引用本文： 李乃健, 潘天惠, 何芳, 冉丕鑫. 流式細胞術檢測大鼠肺泡巨噬細胞吞噬熒光標記細菌的方法學探討. 中國呼吸與危重監護雜志, 2019, 18(5): 479-483. doi: 10.7507/1671-6205.201803034 復制
目前國內外學者廣泛選用肺泡巨噬細胞（alveolar macrophages，AM）作為實驗對象來研究相關呼吸系統疾病的發病機制。AM 存在于呼吸道（絕大部分在肺泡腔），通過分泌系列的細胞因子、炎癥介質和吞噬外源性微顆粒如細菌、病毒和空氣污染物而參與氣道免疫應答和防御[1]，而且通過吞噬清除潛在的病原性微生物的作用在保持肺里無菌環境中起關鍵作用。近期研究發現慢性阻塞性肺疾病患者 AM 吞噬細菌的能力下降，有可能是導致患者反復發生下呼吸道細菌性感染的重要原因之一[2-3]，而在哮喘患者中同樣發現 AM 吞噬凋亡細胞減少[4]。因此，研究 AM 的吞噬功能對于了解相關疾病的發病機制具有重要意義。
1982 年 Steinkamp 等[5]首創熒光微球流式細胞術定量檢測吞噬功能，發展至今，結合各種熒光標記技術，流式細胞術在單核–巨噬細胞吞噬功能研究中的應用越來越廣。流式細胞術用于檢測巨噬細胞吞噬功能可輕易地觀察數千到數萬個細胞，而且具有分析速度快、重復性好和特異性強等優點[6]。AlexaFluor 488（AF488）是由美國生命技術公司（Life technologies）旗下的分子探針公司（Molecular Probes）新開發的綠色熒光染料，目前國內少有其標記細菌用于檢測吞噬功能的相關報道。因此，本研究的主要目的是初步建立流式細胞術檢測大鼠 AM 吞噬 AF488 標記細菌的方法學。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和細菌
無特定病原級 SD 雄性大鼠，180～220 g，8 周齡，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心［動物生產許可證號：SCXK（粵）2013-0034］。金黃色葡萄球菌（編號 1.2386）及肺炎鏈球菌（編號 1.8722）購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）。
1.2 主要儀器和試劑
流式細胞儀 BD Accuri? C6（美國 Becton Dickinson），LSM880 激光共聚焦熒光顯微鏡（德國 Carl Zeiss），高速離心機（美國 eppendorf）。磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、無血清 1640 培養基、AF488、CellTracker Red CMPTX dye 購自 Invitrogen 公司，胰酶和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自 Gibco 公司，NaHCO3、二甲基亞砜、0.4% 臺盼藍溶液購自 Sigma 公司，Lab-Tek 培養腔室載玻片購自 Merck Millipore 公司。
1.3 方法
1.3.1 AM 的獲取
本實驗符合實驗動物倫理學要求。取無特定病原級 SD 雄性大鼠，1% 戊巴比妥鈉 40 mg/kg 腹腔麻醉，暴露肺部及氣管后行氣管插管術，36 mL 預冷 PBS 分 4 次注入肺部，分批收集支氣管肺泡灌洗液；1 200 r/min 離心 5 min，棄上清，每管加入 2 mL 1× RBC 裂解液，混勻溶血 5 min，加 5 mL 無血清 1640 培養基中和混勻，1 200 r/min 離心 5 min，重復洗滌 2 次，細胞重懸于含 10% FBS 的 1640 培養基中，在 37 ℃ 含 5% CO2 的細胞培養箱中貼壁 2 h；預冷 PBS 洗滌 2 次后貼壁細胞經 Diff-Quik 染色證實 98% 為 AM[7]，隨后收獲細胞并調整為 2.0×105/孔。
1.3.2 細菌的培養與計數
金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌菌株在哥倫比亞血平板上獲取單個菌落并接種于 LB 液體培養基中增菌（200 r/min，37 ℃，5% CO2），當細菌生長至對數期且吸光度值>0.5 時收獲細菌，4 000 r/min 離心 10 min，重懸于 5 mL PBS；取其中 1 μL 行連續稀釋至 1×10–6 并接種于血平板上，于次日計算菌落形成單位得出細菌總數；在 60 ℃ 水浴條件下 2 h 將細菌滅活，PBS 洗滌 2 次后重懸于 5 mL PBS 并分裝為 1 mL/管，–20℃ 保存。菌落總數計算公式：每 μL 菌液中的細菌總數=（N/V）×d。其中，N 為某稀釋倍數下適宜范圍內的平均菌落數；V 為涂布平板時所用的稀釋液的體積，單位為 μL；d 為稀釋倍數。
1.3.3 細菌的熒光標記與檢測
細菌解凍后離心（8 000 r/min，10 min），吸棄上清液并重懸于 1 mL 0.1 mol/L 的 NaHCO3，將每管細菌數濃度調整為 1.0×106/μL。參考 Taylor 等[3]標記細菌的方法，用二甲基亞砜配制 AF488 母液濃度為 2 mg/mL，加入到細菌懸液中，使 AF488 終濃度分別為 10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL。然后室溫、避光、搖床孵育 6 h，取出后離心棄上清，預冷 PBS 清洗 3 次，重新懸浮于無血清 1640 培養基，避光保存于 –20 ℃ 備用。參照文獻[8]中的檢測細菌標記率的方法，用流式細胞儀檢測 AF488 標記金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的陽性比例，以確定金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的標記率。
1.3.4 AM 吞噬率與吞噬指數的檢測
參照文獻[9]的方法。在 24 孔板中調整 AM 濃度為 2.0×105/孔，分別以 1∶0、1∶10、1∶50、1∶100 和 1∶200 的細胞與細菌比例，在含細胞培養箱中（37 ℃，5% CO2）孵育 2、4、6 和 8 h，獲取時效曲線，以選取合適的吞噬時間點。隨后加入 0.4% 臺盼藍溶液 10 μL 作用 1 min 淬滅細胞外熒光并終止反應，預冷 PBS 洗滌 3 次，胰酶消化 5 min 收獲細胞后制備成單細胞懸液。AM 經流式細胞儀獲取數據，測熒光時先在前向散射光和邊角散射光二維散點圖中，根據細菌及 AM 大小及顆粒密度設定巨噬細胞區域，在檢測綠色熒光的 FL1-A 直方圖中用空白管（未加熒光菌孵育的巨噬細胞）設定線性門的陽性區域，以陽性率代表吞噬率，陽性巨噬細胞的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）與細菌的 MFI 比值代表吞噬指數。
1.3.5 激光共聚焦熒光顯微鏡檢測
將 AM 直接接種于 8 孔的 Lab-Tek 培養腔室載玻片（2×105/300 μL/孔），按 1∶100 比例加入已標記的金黃色葡萄球菌，在 37 ℃、5% CO2 條件下孵育 4 h，終止吞噬反應。加入終濃度為 12.5 μmol/L 的 CellTracker Red CMPTX dye 培養 30 min 后吸棄培養液繼續以 1640 培養基培養 30 min，4% 預冷的多聚甲醛固定細胞 10 min，將細胞孵育于 200 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（250 μmol/L）3 min，PBS 洗滌 4 次，去掉腔室，蓋玻片固定，在激光共聚焦熒光顯微鏡下檢測。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 21.0 統計軟件。數值以均數±標準差（
±s）表示。采用方差分析兩兩比較 LSD 及兩樣本均數的 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度 AF488 對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌標記率的影響
AF488 對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌標記率和 MFI 的影響在一定范圍內呈濃度依賴性。與低濃度（10 μg/mL）相比，當 AF488 的濃度大于 50 μg/mL 時，金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的標記率均大于 92%。雖然金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的 MFI 隨著 AF488 濃度的增加而增強，但標記率在熒光染料濃度大于 50 μg/mL 便已迅速達到上限（表 1、圖 1）。故本實驗后續評價不同細菌比例和孵育時間對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響，使用 AF488 標記肺炎鏈球菌的濃度為 100 μg/mL。
表1
不同濃度 AF488 對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的標記率和 MFI 的比較（n=3，
）
圖1
不同濃度 AF488 標記下金黃色葡萄球菌（a）和肺炎鏈球菌（b）的 MFI
隨著 AF488 的濃度增高，金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的 MFI 升高
2.2 不同細菌比例對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響
AM 對肺炎鏈球菌的吞噬率以及吞噬指數隨著細菌比例的增加而升高。將 AM 與肺炎鏈球菌按照 1∶0、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200 和 1∶300 的比例孵育 4 h，發現 AM 的吞噬率隨著細菌與細胞比例的增加而顯著升高（P<0.01）。結果見表 2。
表2
不同細菌比例對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響（n=6，
）
2.3 不同孵育時間對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響
將 AM 與肺炎鏈球菌按照 1∶100 孵育 2、4、6 和 8 h，AM 的吞噬率從孵育 2 h 的 20.4% 升高到 8 h 的 76.5%（P<0.05）。同時 AM 的吞噬指數隨著孵育時間的延長而升高，從孵育 2 h 的 3.2 升高到 8 h 的 4.9，但延長孵育時間而導致吞噬指數的升高并沒有增加細菌比例而導致的吞噬指數升高來得明顯。由此可得出增加細菌比例對吞噬指數的影響更為關鍵。結果見表 3。
表3
不同孵育時間對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響（n=6，
）
2.4 激光共聚焦熒光顯微鏡結果
AM 與肺炎鏈球菌按照 1∶100 孵育 4 h 后，進行激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，由圖 2 可見，在細胞與細胞之間的背景并沒有觀察到有綠色熒光，證明并沒有多余的帶熒光肺炎鏈球菌影響檢測結果。通過對細胞核藍色熒光、胞漿紅色熒光的對比染色，結合細菌的綠色熒光，可在激光共聚焦熒光顯微鏡下清晰地分辨絕大部分肺炎鏈球菌被吞噬進細胞胞漿內，在細胞輪廓內呈綠色熒光的為吞噬進入胞內的肺炎鏈球菌。
圖2
激光共聚焦熒光顯微鏡下肺炎鏈球菌在 AM 中的分布
a. 呈綠色熒光的肺炎鏈球菌；b. 按比例共同孵育的 AM 與肺炎鏈球菌的融合圖像。通過對 DAPI 染的細胞核藍色熒光和 CellTracker Red CMPTX dye 所染的胞漿紅色熒光對比可知，絕大部分肺炎鏈球菌被吞噬進入胞漿
3 討論
AM 在抵抗顆粒物及病原微生物的入侵中具有極為重要的地位，AM 吞噬活性的降低可能會導致進入肺部的病原體不能被清除而在肺部快速增殖，AM 吞噬功能降低亦可降低其抗原提呈能力，使肺部感染的發生率增加。傳統檢測 AM 吞噬功能主要采用碳廓清實驗和吞噬雞紅細胞實驗，但這兩項傳統檢測方法效率低、準確性差，有一定的局限性[10]。1982 年 Steinkamp 等[5]首創熒光微球流式細胞術定量檢測吞噬功能，現今結合各種熒光標記技術，使得流式細胞術在單核–巨噬細胞吞噬功能的研究中應用更為廣泛。
AF488 是新開發的綠色熒光染料，AF488 偶聯蛋白優于其他熒光素，實驗證明其比包括異硫氰酸熒光素和 Cy2 的其他綠色熒光基團都好，不僅亮度高，而且光穩定性更好，在 pH4～10 的范圍內均能保持穩定[11-12]。本實驗發現，AF488 對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌標記率和 MFI 的影響在一定范圍內呈濃度依賴性，這表明當使用 AF488 標記細菌時，AF488 需要達到一定的工作濃度，最少需要達到 50 μg/mL，這與異硫氰酸熒光素標記結核分枝桿菌的濃度相近[8]。隨著 AF488 濃度的升高，雖然 MFI 明顯升高，但是標記率并沒有明顯提高，因此從經濟效益出發應該在 50～100 μg/mL 中選擇合適的標記濃度。
實驗發現，肺炎鏈球菌與 AM 的比例對吞噬率有一定程度的影響，肺炎鏈球菌濃度越高，吞噬率越高，但 AM 的吞噬能力很強，不易達到飽和，故在檢測 AM 吞噬功能時選用合適的細菌與細胞比例（如 1∶100）就已能夠反映真實的吞噬能力[9]。與此同時，AM 的吞噬率和吞噬指數隨著孵育時間的延長而升高，吞噬率從孵育 2 h 的 20.4% 升高到 8 h 的 76.5%，吞噬指數從孵育 2 h 的 3.2 升高到 8 h 的 4.9，但這與之前報道的腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球的結果有所不同[13]。推測可能原因，一方面是 AM 的吞噬能力很強，不易達到飽和，在整個孵育過程中 AM 對細菌不斷進行吞噬作用；另一方面，由于胞吐作用，吞噬了熒光微球的腹腔巨噬細胞排出了部分熒光微球，而 AM 卻對吞噬進入胞漿的細菌進行消化，消化后的 AF488 殘留在胞漿內使得胞漿染色，從而使得 MFI 升高。但這些推測還需要進一步驗證。
綜上所述，流式細胞術檢測 AM 吞噬 AF488 標記細菌是一種簡便、快速和重復性好的方法。建立該實驗準確的方法學對于研究 AM 對細菌的吞噬功能具有重要的意義。但在應用過程中需要注意兩點。（1）在去除細胞外多余細菌時，采取臺盼藍淬滅細胞外熒光標記的方法來達到去除多余細菌熒光的目的，并用預冷的 PBS 進行沖洗。（2）細胞刮收集細胞易引起細胞物理形態改變，且細胞碎片較多，影響分析結果，故本實驗使用胰酶消化法，但胰酶消化法操作繁瑣，不適宜大量樣本檢測。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
目前國內外學者廣泛選用肺泡巨噬細胞（alveolar macrophages，AM）作為實驗對象來研究相關呼吸系統疾病的發病機制。AM 存在于呼吸道（絕大部分在肺泡腔），通過分泌系列的細胞因子、炎癥介質和吞噬外源性微顆粒如細菌、病毒和空氣污染物而參與氣道免疫應答和防御[1]，而且通過吞噬清除潛在的病原性微生物的作用在保持肺里無菌環境中起關鍵作用。近期研究發現慢性阻塞性肺疾病患者 AM 吞噬細菌的能力下降，有可能是導致患者反復發生下呼吸道細菌性感染的重要原因之一[2-3]，而在哮喘患者中同樣發現 AM 吞噬凋亡細胞減少[4]。因此，研究 AM 的吞噬功能對于了解相關疾病的發病機制具有重要意義。
1982 年 Steinkamp 等[5]首創熒光微球流式細胞術定量檢測吞噬功能，發展至今，結合各種熒光標記技術，流式細胞術在單核–巨噬細胞吞噬功能研究中的應用越來越廣。流式細胞術用于檢測巨噬細胞吞噬功能可輕易地觀察數千到數萬個細胞，而且具有分析速度快、重復性好和特異性強等優點[6]。AlexaFluor 488（AF488）是由美國生命技術公司（Life technologies）旗下的分子探針公司（Molecular Probes）新開發的綠色熒光染料，目前國內少有其標記細菌用于檢測吞噬功能的相關報道。因此，本研究的主要目的是初步建立流式細胞術檢測大鼠 AM 吞噬 AF488 標記細菌的方法學。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和細菌
無特定病原級 SD 雄性大鼠，180～220 g，8 周齡，購自廣州中醫藥大學實驗動物中心［動物生產許可證號：SCXK（粵）2013-0034］。金黃色葡萄球菌（編號 1.2386）及肺炎鏈球菌（編號 1.8722）購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC）。
1.2 主要儀器和試劑
流式細胞儀 BD Accuri? C6（美國 Becton Dickinson），LSM880 激光共聚焦熒光顯微鏡（德國 Carl Zeiss），高速離心機（美國 eppendorf）。磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline，PBS）、無血清 1640 培養基、AF488、CellTracker Red CMPTX dye 購自 Invitrogen 公司，胰酶和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自 Gibco 公司，NaHCO3、二甲基亞砜、0.4% 臺盼藍溶液購自 Sigma 公司，Lab-Tek 培養腔室載玻片購自 Merck Millipore 公司。
1.3 方法
1.3.1 AM 的獲取
本實驗符合實驗動物倫理學要求。取無特定病原級 SD 雄性大鼠，1% 戊巴比妥鈉 40 mg/kg 腹腔麻醉，暴露肺部及氣管后行氣管插管術，36 mL 預冷 PBS 分 4 次注入肺部，分批收集支氣管肺泡灌洗液；1 200 r/min 離心 5 min，棄上清，每管加入 2 mL 1× RBC 裂解液，混勻溶血 5 min，加 5 mL 無血清 1640 培養基中和混勻，1 200 r/min 離心 5 min，重復洗滌 2 次，細胞重懸于含 10% FBS 的 1640 培養基中，在 37 ℃ 含 5% CO2 的細胞培養箱中貼壁 2 h；預冷 PBS 洗滌 2 次后貼壁細胞經 Diff-Quik 染色證實 98% 為 AM[7]，隨后收獲細胞并調整為 2.0×105/孔。
1.3.2 細菌的培養與計數
金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌菌株在哥倫比亞血平板上獲取單個菌落并接種于 LB 液體培養基中增菌（200 r/min，37 ℃，5% CO2），當細菌生長至對數期且吸光度值>0.5 時收獲細菌，4 000 r/min 離心 10 min，重懸于 5 mL PBS；取其中 1 μL 行連續稀釋至 1×10–6 并接種于血平板上，于次日計算菌落形成單位得出細菌總數；在 60 ℃ 水浴條件下 2 h 將細菌滅活，PBS 洗滌 2 次后重懸于 5 mL PBS 并分裝為 1 mL/管，–20℃ 保存。菌落總數計算公式：每 μL 菌液中的細菌總數=（N/V）×d。其中，N 為某稀釋倍數下適宜范圍內的平均菌落數；V 為涂布平板時所用的稀釋液的體積，單位為 μL；d 為稀釋倍數。
1.3.3 細菌的熒光標記與檢測
細菌解凍后離心（8 000 r/min，10 min），吸棄上清液并重懸于 1 mL 0.1 mol/L 的 NaHCO3，將每管細菌數濃度調整為 1.0×106/μL。參考 Taylor 等[3]標記細菌的方法，用二甲基亞砜配制 AF488 母液濃度為 2 mg/mL，加入到細菌懸液中，使 AF488 終濃度分別為 10 μg/mL、50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL、500 μg/mL。然后室溫、避光、搖床孵育 6 h，取出后離心棄上清，預冷 PBS 清洗 3 次，重新懸浮于無血清 1640 培養基，避光保存于 –20 ℃ 備用。參照文獻[8]中的檢測細菌標記率的方法，用流式細胞儀檢測 AF488 標記金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的陽性比例，以確定金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的標記率。
1.3.4 AM 吞噬率與吞噬指數的檢測
參照文獻[9]的方法。在 24 孔板中調整 AM 濃度為 2.0×105/孔，分別以 1∶0、1∶10、1∶50、1∶100 和 1∶200 的細胞與細菌比例，在含細胞培養箱中（37 ℃，5% CO2）孵育 2、4、6 和 8 h，獲取時效曲線，以選取合適的吞噬時間點。隨后加入 0.4% 臺盼藍溶液 10 μL 作用 1 min 淬滅細胞外熒光并終止反應，預冷 PBS 洗滌 3 次，胰酶消化 5 min 收獲細胞后制備成單細胞懸液。AM 經流式細胞儀獲取數據，測熒光時先在前向散射光和邊角散射光二維散點圖中，根據細菌及 AM 大小及顆粒密度設定巨噬細胞區域，在檢測綠色熒光的 FL1-A 直方圖中用空白管（未加熒光菌孵育的巨噬細胞）設定線性門的陽性區域，以陽性率代表吞噬率，陽性巨噬細胞的平均熒光強度（mean fluorescence intensity，MFI）與細菌的 MFI 比值代表吞噬指數。
1.3.5 激光共聚焦熒光顯微鏡檢測
將 AM 直接接種于 8 孔的 Lab-Tek 培養腔室載玻片（2×105/300 μL/孔），按 1∶100 比例加入已標記的金黃色葡萄球菌，在 37 ℃、5% CO2 條件下孵育 4 h，終止吞噬反應。加入終濃度為 12.5 μmol/L 的 CellTracker Red CMPTX dye 培養 30 min 后吸棄培養液繼續以 1640 培養基培養 30 min，4% 預冷的多聚甲醛固定細胞 10 min，將細胞孵育于 200 μL 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）（250 μmol/L）3 min，PBS 洗滌 4 次，去掉腔室，蓋玻片固定，在激光共聚焦熒光顯微鏡下檢測。
1.4 統計學方法
應用 SPSS 21.0 統計軟件。數值以均數±標準差（±s）表示。采用方差分析兩兩比較 LSD 及兩樣本均數的 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度 AF488 對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌標記率的影響
AF488 對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌標記率和 MFI 的影響在一定范圍內呈濃度依賴性。與低濃度（10 μg/mL）相比，當 AF488 的濃度大于 50 μg/mL 時，金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的標記率均大于 92%。雖然金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的 MFI 隨著 AF488 濃度的增加而增強，但標記率在熒光染料濃度大于 50 μg/mL 便已迅速達到上限（表 1、圖 1）。故本實驗后續評價不同細菌比例和孵育時間對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響，使用 AF488 標記肺炎鏈球菌的濃度為 100 μg/mL。
表1
不同濃度 AF488 對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的標記率和 MFI 的比較（n=3，）
圖1
不同濃度 AF488 標記下金黃色葡萄球菌（a）和肺炎鏈球菌（b）的 MFI
隨著 AF488 的濃度增高，金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的 MFI 升高
2.2 不同細菌比例對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響
AM 對肺炎鏈球菌的吞噬率以及吞噬指數隨著細菌比例的增加而升高。將 AM 與肺炎鏈球菌按照 1∶0、1∶10、1∶50、1∶100、1∶200 和 1∶300 的比例孵育 4 h，發現 AM 的吞噬率隨著細菌與細胞比例的增加而顯著升高（P<0.01）。結果見表 2。
表2
不同細菌比例對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響（n=6，）
2.3 不同孵育時間對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響
將 AM 與肺炎鏈球菌按照 1∶100 孵育 2、4、6 和 8 h，AM 的吞噬率從孵育 2 h 的 20.4% 升高到 8 h 的 76.5%（P<0.05）。同時 AM 的吞噬指數隨著孵育時間的延長而升高，從孵育 2 h 的 3.2 升高到 8 h 的 4.9，但延長孵育時間而導致吞噬指數的升高并沒有增加細菌比例而導致的吞噬指數升高來得明顯。由此可得出增加細菌比例對吞噬指數的影響更為關鍵。結果見表 3。
表3
不同孵育時間對 AM 吞噬率和吞噬指數的影響（n=6，）
2.4 激光共聚焦熒光顯微鏡結果
AM 與肺炎鏈球菌按照 1∶100 孵育 4 h 后，進行激光共聚焦熒光顯微鏡觀察，由圖 2 可見，在細胞與細胞之間的背景并沒有觀察到有綠色熒光，證明并沒有多余的帶熒光肺炎鏈球菌影響檢測結果。通過對細胞核藍色熒光、胞漿紅色熒光的對比染色，結合細菌的綠色熒光，可在激光共聚焦熒光顯微鏡下清晰地分辨絕大部分肺炎鏈球菌被吞噬進細胞胞漿內，在細胞輪廓內呈綠色熒光的為吞噬進入胞內的肺炎鏈球菌。
圖2
激光共聚焦熒光顯微鏡下肺炎鏈球菌在 AM 中的分布
a. 呈綠色熒光的肺炎鏈球菌；b. 按比例共同孵育的 AM 與肺炎鏈球菌的融合圖像。通過對 DAPI 染的細胞核藍色熒光和 CellTracker Red CMPTX dye 所染的胞漿紅色熒光對比可知，絕大部分肺炎鏈球菌被吞噬進入胞漿
3 討論
AM 在抵抗顆粒物及病原微生物的入侵中具有極為重要的地位，AM 吞噬活性的降低可能會導致進入肺部的病原體不能被清除而在肺部快速增殖，AM 吞噬功能降低亦可降低其抗原提呈能力，使肺部感染的發生率增加。傳統檢測 AM 吞噬功能主要采用碳廓清實驗和吞噬雞紅細胞實驗，但這兩項傳統檢測方法效率低、準確性差，有一定的局限性[10]。1982 年 Steinkamp 等[5]首創熒光微球流式細胞術定量檢測吞噬功能，現今結合各種熒光標記技術，使得流式細胞術在單核–巨噬細胞吞噬功能的研究中應用更為廣泛。
AF488 是新開發的綠色熒光染料，AF488 偶聯蛋白優于其他熒光素，實驗證明其比包括異硫氰酸熒光素和 Cy2 的其他綠色熒光基團都好，不僅亮度高，而且光穩定性更好，在 pH4～10 的范圍內均能保持穩定[11-12]。本實驗發現，AF488 對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌標記率和 MFI 的影響在一定范圍內呈濃度依賴性，這表明當使用 AF488 標記細菌時，AF488 需要達到一定的工作濃度，最少需要達到 50 μg/mL，這與異硫氰酸熒光素標記結核分枝桿菌的濃度相近[8]。隨著 AF488 濃度的升高，雖然 MFI 明顯升高，但是標記率并沒有明顯提高，因此從經濟效益出發應該在 50～100 μg/mL 中選擇合適的標記濃度。
實驗發現，肺炎鏈球菌與 AM 的比例對吞噬率有一定程度的影響，肺炎鏈球菌濃度越高，吞噬率越高，但 AM 的吞噬能力很強，不易達到飽和，故在檢測 AM 吞噬功能時選用合適的細菌與細胞比例（如 1∶100）就已能夠反映真實的吞噬能力[9]。與此同時，AM 的吞噬率和吞噬指數隨著孵育時間的延長而升高，吞噬率從孵育 2 h 的 20.4% 升高到 8 h 的 76.5%，吞噬指數從孵育 2 h 的 3.2 升高到 8 h 的 4.9，但這與之前報道的腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球的結果有所不同[13]。推測可能原因，一方面是 AM 的吞噬能力很強，不易達到飽和，在整個孵育過程中 AM 對細菌不斷進行吞噬作用；另一方面，由于胞吐作用，吞噬了熒光微球的腹腔巨噬細胞排出了部分熒光微球，而 AM 卻對吞噬進入胞漿的細菌進行消化，消化后的 AF488 殘留在胞漿內使得胞漿染色，從而使得 MFI 升高。但這些推測還需要進一步驗證。
綜上所述，流式細胞術檢測 AM 吞噬 AF488 標記細菌是一種簡便、快速和重復性好的方法。建立該實驗準確的方法學對于研究 AM 對細菌的吞噬功能具有重要的意義。但在應用過程中需要注意兩點。（1）在去除細胞外多余細菌時，采取臺盼藍淬滅細胞外熒光標記的方法來達到去除多余細菌熒光的目的，并用預冷的 PBS 進行沖洗。（2）細胞刮收集細胞易引起細胞物理形態改變，且細胞碎片較多，影響分析結果，故本實驗使用胰酶消化法，但胰酶消化法操作繁瑣，不適宜大量樣本檢測。
利益沖突：本研究不涉及任何利益沖突。
