引用本文： 劉峰, 周向東, 余紅梅, 李琪, 鐘有清. Elafin 對氣道上皮細胞黏蛋白 5AC 的調節作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(3): 296-300. doi: 10.7507/1671-6205.201711009 復制
氣道黏液高分泌是慢性氣道炎癥的重要病理特征之一，同時也是目前呼吸系統疾病方面函待解決的重要問題之一[1]。氣道病理性黏液產生的主要原因是黏蛋白的過度表達，氣道黏蛋白（mucin，MUC）的主要病理表型為 MUC5AC[2-3]。MUC5AC 是氣道內主要的分泌型 MUC，同時也是超負荷生成病理性黏液中的重要成分。有研究表明，天然內生多肽 Elafin 可以抑制轉錄激活蛋白-1（activator protein 1，AP-1）的上調，以及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的 DNA 結合活性[4-6]。MUC5AC 的轉錄啟動與增強與 AP-1、NF-κB 及特殊蛋白-1 等轉錄因子緊密相關[7-8]。本研究選用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及香煙做為實驗刺激因素來誘導氣道黏液的高分泌，探討 Elafin 對氣道上皮細胞 MUC5AC 的調節作用，以期為氣道黏液高分泌的臨床治療提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞
16HBE 人氣道上皮細胞株購自上海復祥生物科技有限公司。
1.1.2 主要試劑
pEGFP-N1-Elafin（重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科楊捷博士提供[9]）；從銅綠假單胞菌提取的 LPS（美國 Sigma 公司）；胃黏蛋白標準品（美國 Sigma 公司）；鼠抗 MUC5AC 單克隆抗體（MAB2011，美國 CHEMICON 公司）；異硫氰酸標記的羊抗鼠熒光素 IgG、辣根酶標記羊抗兔及鼠 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；ELISA 試劑盒（武漢博士德公司）；RPMI 1640 培養基（美國 Gibco 公司）；胎牛血清（美國 Gibco 公司）；RIPA 蛋白裂解液（北京碧云天生物技術研究所）；4% 的多聚甲醛。
1.2 方法
1.2.1 細胞的培養
將人氣道上皮細胞 16HBE 細胞放置于 6 孔培養板中培養，每孔約為 4×105～5×105個細胞，再加入 2 ml 含 10% 小牛血清 RPMI 1640 培養液，于 37 ℃、50% CO2、飽和濕度培養箱孵育，進行常規換液培養，細胞融合至 70%～80% 時傳代。
1.2.2 香煙煙霧提取物（CSE）的制備
用燃燒的駱駝牌香煙，采用注射器驅動裝置，以 1 吸噴周期/min的速率進行連續抽吸（35 ml/吸噴周期）。吸入的煙霧經過三通管，緩慢注入 20 ml 含 50 mmol/L HEPES 的 RPMI 1640 培養液中制做成懸液，密封于瓶內搖動使其充分溶解，滴定至 pH=7.4。經過 0.22 μm 醋酸纖維過濾除菌，存于冰中。使用前將過濾裝置在 37 ℃、5% CO2 的條件下孵育 1 h，并使用無血清培養基，將該懸液配制成最終濃度為 1 g/L（每升含有 1 g 煙霧微粒）的工作液。
1.2.3 MTT 法選取最佳的 LPS 及 CSE 濃度
（1）MTT 液配置：取 MTT 50 mg，加入 10 ml PBS 液（0.01 mmol/L，pH 7.4），震蕩攪拌直至充分溶解，經過 0.22 μm 的針頭式微孔濾器進行過濾除菌，于–4 ℃ 保存。（2）測定不同濃度 LPS 及 CSE 對細胞活力的影響：16HBE 細胞培養于 96 孔板上，按照密度約為 1×104/ml 每孔加入 200 μl 的細胞懸液，再常規培養至 70%～80% 后，換成新鮮無血清培養液繼續培養，于 24 h 后換液，加入不同濃度的刺激因素，即 1、5、10、20 μg/ml 的 LPS，以及 0.25、0.5、1、2 g/L 的 CSE。設定未加任何刺激因素，而僅加培養液的細胞為對照。取 8、16、24 及 36 h 時間點進行 MTT 測定。棄去培養液，加入 20 μl MTT 液，以及 200 μl 無血清 RPMI 1640 培養液，再繼續培養 4 h 后，每孔加入 150 μl 二甲基亞砜。于室溫下振蕩 15 min，在自動酶標儀上以 570 nm 波長測定各孔吸光度值（A）。
1.2.4 LPS 刺激組細胞分組
在 6 孔板中培養 16HBE細胞，待細胞融合至 70%～80% 時開始傳代，將細胞分為 4 組，每組 3 個復孔。（1）對照組：在無胎牛血清、無雙抗的 1640 培養基中繼續培養細胞；（2）LPS 刺激組：在無血清培養液中加入最終濃度為 10 μg/ml 的 LPS；（3）LPS+Elafin 組：用 0.4 μmol/LpEGFP-N1-Elafin 刺激，于 24 h 后加入最終濃度為 10 μg/ml 的 LPS；（4）Elafin 組：用 0.4 μmol/L pEGFP-N1-Elafin刺激 24 h。繼續培養 24 h 后，分別收集上清和細胞進行檢測，每組實驗重復進行 6 次。
1.2.5 CSE 刺激組細胞分組
在 6 孔板中培養 16HBE 細胞，待細胞融合至 70%～80% 時開始傳代，將細胞分為 4 組，每組有 3 個復孔。（1）對照組：在無胎牛血清、無雙抗的 1640 培養基中繼續培養細胞；（2）CSE 刺激組：在無血清培養液中加入最終濃度為 1 g/L 的 CSE；（3）CSE+Elafin 組：用 0.4 μmol/LpEGFP-N1-Elafin 刺激，于 24 h 后加入最終濃度為 1 g/L 的 CSE；（4）Elafin 組：用 0.4 μmol/L pEGFP-N1-Elafin 刺激 24 h。繼續培養 24 h 后，分別收集上清和細胞進行檢測，每組實驗重復 6 次。
1.2.6 細胞免疫熒光法觀察胞內 MUC5AC 的蛋白表達
（1）多次清洗載玻片與血蓋片，經泡酸、高溫、高壓以消毒滅菌。（2）將各組處于對數生長期的 16HBE 細胞消化后，行細胞計數，并接種到裝有蓋片的 24 孔板中，每孔接種的細胞數約為 1×105個，培養 24 h 后，改用無血清培養基，繼續培養 24 h 后行進行分組培養。（3）棄去培養液，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（4）加入 4% 多聚甲醛，在室溫下固定 30 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（5）在室溫下，使用 0.4% Triton-X 100 反應 20 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（6）在室溫下，加入羊血清工作液，進行非特異性封閉 30 min。（7）棄去羊血清工作液，加入一抗為小鼠抗人 MUC5AC 單克隆抗體（1∶500），于濕盒內 4 ℃ 過夜，次日使用 0.01 mol/LPBS 漂洗 3×5 min/次。（8）加入二抗為異硫氰酸標記的羊抗鼠 IgG（1∶50），于室溫下置暗盒內孵育 30 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（9）用少許的 50% 甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
1.2.7 ELISA 法檢測細胞分泌的 MUC5AC 的蛋白含量
細胞采用預冷的 0.01 mmol/L 的 PBS 清洗（于冰上操作），加入 RIPA 裂解液（冰預冷），以及相應的 1/100 量苯甲基磺酰氟化物，輕輕晃動吹打后，轉到 Eppendorf 管中冰浴 20 min。于 4 ℃ 離心 15 000 r/min×20 min，然后取出上清液。取少許的各種樣本，采用二喹啉甲酸法測定其總蛋白含量。用 RIPA 裂解液調整蛋白濃度，以使各樣本一致，然后用 PBS 稀釋蛋白樣本。取出各樣本 100 μl，加入 96 孔酶標板，再置于 4 ℃ 的濕盒中過夜。小牛血清室溫下封閉 1 h，分別加入小鼠抗 MUC5AC 單克隆抗體 45M1（1∶100，使用含 0.05% Tween-20 的 PBS 稀釋至 50 μl）孵育 1 h，然后加入 100 μl 辣根過氧化物酶-羊抗小鼠 IgG（1∶10 000），孵育 1 h，經過四甲基聯苯胺過氧化物酶顯色后，測出各孔吸光度值（450 nm），并與標準品比較，得出 MUC5AC 的相對值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行分析。根據方差齊性與否，分別采用參數檢驗與非參數檢驗，即齊性資料用單因素方差分析（ANOVA），結果用均數±標準差（
±s）表示，兩兩比較采用 LSD 檢驗，非齊性資料用秩和檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度 LPS 對細胞增殖活力的影響
細胞經過 LPS 處理后，1、5 及 10 μg/ml 的濃度組，在各自時間點比較，增殖活力無明顯改變。當濃度增加至 2 μg/ml 時，從第 16 h 起吸光度值開始降低，為 0.176±0.006，與正常對照組以及其他濃度組比較，差異有統計學意義（均 P<0.05）。與其他組比較，在 24 h 和 36 h 的吸光度值明顯降低（均P<0.01）。結果見表 1。
表1
MTT 檢測不同濃度 LPS 刺激對細胞增殖活力的影響（n=6，
）
2.2 不同濃度 CSE 對細胞增殖活力的影響
細胞經過 CSE 處理后，將 0.25、0.5 及 1 g/L 的濃度組在各自的時間點相比，增殖活力無明顯改變。但是當濃度增加到 2 g/L 時，第 16 h 起，吸光度值開始出現降低，為 0.190±0.005，與正常對照組以及其他濃度組對比，差異有統計學意義（均 P<0.05）。與其他組比較，在 24 h 和 36 h 的吸光度值有明顯降低（均P<0.01）。結果見表 2。
表2
MTT 檢測不同濃度 CSE 刺激對細胞增殖活力的影響（n=6，
）
2.3 Elafin 對 LPS 及 CSE 誘導的 MUC5AC 胞內蛋白生成的影響
與對照組比較，LPS 刺激組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量明顯增多。在 LPS 刺激前予 Elafin 預處理組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量低于單純的 LPS 刺激組。與對照組比較，單純予 Elafin 處理組細胞內的 MUC5AC 表達量顯著降低。結果見圖 1。
圖1
LPS 及 Elafin 對 MUC5AC 胞內蛋白含量的影響
a. 對照組；b. LPS 處理組；c. LPS+Elafin 處理組；d. Elafin 處理組
與對照組比較，CSE 刺激組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量顯著增多。在 CSE 刺激前予 Elafin 預處理組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量低于單純的 CSE 刺激組。與對照組比較，單純予 Elafin 處理組細胞內的 MUC5AC 表達量顯著降低。結果見圖 2。
圖2
CSE 及 Elafin 對 MUC5AC 胞內蛋白含量的影響
a. 對照組；b. CSE 處理組；c. CSE+Elafin 處理組；d. Elafin 處理組
2.4 Elafin 對 LPS 及 CSE 誘導的 MUC5AC 蛋白分泌量的影響
與對照組比較，LPS 刺激組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平顯著增高（P<0.01）。在 LPS 刺激前予 Elafin 預處理組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明顯低于單純的 LPS 刺激組（P<0.01）。與對照組比較，單純予 Elafin 處理組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平顯著降低（P<0.05）。結果見表 3。
表3
LPS 及 Elafin 對 MUC5AC 蛋白分泌量的影響（n=6，
，μg/ml）
與對照組比較，CSE 刺激組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明顯增高，差異有統計學意義（P<0.01）。在 CSE 刺激前予 Elafin 預處理組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明顯低于單純的 CSE 處理組（P<0.01）。與對照組比較，單純予 Elafin 處理組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 4。
表4
CSE 及 Elafin 對 MUC5AC 蛋白分泌量的影響（n=6，
，μg/ml）
3 討論
Elafin 是近年來發現的一種小分子（相對分子質量 9 900）抗彈力酶特異性保護因子[10-11]。呼吸道 Elafin 主要由肺泡上皮細胞、Clara 細胞及肺泡巨噬細胞產生[12]，具有保護細胞外基質以及上皮細胞免于受中性粒細胞彈性蛋白酶溶解破壞的重要作用，并且顯示出優良的抗菌作用，以及對陽離子蛋白酶的抑制作用[13-14]。Elafin 的這種多重有益效應以及其分子量小、穿透性好的特點，使其成為治療慢性氣道炎癥的一種極其具希望和潛質的候選靶物質。因此，獲取人工重組 Elafin 對于慢性氣道炎癥性疾病的治療極其具有研究價值。
Elafin 具有的抗蛋白酶性使其在氣道黏液高分泌的治療中具有突出的優勢[15]。既往對 Elafin 的研究多立足于其抗感染、抗蛋白酶等細胞外的作用上。本研究通過培養氣道上皮細胞，采用 CSE 及 LPS 作為刺激因素，使用細胞免疫熒光法及 ELISA 法，分別檢測各組氣道上皮細胞 MUC5AC 的胞內蛋白及胞外蛋白分泌的表達情況。結果顯示，與對照組比較，LPS 及 CSE 刺激組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平明顯增多，在 LPS 及 CES 刺激前予 Elafin 預處理組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平低于單純 LPS 及單純 CES 刺激組，而單純予 Elafin 處理組細胞內的 MUC5AC 表達量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平顯著降低。因此，LPS 及 CSE 可以誘導炎癥介質的產生，進而上調 MUC5AC 的胞內蛋白及分泌到胞外的蛋白的含量，從而促進慢性氣道炎癥的形成；而以 Elafin 進行干預可以明顯降低 LPS 及 CSE 上調的上述指標水平。因此，可以得出結論，CSE 及 LPS 可增加 MUC5AC 的合成及分泌，而 Elafin 可顯著抑制 CSE 及 LPS 的上述效應；Elafin 可以通過阻斷氣道黏蛋白的生成及分泌，從而達到抑制氣道黏液高分泌的目的。
本實驗選擇 MUC5AC 作為炎癥反應強度的指標，是因為 MUC5AC 是氣道黏液中最重要的黏蛋白，而許多氣道黏液高分泌疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、支氣管擴張等的病理生理改變都與其密切相關[16-17]。由于 MUC5AC 與慢性阻塞性肺疾病等慢性氣道炎癥疾病患者的病情進展和預后緊密相關，故本實驗著重觀察 Elafin 與 MUC5AC 的胞內蛋白及分泌到胞外的蛋白的關系，結果進一步提示 Elafin 可顯著遏制 MUC5AC 的合成及分泌，從而降低了 MUC5AC 的病理性表達[18]。
目前國內外針對 Elafin 對氣道黏液高分泌影響方面的研究不多，本研究在之前研究[19]的基礎上進一步確認了 Elafin 在治療氣道黏液高分泌方面的積極效應，從而提示其在氣道黏液高分泌的調控領域中可能發揮重要作用。因此，Elafin 純化的表達產物在氣道局部的治療中將有較為廣闊的臨床應用前景。
氣道黏液高分泌是慢性氣道炎癥的重要病理特征之一，同時也是目前呼吸系統疾病方面函待解決的重要問題之一[1]。氣道病理性黏液產生的主要原因是黏蛋白的過度表達，氣道黏蛋白（mucin，MUC）的主要病理表型為 MUC5AC[2-3]。MUC5AC 是氣道內主要的分泌型 MUC，同時也是超負荷生成病理性黏液中的重要成分。有研究表明，天然內生多肽 Elafin 可以抑制轉錄激活蛋白-1（activator protein 1，AP-1）的上調，以及核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）的 DNA 結合活性[4-6]。MUC5AC 的轉錄啟動與增強與 AP-1、NF-κB 及特殊蛋白-1 等轉錄因子緊密相關[7-8]。本研究選用脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及香煙做為實驗刺激因素來誘導氣道黏液的高分泌，探討 Elafin 對氣道上皮細胞 MUC5AC 的調節作用，以期為氣道黏液高分泌的臨床治療提供新的思路。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 細胞
16HBE 人氣道上皮細胞株購自上海復祥生物科技有限公司。
1.1.2 主要試劑
pEGFP-N1-Elafin（重慶醫科大學附屬第二醫院呼吸內科楊捷博士提供[9]）；從銅綠假單胞菌提取的 LPS（美國 Sigma 公司）；胃黏蛋白標準品（美國 Sigma 公司）；鼠抗 MUC5AC 單克隆抗體（MAB2011，美國 CHEMICON 公司）；異硫氰酸標記的羊抗鼠熒光素 IgG、辣根酶標記羊抗兔及鼠 IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司）；ELISA 試劑盒（武漢博士德公司）；RPMI 1640 培養基（美國 Gibco 公司）；胎牛血清（美國 Gibco 公司）；RIPA 蛋白裂解液（北京碧云天生物技術研究所）；4% 的多聚甲醛。
1.2 方法
1.2.1 細胞的培養
將人氣道上皮細胞 16HBE 細胞放置于 6 孔培養板中培養，每孔約為 4×105～5×105個細胞，再加入 2 ml 含 10% 小牛血清 RPMI 1640 培養液，于 37 ℃、50% CO2、飽和濕度培養箱孵育，進行常規換液培養，細胞融合至 70%～80% 時傳代。
1.2.2 香煙煙霧提取物（CSE）的制備
用燃燒的駱駝牌香煙，采用注射器驅動裝置，以 1 吸噴周期/min的速率進行連續抽吸（35 ml/吸噴周期）。吸入的煙霧經過三通管，緩慢注入 20 ml 含 50 mmol/L HEPES 的 RPMI 1640 培養液中制做成懸液，密封于瓶內搖動使其充分溶解，滴定至 pH=7.4。經過 0.22 μm 醋酸纖維過濾除菌，存于冰中。使用前將過濾裝置在 37 ℃、5% CO2 的條件下孵育 1 h，并使用無血清培養基，將該懸液配制成最終濃度為 1 g/L（每升含有 1 g 煙霧微粒）的工作液。
1.2.3 MTT 法選取最佳的 LPS 及 CSE 濃度
（1）MTT 液配置：取 MTT 50 mg，加入 10 ml PBS 液（0.01 mmol/L，pH 7.4），震蕩攪拌直至充分溶解，經過 0.22 μm 的針頭式微孔濾器進行過濾除菌，于–4 ℃ 保存。（2）測定不同濃度 LPS 及 CSE 對細胞活力的影響：16HBE 細胞培養于 96 孔板上，按照密度約為 1×104/ml 每孔加入 200 μl 的細胞懸液，再常規培養至 70%～80% 后，換成新鮮無血清培養液繼續培養，于 24 h 后換液，加入不同濃度的刺激因素，即 1、5、10、20 μg/ml 的 LPS，以及 0.25、0.5、1、2 g/L 的 CSE。設定未加任何刺激因素，而僅加培養液的細胞為對照。取 8、16、24 及 36 h 時間點進行 MTT 測定。棄去培養液，加入 20 μl MTT 液，以及 200 μl 無血清 RPMI 1640 培養液，再繼續培養 4 h 后，每孔加入 150 μl 二甲基亞砜。于室溫下振蕩 15 min，在自動酶標儀上以 570 nm 波長測定各孔吸光度值（A）。
1.2.4 LPS 刺激組細胞分組
在 6 孔板中培養 16HBE細胞，待細胞融合至 70%～80% 時開始傳代，將細胞分為 4 組，每組 3 個復孔。（1）對照組：在無胎牛血清、無雙抗的 1640 培養基中繼續培養細胞；（2）LPS 刺激組：在無血清培養液中加入最終濃度為 10 μg/ml 的 LPS；（3）LPS+Elafin 組：用 0.4 μmol/LpEGFP-N1-Elafin 刺激，于 24 h 后加入最終濃度為 10 μg/ml 的 LPS；（4）Elafin 組：用 0.4 μmol/L pEGFP-N1-Elafin刺激 24 h。繼續培養 24 h 后，分別收集上清和細胞進行檢測，每組實驗重復進行 6 次。
1.2.5 CSE 刺激組細胞分組
在 6 孔板中培養 16HBE 細胞，待細胞融合至 70%～80% 時開始傳代，將細胞分為 4 組，每組有 3 個復孔。（1）對照組：在無胎牛血清、無雙抗的 1640 培養基中繼續培養細胞；（2）CSE 刺激組：在無血清培養液中加入最終濃度為 1 g/L 的 CSE；（3）CSE+Elafin 組：用 0.4 μmol/LpEGFP-N1-Elafin 刺激，于 24 h 后加入最終濃度為 1 g/L 的 CSE；（4）Elafin 組：用 0.4 μmol/L pEGFP-N1-Elafin 刺激 24 h。繼續培養 24 h 后，分別收集上清和細胞進行檢測，每組實驗重復 6 次。
1.2.6 細胞免疫熒光法觀察胞內 MUC5AC 的蛋白表達
（1）多次清洗載玻片與血蓋片，經泡酸、高溫、高壓以消毒滅菌。（2）將各組處于對數生長期的 16HBE 細胞消化后，行細胞計數，并接種到裝有蓋片的 24 孔板中，每孔接種的細胞數約為 1×105個，培養 24 h 后，改用無血清培養基，繼續培養 24 h 后行進行分組培養。（3）棄去培養液，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（4）加入 4% 多聚甲醛，在室溫下固定 30 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（5）在室溫下，使用 0.4% Triton-X 100 反應 20 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（6）在室溫下，加入羊血清工作液，進行非特異性封閉 30 min。（7）棄去羊血清工作液，加入一抗為小鼠抗人 MUC5AC 單克隆抗體（1∶500），于濕盒內 4 ℃ 過夜，次日使用 0.01 mol/LPBS 漂洗 3×5 min/次。（8）加入二抗為異硫氰酸標記的羊抗鼠 IgG（1∶50），于室溫下置暗盒內孵育 30 min，使用 0.01 mol/L PBS 漂洗 3×5 min/次。（9）用少許的 50% 甘油封片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察。
1.2.7 ELISA 法檢測細胞分泌的 MUC5AC 的蛋白含量
細胞采用預冷的 0.01 mmol/L 的 PBS 清洗（于冰上操作），加入 RIPA 裂解液（冰預冷），以及相應的 1/100 量苯甲基磺酰氟化物，輕輕晃動吹打后，轉到 Eppendorf 管中冰浴 20 min。于 4 ℃ 離心 15 000 r/min×20 min，然后取出上清液。取少許的各種樣本，采用二喹啉甲酸法測定其總蛋白含量。用 RIPA 裂解液調整蛋白濃度，以使各樣本一致，然后用 PBS 稀釋蛋白樣本。取出各樣本 100 μl，加入 96 孔酶標板，再置于 4 ℃ 的濕盒中過夜。小牛血清室溫下封閉 1 h，分別加入小鼠抗 MUC5AC 單克隆抗體 45M1（1∶100，使用含 0.05% Tween-20 的 PBS 稀釋至 50 μl）孵育 1 h，然后加入 100 μl 辣根過氧化物酶-羊抗小鼠 IgG（1∶10 000），孵育 1 h，經過四甲基聯苯胺過氧化物酶顯色后，測出各孔吸光度值（450 nm），并與標準品比較，得出 MUC5AC 的相對值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行分析。根據方差齊性與否，分別采用參數檢驗與非參數檢驗，即齊性資料用單因素方差分析（ANOVA），結果用均數±標準差（
±s）表示，兩兩比較采用 LSD 檢驗，非齊性資料用秩和檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度 LPS 對細胞增殖活力的影響
細胞經過 LPS 處理后，1、5 及 10 μg/ml 的濃度組，在各自時間點比較，增殖活力無明顯改變。當濃度增加至 2 μg/ml 時，從第 16 h 起吸光度值開始降低，為 0.176±0.006，與正常對照組以及其他濃度組比較，差異有統計學意義（均 P<0.05）。與其他組比較，在 24 h 和 36 h 的吸光度值明顯降低（均P<0.01）。結果見表 1。
表1
MTT 檢測不同濃度 LPS 刺激對細胞增殖活力的影響（n=6，
）
2.2 不同濃度 CSE 對細胞增殖活力的影響
細胞經過 CSE 處理后，將 0.25、0.5 及 1 g/L 的濃度組在各自的時間點相比，增殖活力無明顯改變。但是當濃度增加到 2 g/L 時，第 16 h 起，吸光度值開始出現降低，為 0.190±0.005，與正常對照組以及其他濃度組對比，差異有統計學意義（均 P<0.05）。與其他組比較，在 24 h 和 36 h 的吸光度值有明顯降低（均P<0.01）。結果見表 2。
表2
MTT 檢測不同濃度 CSE 刺激對細胞增殖活力的影響（n=6，
）
2.3 Elafin 對 LPS 及 CSE 誘導的 MUC5AC 胞內蛋白生成的影響
與對照組比較，LPS 刺激組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量明顯增多。在 LPS 刺激前予 Elafin 預處理組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量低于單純的 LPS 刺激組。與對照組比較，單純予 Elafin 處理組細胞內的 MUC5AC 表達量顯著降低。結果見圖 1。
圖1
LPS 及 Elafin 對 MUC5AC 胞內蛋白含量的影響
a. 對照組；b. LPS 處理組；c. LPS+Elafin 處理組；d. Elafin 處理組
與對照組比較，CSE 刺激組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量顯著增多。在 CSE 刺激前予 Elafin 預處理組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量低于單純的 CSE 刺激組。與對照組比較，單純予 Elafin 處理組細胞內的 MUC5AC 表達量顯著降低。結果見圖 2。
圖2
CSE 及 Elafin 對 MUC5AC 胞內蛋白含量的影響
a. 對照組；b. CSE 處理組；c. CSE+Elafin 處理組；d. Elafin 處理組
2.4 Elafin 對 LPS 及 CSE 誘導的 MUC5AC 蛋白分泌量的影響
與對照組比較，LPS 刺激組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平顯著增高（P<0.01）。在 LPS 刺激前予 Elafin 預處理組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明顯低于單純的 LPS 刺激組（P<0.01）。與對照組比較，單純予 Elafin 處理組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平顯著降低（P<0.05）。結果見表 3。
表3
LPS 及 Elafin 對 MUC5AC 蛋白分泌量的影響（n=6，
，μg/ml）
與對照組比較，CSE 刺激組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明顯增高，差異有統計學意義（P<0.01）。在 CSE 刺激前予 Elafin 預處理組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平明顯低于單純的 CSE 處理組（P<0.01）。與對照組比較，單純予 Elafin 處理組的 MUC5AC 蛋白的分泌水平顯著降低，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 4。
表4
CSE 及 Elafin 對 MUC5AC 蛋白分泌量的影響（n=6，
，μg/ml）
3 討論
Elafin 是近年來發現的一種小分子（相對分子質量 9 900）抗彈力酶特異性保護因子[10-11]。呼吸道 Elafin 主要由肺泡上皮細胞、Clara 細胞及肺泡巨噬細胞產生[12]，具有保護細胞外基質以及上皮細胞免于受中性粒細胞彈性蛋白酶溶解破壞的重要作用，并且顯示出優良的抗菌作用，以及對陽離子蛋白酶的抑制作用[13-14]。Elafin 的這種多重有益效應以及其分子量小、穿透性好的特點，使其成為治療慢性氣道炎癥的一種極其具希望和潛質的候選靶物質。因此，獲取人工重組 Elafin 對于慢性氣道炎癥性疾病的治療極其具有研究價值。
Elafin 具有的抗蛋白酶性使其在氣道黏液高分泌的治療中具有突出的優勢[15]。既往對 Elafin 的研究多立足于其抗感染、抗蛋白酶等細胞外的作用上。本研究通過培養氣道上皮細胞，采用 CSE 及 LPS 作為刺激因素，使用細胞免疫熒光法及 ELISA 法，分別檢測各組氣道上皮細胞 MUC5AC 的胞內蛋白及胞外蛋白分泌的表達情況。結果顯示，與對照組比較，LPS 及 CSE 刺激組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平明顯增多，在 LPS 及 CES 刺激前予 Elafin 預處理組細胞內的 MUC5AC 蛋白含量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平低于單純 LPS 及單純 CES 刺激組，而單純予 Elafin 處理組細胞內的 MUC5AC 表達量及 MUC5AC 蛋白的分泌水平顯著降低。因此，LPS 及 CSE 可以誘導炎癥介質的產生，進而上調 MUC5AC 的胞內蛋白及分泌到胞外的蛋白的含量，從而促進慢性氣道炎癥的形成；而以 Elafin 進行干預可以明顯降低 LPS 及 CSE 上調的上述指標水平。因此，可以得出結論，CSE 及 LPS 可增加 MUC5AC 的合成及分泌，而 Elafin 可顯著抑制 CSE 及 LPS 的上述效應；Elafin 可以通過阻斷氣道黏蛋白的生成及分泌，從而達到抑制氣道黏液高分泌的目的。
本實驗選擇 MUC5AC 作為炎癥反應強度的指標，是因為 MUC5AC 是氣道黏液中最重要的黏蛋白，而許多氣道黏液高分泌疾病，如慢性阻塞性肺疾病、支氣管哮喘、支氣管擴張等的病理生理改變都與其密切相關[16-17]。由于 MUC5AC 與慢性阻塞性肺疾病等慢性氣道炎癥疾病患者的病情進展和預后緊密相關，故本實驗著重觀察 Elafin 與 MUC5AC 的胞內蛋白及分泌到胞外的蛋白的關系，結果進一步提示 Elafin 可顯著遏制 MUC5AC 的合成及分泌，從而降低了 MUC5AC 的病理性表達[18]。
目前國內外針對 Elafin 對氣道黏液高分泌影響方面的研究不多，本研究在之前研究[19]的基礎上進一步確認了 Elafin 在治療氣道黏液高分泌方面的積極效應，從而提示其在氣道黏液高分泌的調控領域中可能發揮重要作用。因此，Elafin 純化的表達產物在氣道局部的治療中將有較為廣闊的臨床應用前景。
