增高，促進成纖維生長因子誘導肝臟內皮細胞動態膜起泡，從而促進其在基質中侵襲[19]。我們前期的研究也發現 AQP1 在小鼠肺缺血再灌注損傷中表達增加，并且與內皮細胞標志物 CD31 共定位，AQP1 KO 小鼠肺組織有較明顯的白細胞浸潤、膠原沉積、微血管通透性增加及血管生成因子表達減少，這提示 AQP1 缺失抑制血管生成，延緩了再灌注肺組織的修復過程。
EPC 是可以分化為成熟內皮細胞的前體細胞，參與血管生成、損傷修復等各種修復過程[6]。目前有關 EPC 的培養方法選擇眾多，可以從骨髓、臍血、外周血等來源提取并分離 EPC，而在骨髓中其含量最高。我們的研究選取了 4～6 周齡小鼠的股骨、脛骨分離獲取單核細胞，并應用特定的內皮細胞專用培養基進行誘導分化，該培養方法具有高效、簡便的特點。在我們的研究中，骨髓分離中出單個核細胞后，首先應用 MSC 培養基培養 7 d，最初細胞保持懸浮狀態，但在 7 d 內逐漸黏附貼壁。MSC 細胞傳代后，放置于經纖連蛋白包被預處理的培養瓶中，并更換培養基為內皮細胞專用培養基進行培養，7 d 后細胞逐漸分化貼壁，14 d 后細胞繼續增殖，形態為梭形或多邊形，并融合成典型的鋪路石樣的 EPC 細胞。關于 EPC 的鑒定目前也缺乏公認的金標準。綜合文獻檢索及預實驗結果[20-21]，我們選擇了細胞形態學鑒定和細胞表面抗原鑒定的方法。鑒定結果顯示，內皮分化培養后的 EPC，最初表現出 CD133 及 CD31 陽性的干細胞特征，隨著培養時間的延長，逐漸表現出 CD34 及 Flk-1 陽性的內皮細胞樣特征。
對 EPC 培養鑒定成功后，我們進一步研究了 AQP1 不同狀態下 EPC 的功能差異研究，應用 Cell IQ 技術對 EPC 進行增殖能力檢測，結果發現培養 72 h 的 AQP1 WT 小鼠與 KO 小鼠 EPC 細胞增殖數目無顯著差異。而進一步應用 Transwell 檢測發現，AQP1 KO 小鼠 EPC 遷移能力較 WT 小鼠明顯減弱，且 AQP1 KO 小鼠 EPC 的劃痕愈合能力明顯低于 WT 小鼠。結果提示 AQP1 影響可 EPC 的侵襲遷移能力而非增殖能力。該結果也與先前內皮細胞在損傷修復中 AQP1 主要影響內皮細胞遷移能力相一致。
綜上，本研究通過培養并鑒定 EPC，應用 Cell IQ、Transwell 遷移實驗及劃痕實驗比較 AQP1 WT 和 KO 小鼠中 EPC 的功能差異。研究發現 AQP1 可影響 EPC 的侵襲遷移能力而非增殖能力。本研究從更早階段分析 AQP1 對損傷修復的影響，對于 ALI 的防治具有重要意義。后續可模擬體外 ALI 缺氧復氧模型并進一步觀察 AQP1 對 EPC 的功能影響機制。
