引用本文： 甘敬華, 甘羅曼, 覃恩愿, 孟曉燕, 黎雨, 李文濤, 侯長春, 周磊, 柳廣南. 氣管狹窄肉芽組織中組蛋白去乙酰化酶 2 的表達及其與氣管狹窄的關系. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(3): 285-289. doi: 10.7507/1671-6205.201711042 復制
氣管插管廣泛應用為危急重癥患者的搶救和氣道管理提供了方便的途徑，在拯救大量患者生命的同時卻可能導致氣管狹窄的發生。氣管狹窄在氣管插管或氣管切開中的發生率為 10%～22%，而癥狀明顯或嚴重狹窄占 1%～2%，氣管狹窄在一般人群中的發病率約為 4.9/100 萬[1]。行機械通氣治療的患者氣道狹窄發生率為 9.6%，成為呼吸科常見病[2]。氣管狹窄會直接危及患者的生命安全，是呼吸介入的難題，患者雖經反復治療，效果仍欠佳。目前治療氣管插管后狹窄等良性氣管狹窄的主要方法有氣道擴張、支架置入術、熱消融、冷凍治療、電灼燒、外科手術切除狹窄段氣管并進行氣管端端吻合等。但不論是介入術還是外科手術，都是二次損傷，術后仍會造成氣管狹窄。因此，研究氣管插管后狹窄的發生發展機制，開發相關的治療藥物勢在必行。我們前期研究表明小劑量紅霉素具有抑制氣管狹窄動物模型的作用，且能降低動物血清中的致炎因子[3]。組蛋白去乙酰化酶 2（histone deacetylase 2，HDAC2）具有抑制核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）的活性，進而抑制炎癥因子的表達，小劑量紅霉素可以通過上調 HDAC2 的活性進而起到抗炎的作用[4]。在良性氣管狹窄中，HDAC2 的表達和機制未見相關研究。本研究通過建立家兔氣管狹窄模型，給予小劑量紅霉素灌胃，測量氣管狹窄度及 HDAC2 的表達，探討 HDAC2 在氣管狹窄發病中的作用機制，為防治良性氣管狹窄尋求新靶標。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和材料
家兔，雌雄不限，體重 2.0～2.5 kg，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。實驗動物生產許可證：SCXK 桂 2014-0002；實驗動物使用許可證：SYXK 桂 2014-0003。
紅霉素腸溶片（0.125 g，廣東臺城制藥股份有限公司）；鹽酸利多卡因注射液（河北天成藥業股份有限公司）；鹽酸腎上腺注射液（遠大醫藥中國有限公司）；硬質尼龍刷，直徑 5.5 mm；電動吸痰器（江蘇富林醫療設備有限公司）；總 RNA 提取試劑（TAKARA 公司的 9108 試劑盒）；RNA 逆轉錄試劑（TAKARA 公司的 RR036A 試劑盒）；PCR 試劑（TAKARA 公司的 RR820A 試劑盒）；PCR 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；鼠抗 GAPDH 單克隆抗體（Proteintech 公司）；鼠抗 HDAC2 單克隆抗體（CST 公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、蛋白上樣緩沖液、預染蛋白 Marker、一抗稀釋液、二抗稀釋液、二抗（美國 Sigma 公司）。
1.2 方法
1.2.1 實驗設計及模型建立
本實驗獲得廣西醫科大學動物倫理委員會同意，所有操作符合實驗動物處理條例。將 18 只家兔完全隨機分成空白對照組、模型組和紅霉素組，每組各 6 只，造模方法參考 Nakagishi 等[5]的方法。對模型組及紅霉素組家兔進行氣管切開，并用尼龍刷來回刷 20 余次損傷氣管內壁制作良性氣管狹窄的動物模型。術前禁食水 8 h，1.5% 戊巴比妥鈉 2 ml/kg 耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后仰臥固定于手術臺上，頸前區 8% NaS 溶液脫毛備皮，0.5% 碘伏消毒，鋪無菌孔巾，頸前正中切口切開皮膚 2～3 cm，逐層分離暴露氣管，第 4～5 氣管環間剪開 1/2 氣管周徑，用 1∶10 000 腎上腺素紗布止血，滴入 2% 利多卡因進行氣管黏膜表面麻醉，雙層 2-0 絲線穿過氣管近心端，避免損傷食管，將硬質尼龍刷伸入氣管內來回刮擦 20 余次，1∶10 000 腎上腺素止血，吸痰器吸凈血液，4-0 絲線間斷縫合氣管，逐層縫合肌肉層、皮下組織、皮膚，切口消毒，無菌紗布覆蓋，術后 2 d 切口消毒換藥。術前 7 d 至術后 9 d 模型組給予生理鹽水灌胃，紅霉素組給予小劑量紅霉素 15 mg·kg–1·d–1灌胃，空白對照組不做任何處理。術后第 10 d 處死實驗兔子，取狹窄段氣管標本，進行下一步實驗。
1.2.2 氣管狹窄度測量
取狹窄段氣管，計算氣管狹窄度（S）。S=（1－r1r2/R1R2）×100%，其中 r1 和 r2 為氣管內通氣腔的長徑和短徑，R1 和 R2 氣管軟骨圍成的環長徑和短徑。
1.2.3 Real-time PCR 檢測 HDAC2、IL-6、IL-8 mRNA 相對表達量
切取狹窄段氣管肉芽，裝入凍存管中，立即投入液氮中，然后轉移到–80 ℃ 冰箱待用。將上述肉芽組織加入 Trizol 提取總 RNA，逆轉錄成 cDNA。使用 Steponeplus 實時熒光定量 PCR 儀進行 PCR 擴增。HDAC2 的上游引物為 5’-TCC TCT CCA TCT TCA TCT CCA-3’，下游引物為 5’-TGA CAA ACC AGA ACA CTC CAG-3’，擴增片段長度 21 bp；IL-6 的上游引物為 5’-CTG GTG GTG GCT ACC GCT TTC-3’，下游引物為 5’-CTT CCG CCA GTG CCT CCT TTC-3’，擴增片段長度 21 bp；IL-8 的上游引物為 5’-CAG CAA CCT GTG TTT GAG GA-3’，下游引物為 5’-AGA GAG GCT TAC AGC CAT GC-3’，擴增片段長度 20 bp；內參 GAPDH 的上游引物為 5’-GCC CTC AAT GAC CAC TTT GT-3’，下游引物為 5’-AAA CTG TGA AGA GGG GCA GA-3’，擴增片段長度 20 bp。采用 25 μl 反應體系，按兩步法 PCR 擴增標準程序，反應條件為 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環。采用 2–ΔΔCt 法計算各組 HDAC2、IL-6、IL-8 mRNA 的相對表達量。
1.2.4 Western blot 檢測 HDAC2 蛋白的相對表達量
提取狹窄段氣管肉芽組織的總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，余下蛋白進行 100 ℃ 煮沸 5 min 至蛋白變性，室溫后放置–20 ℃ 冰箱保存備用。變性的蛋白進行 12% SDS-PAGE 凝膠電泳，再將凝膠中的蛋白濕轉到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉 TBST 封閉液封閉 1 h，分別加到不同一抗 GAPDH（1∶1 000）、HDAC2（1∶1 000）抗體中，4 ℃ 孵育過夜，0.1% TBST洗滌后予以室溫孵育二抗（1∶800），用化學發光法進行顯影，用 Alpha view 軟件對條帶進行灰度值平均值計算，得出 HDAC2 蛋白的相對半定量比值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。計量數據用均數±標準差（
±s）表示，多組均數比較采用完全隨機設計方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗。氣管狹窄度與 HDAC2 相對表達量的關系進行雙變量相關分析，采用 Pearson 積差相關系數 r 表示。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組動物氣管狹窄度
各組氣管狹窄度：空白對照組（27.00±6.44）%，模型組（84.60±1.14）%，紅霉素組（64.00±12.25）%。模型組與空白對照組比較，氣管狹窄明顯；紅霉素組與模型組比較，氣管狹窄度減輕。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。
2.2 氣管肉芽組織 HDAC2 mRNA 相對表達量
HDAC2 mRNA 相對表達量：空白對照組 1.00±0.00，模型組 0.29±0.07，紅霉素組 0.42±0.14。模型組與空白對照組比較，HDAC2 mRNA 表達下調；紅霉素組與模型組比較，HDAC2 mRNA 表達上調。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。
2.3 氣管肉芽組織 IL-6 mRNA 相對表達量
IL-6 mRNA 相對表達量：空白對照組 1.00±0.00，模型組 4.22±0.67，紅霉素組 0.72±0.24。模型組與空白對照組比較，IL-6 mRNA 表達上調；紅霉素組與模型組比較，IL-6 mRNA 表達下調。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。
2.4 氣管肉芽組織 IL-8 mRNA 相對表達量
IL-8 mRNA 相對表達量：空白對照組 1.00±0.00，模型組 162.72±23.23，紅霉素組 130.22±7.93。模型組與空白對照組比較，IL-8 mRNA 表達上調；紅霉素組與模型組比較，HDAC2 mRNA 表達下調。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。
2.5 氣管肉芽組織 HDAC2 蛋白相對表達量
HDAC2 蛋白相對表達量：空白對照組 0.49±0.04，模型組 0.20±0.02，紅霉素組 0.43±0.01。模型組與空白對照組比較，HDAC2 蛋白表達下調；紅霉素組與模型組比較，HDAC2 蛋白表達上調。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。結果見圖 1。
圖1
各組動物氣管肉芽組織 HDAC2 蛋白相對表達量
2.6 氣管狹窄度與 HDAC2 mRNA 相對表達量的相關分析
氣管狹窄度與 HDAC2 mRNA 相對表達量的 Pearson 相關系數 r=–0.96（P<0.05）。氣管狹窄度與 HDAC2 存在高度負相關關系，即氣管狹窄度越大，HDAC2 相對表達量越低。
3 討論
良性氣管狹窄，特別是氣管插管后狹窄是損傷修復引起的氣管壁成纖維細胞過度增殖，造成細胞外基質大量合成并在氣管內壁堆積造成氣管通氣腔狹窄，是氣管損傷后的異常修復，本質是一種過度的炎癥反應。氣管狹窄的形成與個體的遺傳因素、插管時間、氣管損傷程度、細菌感染、免疫因素以及全身狀況有關。細菌感染引起的炎癥過度激活是引起氣管狹窄的重要原因。Mazhar 等[6]研究表明氣管狹窄者狹窄段氣管黏膜有細菌生物膜的形成，細菌數量也比對照組顯著增加。國內研究也表明，在氣管切開術中，少量的葡萄球菌感染比沒有感染的動物更容易出現氣管狹窄[7]。以上結果均說明細菌感染與氣管狹窄發病密切相關。李莉華等[8]研究表明良性氣管狹窄者介入術后較長時間應用抗菌素可明顯降低再狹窄率，提高長期療效。我們推測細菌感染參與氣管狹窄的發生，可能不僅在于細菌本身的侵襲作用，而且在于細菌感染后細菌本身的菌體結構或死亡后的分解代謝產物作為抗原，激活了機體的免疫系統，造成局部氣道和全身炎癥反應失調。具體機制需要進一步研究。
紅霉素除了具有抗菌作用外，還具有免疫調節、抗炎等作用，長期小劑量應用大環內酯類藥物在慢性氣道炎癥性疾病如彌漫性泛支氣管炎、囊性肺纖維化取得了良好效果。目前認為主要與大環內酯類抗生素抑制中性粒細胞、上皮細胞、單核巨噬細胞炎癥轉錄因子 NF-κB 及炎癥介質釋放的作用有關[9]。大環內酯類藥物亦可減少慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）的急性加重次數，改善支氣管哮喘及支氣管擴張患者的臨床癥狀[10-14]。而小劑量紅霉素在上訴疾病中的用藥屬于超說明書用藥。小劑量是指使用量低于說明書推薦的 1 g 至 2 g[15]。本實驗按人的紅霉素用量 300 mg/d，以人體重 M人=50 kg，人體表面積 A人=1.44 m2，M兔=2.3 kg，A兔=0.18 m2估算。根據公式兔量=（人量/A人）×（A兔/M兔）算出兔的用量 15 mg·kg–1·d–1。給予氣管狹窄模型組家兔小劑量紅霉素灌胃，氣管狹窄度顯著降低，初步證實小劑紅霉素具有治療氣管狹窄的效果。但是本實驗用藥時間較短，長期療效需要下一步研究。
HDAC2 屬于Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶，是多種蛋白輔阻遏物的核心組成成分，能抑制基因的表達，其原理是通過與其他轉錄因子相互作用而富集到特異的啟動子區域從而發揮作用。炎癥基因的轉錄和調控可以活化炎癥細胞并釋放炎癥介質，其中組蛋白乙酰化和去乙酰化之間的平衡是炎癥基因轉錄的開關，去乙酰化可以抑制炎癥基因的表達[16-17]。研究表明 HDAC2 在肺部炎癥性疾病如慢阻肺、哮喘中表達下調[17-18]。良性氣管狹窄的發病過程本質也是一種氣道炎癥，我們研究結果也表明氣管狹窄動物模型氣管狹窄肉芽組組織中 HDAC2 表達是下調的，與上述研究結果一致。目前 HDAC2 的活性和表達下調的原因尚不完全清楚。在慢阻肺及體外研究發現，氧化應激和硝化應激可能與 HDAC2 下調有關，氧化應激和硝化應激能夠誘導過氧硝酸鹽的產生，進而硝化 HDAC2 的酪氨酸殘基導致其失活、泛素化和降解，氧化應激還可以激活 PI3K，進而誘導 HDAC2 的磷酸化和失活[19-20]。研究表明大鼠氣管狹窄造模 1 個月后，血清脂質過氧化物標志物丙二醛、超氧化物歧化酶表達上調，存在氧化應激，5-FU/TA 和肉毒素可能通過抑制氣管損傷修復過程中的細胞膜脂質過氧化過程，從而起到預防氣管狹窄的作用[21]。而氣管組織損傷引起的脂質過氧化可能導致了 HDAC2 的活性和表達下調。李梅華等[4]研究表明小劑量紅霉素可以活化 HDAC2 的蛋白表達，進而抑制 NF-κB 的活性，從而抑制炎癥介質表達量的下降。而本研究團隊前期研究也表明小劑量紅霉素具有抑制氣管狹窄動物模型的作用，且能降低動物血清中的致炎因子[3]。因此，我們推斷小劑量紅霉素通過提高 HDAC2 的蛋白表達進而抑制 NF-κB 的活性，但仍需進一步證實。
本研究結果顯示，氣管狹窄實驗家兔模型與空白對照組比較，氣管肉芽組織 HDAC2 mRNA 和蛋白表達下調，IL-6、IL-8 mRNA 的相對表達量上調；紅霉素組與模型組比較，HDAC2 mRNA 和蛋白表達上調，IL-6 和 IL-8 mRNA 的相對表達量下調，同時氣管狹窄度減輕；相關分析顯示氣管狹窄度與 HDAC2 存在高度負相關關系，即氣管狹窄度越大，HDAC2 相對表達量越低。結果表明良性氣管狹窄動物模型中 HDAC2 表達下調，造成局部炎癥反應失調，促進了氣管狹窄的發生發展；小劑量紅霉素具有治療良性氣管狹窄的作用，可能是小劑量紅霉素上調 HDAC2 的表達，進而抑制氣管損傷修復時的炎癥失調有關。而氣道狹窄患者的肉芽組織中 HDAC2 表達是否下調，是否與本動物實驗研究結果相一致，小劑量紅霉素對臨床氣管狹窄患者的治療效果等將是我們下一步研究的重點。
氣管插管廣泛應用為危急重癥患者的搶救和氣道管理提供了方便的途徑，在拯救大量患者生命的同時卻可能導致氣管狹窄的發生。氣管狹窄在氣管插管或氣管切開中的發生率為 10%～22%，而癥狀明顯或嚴重狹窄占 1%～2%，氣管狹窄在一般人群中的發病率約為 4.9/100 萬[1]。行機械通氣治療的患者氣道狹窄發生率為 9.6%，成為呼吸科常見病[2]。氣管狹窄會直接危及患者的生命安全，是呼吸介入的難題，患者雖經反復治療，效果仍欠佳。目前治療氣管插管后狹窄等良性氣管狹窄的主要方法有氣道擴張、支架置入術、熱消融、冷凍治療、電灼燒、外科手術切除狹窄段氣管并進行氣管端端吻合等。但不論是介入術還是外科手術，都是二次損傷，術后仍會造成氣管狹窄。因此，研究氣管插管后狹窄的發生發展機制，開發相關的治療藥物勢在必行。我們前期研究表明小劑量紅霉素具有抑制氣管狹窄動物模型的作用，且能降低動物血清中的致炎因子[3]。組蛋白去乙酰化酶 2（histone deacetylase 2，HDAC2）具有抑制核因子-κB （nuclear factor-κB，NF-κB）的活性，進而抑制炎癥因子的表達，小劑量紅霉素可以通過上調 HDAC2 的活性進而起到抗炎的作用[4]。在良性氣管狹窄中，HDAC2 的表達和機制未見相關研究。本研究通過建立家兔氣管狹窄模型，給予小劑量紅霉素灌胃，測量氣管狹窄度及 HDAC2 的表達，探討 HDAC2 在氣管狹窄發病中的作用機制，為防治良性氣管狹窄尋求新靶標。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和材料
家兔，雌雄不限，體重 2.0～2.5 kg，由廣西醫科大學動物實驗中心提供。實驗動物生產許可證：SCXK 桂 2014-0002；實驗動物使用許可證：SYXK 桂 2014-0003。
紅霉素腸溶片（0.125 g，廣東臺城制藥股份有限公司）；鹽酸利多卡因注射液（河北天成藥業股份有限公司）；鹽酸腎上腺注射液（遠大醫藥中國有限公司）；硬質尼龍刷，直徑 5.5 mm；電動吸痰器（江蘇富林醫療設備有限公司）；總 RNA 提取試劑（TAKARA 公司的 9108 試劑盒）；RNA 逆轉錄試劑（TAKARA 公司的 RR036A 試劑盒）；PCR 試劑（TAKARA 公司的 RR820A 試劑盒）；PCR 引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成；鼠抗 GAPDH 單克隆抗體（Proteintech 公司）；鼠抗 HDAC2 單克隆抗體（CST 公司）；蛋白提取試劑盒、BCA 蛋白濃度測定試劑盒、蛋白上樣緩沖液、預染蛋白 Marker、一抗稀釋液、二抗稀釋液、二抗（美國 Sigma 公司）。
1.2 方法
1.2.1 實驗設計及模型建立
本實驗獲得廣西醫科大學動物倫理委員會同意，所有操作符合實驗動物處理條例。將 18 只家兔完全隨機分成空白對照組、模型組和紅霉素組，每組各 6 只，造模方法參考 Nakagishi 等[5]的方法。對模型組及紅霉素組家兔進行氣管切開，并用尼龍刷來回刷 20 余次損傷氣管內壁制作良性氣管狹窄的動物模型。術前禁食水 8 h，1.5% 戊巴比妥鈉 2 ml/kg 耳緣靜脈注射麻醉，麻醉后仰臥固定于手術臺上，頸前區 8% NaS 溶液脫毛備皮，0.5% 碘伏消毒，鋪無菌孔巾，頸前正中切口切開皮膚 2～3 cm，逐層分離暴露氣管，第 4～5 氣管環間剪開 1/2 氣管周徑，用 1∶10 000 腎上腺素紗布止血，滴入 2% 利多卡因進行氣管黏膜表面麻醉，雙層 2-0 絲線穿過氣管近心端，避免損傷食管，將硬質尼龍刷伸入氣管內來回刮擦 20 余次，1∶10 000 腎上腺素止血，吸痰器吸凈血液，4-0 絲線間斷縫合氣管，逐層縫合肌肉層、皮下組織、皮膚，切口消毒，無菌紗布覆蓋，術后 2 d 切口消毒換藥。術前 7 d 至術后 9 d 模型組給予生理鹽水灌胃，紅霉素組給予小劑量紅霉素 15 mg·kg–1·d–1灌胃，空白對照組不做任何處理。術后第 10 d 處死實驗兔子，取狹窄段氣管標本，進行下一步實驗。
1.2.2 氣管狹窄度測量
取狹窄段氣管，計算氣管狹窄度（S）。S=（1－r1r2/R1R2）×100%，其中 r1 和 r2 為氣管內通氣腔的長徑和短徑，R1 和 R2 氣管軟骨圍成的環長徑和短徑。
1.2.3 Real-time PCR 檢測 HDAC2、IL-6、IL-8 mRNA 相對表達量
切取狹窄段氣管肉芽，裝入凍存管中，立即投入液氮中，然后轉移到–80 ℃ 冰箱待用。將上述肉芽組織加入 Trizol 提取總 RNA，逆轉錄成 cDNA。使用 Steponeplus 實時熒光定量 PCR 儀進行 PCR 擴增。HDAC2 的上游引物為 5’-TCC TCT CCA TCT TCA TCT CCA-3’，下游引物為 5’-TGA CAA ACC AGA ACA CTC CAG-3’，擴增片段長度 21 bp；IL-6 的上游引物為 5’-CTG GTG GTG GCT ACC GCT TTC-3’，下游引物為 5’-CTT CCG CCA GTG CCT CCT TTC-3’，擴增片段長度 21 bp；IL-8 的上游引物為 5’-CAG CAA CCT GTG TTT GAG GA-3’，下游引物為 5’-AGA GAG GCT TAC AGC CAT GC-3’，擴增片段長度 20 bp；內參 GAPDH 的上游引物為 5’-GCC CTC AAT GAC CAC TTT GT-3’，下游引物為 5’-AAA CTG TGA AGA GGG GCA GA-3’，擴增片段長度 20 bp。采用 25 μl 反應體系，按兩步法 PCR 擴增標準程序，反應條件為 95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共 40 個循環。采用 2–ΔΔCt 法計算各組 HDAC2、IL-6、IL-8 mRNA 的相對表達量。
1.2.4 Western blot 檢測 HDAC2 蛋白的相對表達量
提取狹窄段氣管肉芽組織的總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度后，余下蛋白進行 100 ℃ 煮沸 5 min 至蛋白變性，室溫后放置–20 ℃ 冰箱保存備用。變性的蛋白進行 12% SDS-PAGE 凝膠電泳，再將凝膠中的蛋白濕轉到 PVDF 膜上，用 5% 脫脂奶粉 TBST 封閉液封閉 1 h，分別加到不同一抗 GAPDH（1∶1 000）、HDAC2（1∶1 000）抗體中，4 ℃ 孵育過夜，0.1% TBST洗滌后予以室溫孵育二抗（1∶800），用化學發光法進行顯影，用 Alpha view 軟件對條帶進行灰度值平均值計算，得出 HDAC2 蛋白的相對半定量比值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。計量數據用均數±標準差（
±s）表示，多組均數比較采用完全隨機設計方差分析，兩兩比較采用 SNK 檢驗。氣管狹窄度與 HDAC2 相對表達量的關系進行雙變量相關分析，采用 Pearson 積差相關系數 r 表示。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組動物氣管狹窄度
各組氣管狹窄度：空白對照組（27.00±6.44）%，模型組（84.60±1.14）%，紅霉素組（64.00±12.25）%。模型組與空白對照組比較，氣管狹窄明顯；紅霉素組與模型組比較，氣管狹窄度減輕。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。
2.2 氣管肉芽組織 HDAC2 mRNA 相對表達量
HDAC2 mRNA 相對表達量：空白對照組 1.00±0.00，模型組 0.29±0.07，紅霉素組 0.42±0.14。模型組與空白對照組比較，HDAC2 mRNA 表達下調；紅霉素組與模型組比較，HDAC2 mRNA 表達上調。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。
2.3 氣管肉芽組織 IL-6 mRNA 相對表達量
IL-6 mRNA 相對表達量：空白對照組 1.00±0.00，模型組 4.22±0.67，紅霉素組 0.72±0.24。模型組與空白對照組比較，IL-6 mRNA 表達上調；紅霉素組與模型組比較，IL-6 mRNA 表達下調。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。
2.4 氣管肉芽組織 IL-8 mRNA 相對表達量
IL-8 mRNA 相對表達量：空白對照組 1.00±0.00，模型組 162.72±23.23，紅霉素組 130.22±7.93。模型組與空白對照組比較，IL-8 mRNA 表達上調；紅霉素組與模型組比較，HDAC2 mRNA 表達下調。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。
2.5 氣管肉芽組織 HDAC2 蛋白相對表達量
HDAC2 蛋白相對表達量：空白對照組 0.49±0.04，模型組 0.20±0.02，紅霉素組 0.43±0.01。模型組與空白對照組比較，HDAC2 蛋白表達下調；紅霉素組與模型組比較，HDAC2 蛋白表達上調。差異均有統計學意義（均 P<0.05）。結果見圖 1。
圖1
各組動物氣管肉芽組織 HDAC2 蛋白相對表達量
2.6 氣管狹窄度與 HDAC2 mRNA 相對表達量的相關分析
氣管狹窄度與 HDAC2 mRNA 相對表達量的 Pearson 相關系數 r=–0.96（P<0.05）。氣管狹窄度與 HDAC2 存在高度負相關關系，即氣管狹窄度越大，HDAC2 相對表達量越低。
3 討論
良性氣管狹窄，特別是氣管插管后狹窄是損傷修復引起的氣管壁成纖維細胞過度增殖，造成細胞外基質大量合成并在氣管內壁堆積造成氣管通氣腔狹窄，是氣管損傷后的異常修復，本質是一種過度的炎癥反應。氣管狹窄的形成與個體的遺傳因素、插管時間、氣管損傷程度、細菌感染、免疫因素以及全身狀況有關。細菌感染引起的炎癥過度激活是引起氣管狹窄的重要原因。Mazhar 等[6]研究表明氣管狹窄者狹窄段氣管黏膜有細菌生物膜的形成，細菌數量也比對照組顯著增加。國內研究也表明，在氣管切開術中，少量的葡萄球菌感染比沒有感染的動物更容易出現氣管狹窄[7]。以上結果均說明細菌感染與氣管狹窄發病密切相關。李莉華等[8]研究表明良性氣管狹窄者介入術后較長時間應用抗菌素可明顯降低再狹窄率，提高長期療效。我們推測細菌感染參與氣管狹窄的發生，可能不僅在于細菌本身的侵襲作用，而且在于細菌感染后細菌本身的菌體結構或死亡后的分解代謝產物作為抗原，激活了機體的免疫系統，造成局部氣道和全身炎癥反應失調。具體機制需要進一步研究。
紅霉素除了具有抗菌作用外，還具有免疫調節、抗炎等作用，長期小劑量應用大環內酯類藥物在慢性氣道炎癥性疾病如彌漫性泛支氣管炎、囊性肺纖維化取得了良好效果。目前認為主要與大環內酯類抗生素抑制中性粒細胞、上皮細胞、單核巨噬細胞炎癥轉錄因子 NF-κB 及炎癥介質釋放的作用有關[9]。大環內酯類藥物亦可減少慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）的急性加重次數，改善支氣管哮喘及支氣管擴張患者的臨床癥狀[10-14]。而小劑量紅霉素在上訴疾病中的用藥屬于超說明書用藥。小劑量是指使用量低于說明書推薦的 1 g 至 2 g[15]。本實驗按人的紅霉素用量 300 mg/d，以人體重 M人=50 kg，人體表面積 A人=1.44 m2，M兔=2.3 kg，A兔=0.18 m2估算。根據公式兔量=（人量/A人）×（A兔/M兔）算出兔的用量 15 mg·kg–1·d–1。給予氣管狹窄模型組家兔小劑量紅霉素灌胃，氣管狹窄度顯著降低，初步證實小劑紅霉素具有治療氣管狹窄的效果。但是本實驗用藥時間較短，長期療效需要下一步研究。
HDAC2 屬于Ⅰ類組蛋白去乙酰化酶，是多種蛋白輔阻遏物的核心組成成分，能抑制基因的表達，其原理是通過與其他轉錄因子相互作用而富集到特異的啟動子區域從而發揮作用。炎癥基因的轉錄和調控可以活化炎癥細胞并釋放炎癥介質，其中組蛋白乙酰化和去乙酰化之間的平衡是炎癥基因轉錄的開關，去乙酰化可以抑制炎癥基因的表達[16-17]。研究表明 HDAC2 在肺部炎癥性疾病如慢阻肺、哮喘中表達下調[17-18]。良性氣管狹窄的發病過程本質也是一種氣道炎癥，我們研究結果也表明氣管狹窄動物模型氣管狹窄肉芽組組織中 HDAC2 表達是下調的，與上述研究結果一致。目前 HDAC2 的活性和表達下調的原因尚不完全清楚。在慢阻肺及體外研究發現，氧化應激和硝化應激可能與 HDAC2 下調有關，氧化應激和硝化應激能夠誘導過氧硝酸鹽的產生，進而硝化 HDAC2 的酪氨酸殘基導致其失活、泛素化和降解，氧化應激還可以激活 PI3K，進而誘導 HDAC2 的磷酸化和失活[19-20]。研究表明大鼠氣管狹窄造模 1 個月后，血清脂質過氧化物標志物丙二醛、超氧化物歧化酶表達上調，存在氧化應激，5-FU/TA 和肉毒素可能通過抑制氣管損傷修復過程中的細胞膜脂質過氧化過程，從而起到預防氣管狹窄的作用[21]。而氣管組織損傷引起的脂質過氧化可能導致了 HDAC2 的活性和表達下調。李梅華等[4]研究表明小劑量紅霉素可以活化 HDAC2 的蛋白表達，進而抑制 NF-κB 的活性，從而抑制炎癥介質表達量的下降。而本研究團隊前期研究也表明小劑量紅霉素具有抑制氣管狹窄動物模型的作用，且能降低動物血清中的致炎因子[3]。因此，我們推斷小劑量紅霉素通過提高 HDAC2 的蛋白表達進而抑制 NF-κB 的活性，但仍需進一步證實。
本研究結果顯示，氣管狹窄實驗家兔模型與空白對照組比較，氣管肉芽組織 HDAC2 mRNA 和蛋白表達下調，IL-6、IL-8 mRNA 的相對表達量上調；紅霉素組與模型組比較，HDAC2 mRNA 和蛋白表達上調，IL-6 和 IL-8 mRNA 的相對表達量下調，同時氣管狹窄度減輕；相關分析顯示氣管狹窄度與 HDAC2 存在高度負相關關系，即氣管狹窄度越大，HDAC2 相對表達量越低。結果表明良性氣管狹窄動物模型中 HDAC2 表達下調，造成局部炎癥反應失調，促進了氣管狹窄的發生發展；小劑量紅霉素具有治療良性氣管狹窄的作用，可能是小劑量紅霉素上調 HDAC2 的表達，進而抑制氣管損傷修復時的炎癥失調有關。而氣道狹窄患者的肉芽組織中 HDAC2 表達是否下調，是否與本動物實驗研究結果相一致，小劑量紅霉素對臨床氣管狹窄患者的治療效果等將是我們下一步研究的重點。
