引用本文： 姜良征, 歐陽松云, 蘇皎. p22phox C242T 基因多態性與阻塞性睡眠呼吸暫停并認知功能障礙的關系探討. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(4): 373-376. doi: 10.7507/1671-6205.201711036 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種以睡眠過程中缺氧與缺氧再恢復反復循環為特點的常見疾病。認知功能障礙是 OSA 患者的常見并發癥[1]，但并不是所有患者在疾病進展中都并發認知功能障礙[2-3]，可能與遺傳或環境因素有關。OSA 認知功能障礙與睡眠過程中間歇性缺氧引起的氧化應激密切相關[4-6]。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases，NOX）是人體內超氧化物陰離子的主要來源。氧化應激反應和活化的 NOX 在睡眠中間歇性缺氧的條件下能夠介導神經細胞受損[7-8]。p22phox 亞基由 CYBA 基因編碼，是 NOX 的重要組成部分，在 NOX 產生氧自由基的過程中發揮關鍵作用，其多態性備受關注[9]， 與中國漢族人群 OSA 易感性及嚴重程度相關[10-11]。研究已證實在兒童患者中與氧化應激相關的 p22phox 等位基因變異可能與 OSA 認知功能障礙相關[12]。–A930G CYBA 多態性是啟動子多態性之一，它位于距離 ATG 密碼子 –930 的核苷酸位置。在健康受試者中，–930G 等位基因啟動子比 –930A 等位基因啟動子基因表達高 30%[13]。–A930G 多態性參與調節 CYBA 啟動子的活性，進一步調節 CYBA 的轉錄[14]。C242T 多態性是位于外顯子的編碼序列多態性之一，可調節 CYBA 編碼序列的活性并影響 CYBA 轉錄活性[15-16]。本研究旨在分析 OSA 患者的 –A930G、C242T 多態性與認知功能障礙的可能關聯，評估 CYBA 等位基因在認知功能障礙 OSA 患者中的作用。本研究還比較了 –A930G 和 C242T CYBA 多態性的等位基因頻率，通過對比有無合并認知功能障礙的 OSA 受試者 NOX 活性和尿 8-羥基脫氧鳥苷（8-OH-dG）水平，探索二者的關聯。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
2014 年 9 月至 2016 年 11 月于鄭州大學第一附屬醫院呼吸睡眠科首診的男性非吸煙患者，年齡 18～75歲，符合 OSA 診斷標準。研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，患者參與前簽署知情同意書。受試者 4 周內未服用糖皮質激素、抗生素、β 受體阻滯劑，監測前 1 周內未服用鎮靜催眠類藥物，2 d 內未飲酒、咖啡等。排除嚴重的頜面畸形、長期酗酒、支氣管哮喘、結構性肺病（如支氣管擴張和慢性阻塞性肺疾病）、甲狀腺疾病、嚴重的心腦血管疾病、急性感染、精神系統疾病、糖尿病等。
1.2 方法
1.2.1 認知功能評估
認知功能評估包括臨床廣泛應用的簡易智力狀態檢查量表（mini mental state examination，MMSE）和蒙特利爾認知評估量表（Montreal cognitive assessment scale，MoCA）[17]。MMSE 評分可根據教育水平評估認知功能障礙。MoCA 是目前國際通用的認知功能障礙篩查量表，具有高度的敏感性和特異性[18-19]。
1.2.2 多導睡眠監測
在電腦數據采集系統（ESeries，Compumedics，Australia）進行夜間≥6 h 的多導睡眠監測。根據 2012 年美國睡眠醫學學院睡眠及相關事件評分手冊（AASM 2012）分析數據。記錄呼吸暫停低通氣指數（apnea hypopnea index，AHI）、氧減指數（oxygen desaturation index，ODI）和血氧飽和度低于 90% 所占總睡眠時間的百分比（the percentage of time that oxygen saturation below 90%，SIT90）等。通過 Epworth 嗜睡量表（Epworth sleepiness scale，ESS）評估睡眠情況。
1.2.3 遺傳分析
使用 DNA 提取試劑盒從外周血白細胞中提煉基因組 DNA。通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長度多態性方法對 CYBA 基因的–A930G 和 C242T 多態性進行基因分型[10]。p22phox –A930G 基因的 PCR 引物：上游，5′-GGAAACCAAGTGCCTCGGATGG-3′；下游，5′-TCTGCACCCTGATGCTACCAAGGAC-3′。p22phox C242T 基因的 PCR 引物：上游，5′-TGCTTGTGGGTAAACCAAGGCCGGTG-3′；下游，5′-AACACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT-3′。
1.2.4 NOX 活性與尿 8-OH-dG 的測定
收集 2 ml 全血樣品置于肝素抗凝管，待紅細胞裂解后分離白細胞，將細胞用葡萄糖（10 mmol/L）重懸于磷酸鹽緩沖鹽水中，并調節濃度至約 107 個細胞/ml。通過硝基藍四氮唑法測定 NOX 活性。將白細胞懸浮在含 0.04% 硝基藍四氮唑和 10 mmol/L 葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，置 37 ℃ 下 15 min，采用 HCl（200 μl，1 mol/L）封閉。離心后加入 600 μl 二甲基亞砜。使用酶聯免疫檢測儀（ELISA reader，Infinite 200M，TECAN，Switzerland）在 560 nm 下測量吸光度。
收集受試者清晨中段清潔尿，于 –20 ℃ 條件下保存，按 1∶500 稀釋至標準曲線范圍內。使用8-OH-dG EIA 試劑盒（Cayman Chemical，USA）經 ELISA 法測定 8-OH-dG。使用酶聯免疫檢測儀在 412 nm 測量吸光度。將每個樣品的 8-OH-dG 水平標準化為 DNA 濃度，結果用 ng 8-OH-dG/mg 表示。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件，數據用均數±標準差（
±s）表示。使用公式 1=p2+2pq+q2 測試等位基因分布的 Hardye-Weinberg 平衡，p 和 q 分別代表 –A930G 中 A、G 等位基因頻率以及 C242T CYBA 多態性中 C、T 的基因頻率。在 –A930G 和 C242T CYBA 多態性中，本研究組符合 Hardye-Weinberg 平衡，使用公式 D=P（pq）–P（p）×P（q）測試 –A930G 和 C242T 的連鎖不平衡性。在本研究中，–A930G 與 C242T 多態性不具有連鎖不平衡性。使用 χ2 檢驗分析二分類結局（基因型和等位基因頻率）。使用 2×R 表（基因型為 R=3，等位基因為 R=2）評估 Odds 比（OR）及其 95% 置信區間（CI），對認知功能障礙的傳統危險因素進行多重 Logistic 回歸分析。使用獨立樣本的 t 檢驗，分析 NOX 活性和尿 8-OH-dG 水平。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料與 PSG 監測結果分析
共納入 683 例受試者，其中 157 例有認知功能障礙的 OSA 患者為試驗組，526 例無認知功能障礙的 OSA 患者為對照組。兩組年齡、ODI、SIT90、ESS 評分差異無統計學意義（均 P>0.05），體重指數（body mass index，BMI）差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 1。
表1
入組受試者臨床資料及多導睡眠圖結果（
）
2.2 –A930G、C242T 多態性分析
基因多態性分型結果見表 2。–A930G 等位基因攜帶者（GG/AG 基因型）頻率在兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。與合并認知功能障礙的 OSA 受試者相比，無認知功能障礙的 OSA 受試者 TT/CT 基因型頻率明顯升高（P<0.05）。Logistic 回歸分析結果證實，等位基因 T 載體是認知功能障礙的保護因素（OR=0.37，95%CI 0.18～0.75）。
表2
有和無認知功能障礙的 OSA 受試者基因型分析
2.3 NOX 活性與尿 8-OH-dG 測定
如表 3、表 4 所示，與無認知功能障礙 OSA 受試者比較，認知功能障礙 OSA 受試者 NOX 活性較高（P<0.01）；與具有等位基因 T 變異的受試者比較，無等位基因突變的受試者具有更高的 NOX 活性（P<0.05）。與無認知功能障礙 OSA 受試者比較，認知功能障礙 OSA 受試者尿 8-OH-dG 水平較高（P<0.05）；與具有 T 等位基因變異受試者比較，無等位基因 T 變異的受試者尿 8-OH-dG 水平更高（P<0.05）。
表3
有和無認知功能障礙的 OSA 受試者 NOX 活性與尿 8-OH-dG 的比較（
）
表4
有和無 T 等位基因變異的 OSA 受試者 NOX 活性與尿 8-OH-dG 的比較（
）
3 討論
OSA 患者認知功能障礙的發生與氧化應激相關。p22phox C242T 多態性的 CC 基因型是 OSA 患者影響認知功能障礙的危險因素之一。同時，攜帶 p22phox C242T 多態性的 CC 基因型且伴有認知功能障礙的 OSA 患者高度暴露于 NOX 介導的氧化應激。NADPH 活化可通過 ROS 介導的機制參與 OSA 的發生發展過程。因此，氧化應激的增加可能是 OSA 的危險因素[20]。氧化應激不僅是認知功能障礙和 OSA 的重要組成部分，還是其相關并發癥（如肥胖癥、糖尿病、高血壓、冠心病）的關鍵因素[21-22]。目前影響 OSA 患者認知功能障礙的具體基因機制尚不明確。Guzik 等[23]已證實 C242T 等位基因與動脈粥樣硬化患者血管 NOX 活性降低有關。Cahilly 等[24]和 Moreno 等[15]提出，T 等位基因對動脈粥樣硬化和高血壓等幾種病態具有保護作用。薈萃分析同樣顯示，T 等位基因似乎對亞洲人群冠狀動脈疾病具有保護作用[25]。本研究發現，p22phox C242T 的 T 等位基因與 OSA 患者認知功能障礙的低發生率相關。據目前資料顯示，這是 C242T CYBA 基因多態性對中國成人認知功能障礙影響的首次研究。
對于–A930G 多態性，先前研究表明 GG 純合子可能產生過量的超氧化物[14]，但在我們的研究中，它在有無認知功能障礙的 OSA 患者之間差異并無統計學意義；而且，–A930G 多態性的作用似乎超出了氧化應激反應的調節。之前研究表明，–930A/G 的不同基因型之間的 NOX 活性和低密度脂蛋白水平沒有顯著差異[26]。由此看來，G 等位基因攜帶者由于暴露于多重有害刺激，在疾病發展過程中更容易合并認知功能障礙。為證實上述觀點，可能需要更多的受試者或進行動物實驗。
本研究也有一定的局限性。首先，本研究未包括 p22phox 的所有遺傳變異，我們將進一步研究其他 NOX 亞基的遺傳多態性。其次，我們只研究了華中漢族人群 p22phox C242T 多態性，但是多民族的研究更容易得到假陽性結果。
總之，p22phox C242T 多態性可能參與了 OSA 合并認知功能障礙患者的氧化應激的發生發展，仍需要進一步的研究來描述 p22phox C242T 基因和 NOX 在 OSA 認知功能障礙機制中的確切作用。
阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）是一種以睡眠過程中缺氧與缺氧再恢復反復循環為特點的常見疾病。認知功能障礙是 OSA 患者的常見并發癥[1]，但并不是所有患者在疾病進展中都并發認知功能障礙[2-3]，可能與遺傳或環境因素有關。OSA 認知功能障礙與睡眠過程中間歇性缺氧引起的氧化應激密切相關[4-6]。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases，NOX）是人體內超氧化物陰離子的主要來源。氧化應激反應和活化的 NOX 在睡眠中間歇性缺氧的條件下能夠介導神經細胞受損[7-8]。p22phox 亞基由 CYBA 基因編碼，是 NOX 的重要組成部分，在 NOX 產生氧自由基的過程中發揮關鍵作用，其多態性備受關注[9]， 與中國漢族人群 OSA 易感性及嚴重程度相關[10-11]。研究已證實在兒童患者中與氧化應激相關的 p22phox 等位基因變異可能與 OSA 認知功能障礙相關[12]。–A930G CYBA 多態性是啟動子多態性之一，它位于距離 ATG 密碼子 –930 的核苷酸位置。在健康受試者中，–930G 等位基因啟動子比 –930A 等位基因啟動子基因表達高 30%[13]。–A930G 多態性參與調節 CYBA 啟動子的活性，進一步調節 CYBA 的轉錄[14]。C242T 多態性是位于外顯子的編碼序列多態性之一，可調節 CYBA 編碼序列的活性并影響 CYBA 轉錄活性[15-16]。本研究旨在分析 OSA 患者的 –A930G、C242T 多態性與認知功能障礙的可能關聯，評估 CYBA 等位基因在認知功能障礙 OSA 患者中的作用。本研究還比較了 –A930G 和 C242T CYBA 多態性的等位基因頻率，通過對比有無合并認知功能障礙的 OSA 受試者 NOX 活性和尿 8-羥基脫氧鳥苷（8-OH-dG）水平，探索二者的關聯。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
2014 年 9 月至 2016 年 11 月于鄭州大學第一附屬醫院呼吸睡眠科首診的男性非吸煙患者，年齡 18～75歲，符合 OSA 診斷標準。研究經鄭州大學第一附屬醫院倫理委員會批準，患者參與前簽署知情同意書。受試者 4 周內未服用糖皮質激素、抗生素、β 受體阻滯劑，監測前 1 周內未服用鎮靜催眠類藥物，2 d 內未飲酒、咖啡等。排除嚴重的頜面畸形、長期酗酒、支氣管哮喘、結構性肺病（如支氣管擴張和慢性阻塞性肺疾病）、甲狀腺疾病、嚴重的心腦血管疾病、急性感染、精神系統疾病、糖尿病等。
1.2 方法
1.2.1 認知功能評估
認知功能評估包括臨床廣泛應用的簡易智力狀態檢查量表（mini mental state examination，MMSE）和蒙特利爾認知評估量表（Montreal cognitive assessment scale，MoCA）[17]。MMSE 評分可根據教育水平評估認知功能障礙。MoCA 是目前國際通用的認知功能障礙篩查量表，具有高度的敏感性和特異性[18-19]。
1.2.2 多導睡眠監測
在電腦數據采集系統（ESeries，Compumedics，Australia）進行夜間≥6 h 的多導睡眠監測。根據 2012 年美國睡眠醫學學院睡眠及相關事件評分手冊（AASM 2012）分析數據。記錄呼吸暫停低通氣指數（apnea hypopnea index，AHI）、氧減指數（oxygen desaturation index，ODI）和血氧飽和度低于 90% 所占總睡眠時間的百分比（the percentage of time that oxygen saturation below 90%，SIT90）等。通過 Epworth 嗜睡量表（Epworth sleepiness scale，ESS）評估睡眠情況。
1.2.3 遺傳分析
使用 DNA 提取試劑盒從外周血白細胞中提煉基因組 DNA。通過聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）-限制性片段長度多態性方法對 CYBA 基因的–A930G 和 C242T 多態性進行基因分型[10]。p22phox –A930G 基因的 PCR 引物：上游，5′-GGAAACCAAGTGCCTCGGATGG-3′；下游，5′-TCTGCACCCTGATGCTACCAAGGAC-3′。p22phox C242T 基因的 PCR 引物：上游，5′-TGCTTGTGGGTAAACCAAGGCCGGTG-3′；下游，5′-AACACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT-3′。
1.2.4 NOX 活性與尿 8-OH-dG 的測定
收集 2 ml 全血樣品置于肝素抗凝管，待紅細胞裂解后分離白細胞，將細胞用葡萄糖（10 mmol/L）重懸于磷酸鹽緩沖鹽水中，并調節濃度至約 107 個細胞/ml。通過硝基藍四氮唑法測定 NOX 活性。將白細胞懸浮在含 0.04% 硝基藍四氮唑和 10 mmol/L 葡萄糖的磷酸鹽緩沖鹽水中，置 37 ℃ 下 15 min，采用 HCl（200 μl，1 mol/L）封閉。離心后加入 600 μl 二甲基亞砜。使用酶聯免疫檢測儀（ELISA reader，Infinite 200M，TECAN，Switzerland）在 560 nm 下測量吸光度。
收集受試者清晨中段清潔尿，于 –20 ℃ 條件下保存，按 1∶500 稀釋至標準曲線范圍內。使用8-OH-dG EIA 試劑盒（Cayman Chemical，USA）經 ELISA 法測定 8-OH-dG。使用酶聯免疫檢測儀在 412 nm 測量吸光度。將每個樣品的 8-OH-dG 水平標準化為 DNA 濃度，結果用 ng 8-OH-dG/mg 表示。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件，數據用均數±標準差（
±s）表示。使用公式 1=p2+2pq+q2 測試等位基因分布的 Hardye-Weinberg 平衡，p 和 q 分別代表 –A930G 中 A、G 等位基因頻率以及 C242T CYBA 多態性中 C、T 的基因頻率。在 –A930G 和 C242T CYBA 多態性中，本研究組符合 Hardye-Weinberg 平衡，使用公式 D=P（pq）–P（p）×P（q）測試 –A930G 和 C242T 的連鎖不平衡性。在本研究中，–A930G 與 C242T 多態性不具有連鎖不平衡性。使用 χ2 檢驗分析二分類結局（基因型和等位基因頻率）。使用 2×R 表（基因型為 R=3，等位基因為 R=2）評估 Odds 比（OR）及其 95% 置信區間（CI），對認知功能障礙的傳統危險因素進行多重 Logistic 回歸分析。使用獨立樣本的 t 檢驗，分析 NOX 活性和尿 8-OH-dG 水平。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般資料與 PSG 監測結果分析
共納入 683 例受試者，其中 157 例有認知功能障礙的 OSA 患者為試驗組，526 例無認知功能障礙的 OSA 患者為對照組。兩組年齡、ODI、SIT90、ESS 評分差異無統計學意義（均 P>0.05），體重指數（body mass index，BMI）差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 1。
表1
入組受試者臨床資料及多導睡眠圖結果（
）
2.2 –A930G、C242T 多態性分析
基因多態性分型結果見表 2。–A930G 等位基因攜帶者（GG/AG 基因型）頻率在兩組間差異無統計學意義（P>0.05）。與合并認知功能障礙的 OSA 受試者相比，無認知功能障礙的 OSA 受試者 TT/CT 基因型頻率明顯升高（P<0.05）。Logistic 回歸分析結果證實，等位基因 T 載體是認知功能障礙的保護因素（OR=0.37，95%CI 0.18～0.75）。
表2
有和無認知功能障礙的 OSA 受試者基因型分析
2.3 NOX 活性與尿 8-OH-dG 測定
如表 3、表 4 所示，與無認知功能障礙 OSA 受試者比較，認知功能障礙 OSA 受試者 NOX 活性較高（P<0.01）；與具有等位基因 T 變異的受試者比較，無等位基因突變的受試者具有更高的 NOX 活性（P<0.05）。與無認知功能障礙 OSA 受試者比較，認知功能障礙 OSA 受試者尿 8-OH-dG 水平較高（P<0.05）；與具有 T 等位基因變異受試者比較，無等位基因 T 變異的受試者尿 8-OH-dG 水平更高（P<0.05）。
表3
有和無認知功能障礙的 OSA 受試者 NOX 活性與尿 8-OH-dG 的比較（
）
表4
有和無 T 等位基因變異的 OSA 受試者 NOX 活性與尿 8-OH-dG 的比較（
）
3 討論
OSA 患者認知功能障礙的發生與氧化應激相關。p22phox C242T 多態性的 CC 基因型是 OSA 患者影響認知功能障礙的危險因素之一。同時，攜帶 p22phox C242T 多態性的 CC 基因型且伴有認知功能障礙的 OSA 患者高度暴露于 NOX 介導的氧化應激。NADPH 活化可通過 ROS 介導的機制參與 OSA 的發生發展過程。因此，氧化應激的增加可能是 OSA 的危險因素[20]。氧化應激不僅是認知功能障礙和 OSA 的重要組成部分，還是其相關并發癥（如肥胖癥、糖尿病、高血壓、冠心病）的關鍵因素[21-22]。目前影響 OSA 患者認知功能障礙的具體基因機制尚不明確。Guzik 等[23]已證實 C242T 等位基因與動脈粥樣硬化患者血管 NOX 活性降低有關。Cahilly 等[24]和 Moreno 等[15]提出，T 等位基因對動脈粥樣硬化和高血壓等幾種病態具有保護作用。薈萃分析同樣顯示，T 等位基因似乎對亞洲人群冠狀動脈疾病具有保護作用[25]。本研究發現，p22phox C242T 的 T 等位基因與 OSA 患者認知功能障礙的低發生率相關。據目前資料顯示，這是 C242T CYBA 基因多態性對中國成人認知功能障礙影響的首次研究。
對于–A930G 多態性，先前研究表明 GG 純合子可能產生過量的超氧化物[14]，但在我們的研究中，它在有無認知功能障礙的 OSA 患者之間差異并無統計學意義；而且，–A930G 多態性的作用似乎超出了氧化應激反應的調節。之前研究表明，–930A/G 的不同基因型之間的 NOX 活性和低密度脂蛋白水平沒有顯著差異[26]。由此看來，G 等位基因攜帶者由于暴露于多重有害刺激，在疾病發展過程中更容易合并認知功能障礙。為證實上述觀點，可能需要更多的受試者或進行動物實驗。
本研究也有一定的局限性。首先，本研究未包括 p22phox 的所有遺傳變異，我們將進一步研究其他 NOX 亞基的遺傳多態性。其次，我們只研究了華中漢族人群 p22phox C242T 多態性，但是多民族的研究更容易得到假陽性結果。
總之，p22phox C242T 多態性可能參與了 OSA 合并認知功能障礙患者的氧化應激的發生發展，仍需要進一步的研究來描述 p22phox C242T 基因和 NOX 在 OSA 認知功能障礙機制中的確切作用。
