引用本文： 陳鳳惟, 張成, 董慧, 王奇敏, 馬靖, 王廣發. 慢性間歇低氧上調心肌 lncRNA MALAT1 及相關分子的表達. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(4): 377-382. doi: 10.7507/1671-6205.201710025 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）的臨床特征為睡眠時反復發生上氣道阻塞或狹窄所致間歇低氧伴高二氧化碳，并伴微覺醒，是多種心血管疾病及代謝綜合征等的獨立危險因素[1]。慢性間歇低氧伴二氧化碳潴留是 OSA 特征性的病理生理改變，Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）、缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、白細胞介素（interleukins，ILs）、γ 干擾素、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多種重要的天然免疫分子和炎癥因子參與間歇低氧造成的組織損傷[2-3]。然而在動物實驗中，針對上述單一因子的干預都未取得理想效果。因此，我們推測 OSA 引起的損傷機制中可能還存在其他上游關鍵因子參與了炎癥調控。
在調控細胞因子功能的分子中，長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）越來越受到關注。它們位于基因非編碼區，不編碼蛋白質，卻能通過在細胞核內調控轉錄因子、改變染色質、剪切前體 mRNA（pre-mRNA）和在細胞質內干擾核糖核蛋白及影響 mRNA 穩定性等機制來調控許多蛋白和分子的表達，進而在腫瘤、炎癥、心血管疾病和代謝性疾病中起到關鍵調控作用[4-5]，并成為心血管疾病治療的潛在靶位[6]。其中，轉移相關肺腺癌轉錄本 1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）與內皮細胞和心血管疾病關系十分密切。它可通過調節 pre-mRNA 的選擇性剪接來調節細胞功能[7-8]，參與內皮細胞的損傷修復[7-9]，與 HIF-1α 存在相互作用[9-10]，調控急性缺血缺氧損傷后反應[9, 11-15]。
基于以上線索，我們推測 MALAT1 可能作為上游因子也參與了 OSA 相關慢性間歇低氧的病理生理過程。因此，本研究通過檢測心肌中 MALAT1 及其相關因子在 OSA 缺氧模式下的表達，探索 MALAT1 是否參與了 OSA 相關的免疫炎癥調控。
1 材料與方法
1.1 試驗動物和分組
成年健康雄性 SD 大鼠，體重 280～350 g，由北京聯合利華實驗動物中心提供。設正常對照組（N 組，呼吸空氣），持續低氧組（CH 組，氧濃度持續 10.0%±0.5%），間歇低氧組（IH 組，氧濃度在 10%～21% 之間循環），間歇低氧伴高二氧化碳組（IHH 組，氧濃度在 10%～21% 之間循環，二氧化碳濃度在 5%～0% 之間與氧氣同步循環）。
1.2 方法
各組循環方法如圖 1 所示。各組呼吸氣體濃度處理由低氧艙自動控制，每 2 min 循環 1 次。每天 6 h。1 周、2 周、3 周后處死并提取心臟組織轉移至–80 ℃ 保存。稱取 50 mg 心肌組織進行 qPCR 檢測。
圖1
不同組別不同氧環境中氣體濃度的變化曲線
使用 TransZol Up 及 TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis 反轉錄試劑盒（TransGen Biotech）提取心肌 RNA 并反轉錄成 cDNA，操作均按照說明書進行。所得 cDNA 置于–20 ℃ 保存。
使用 ABI 7500 型定量 PCR 儀、TransStart Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech）試劑盒，對各組心肌組織中 MALAT1、HIF-1α、TLR4、IL-6、TNF-α 的 RNA 相對表達量進行 qRT-PCR 檢測。內參基因為 GAPDH。引物合成由生工生物公司提供。各基因引物序列如表 1 所示。用 2–ΔΔCt法計算靶基因的相對表達量。
表1
引物序列
1.3 統計學方法
使用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。數據采用均數±標準差（
±s）表示。樣本均數的比較采用單因素方差分析，樣本均數間的兩兩比較用 LSD 法，相關性分析采用 Spearman 法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 低氧處理對 MALAT1 RNA 表達量的影響
如圖 2 和表 2 所示，各組處理 1 周、2 周及 3 周，CH 組、IH 組、IHH 組心肌 MALAT1 的 mRNA 表達量較 N 組均有升高趨勢。但僅 IHH 組在處理 2 周及 3 周時 MALAT1 表達量較 N 組、IH 組及 CH 組顯著升高，差異有統計學意義。N 組與 CH 及 IH 組比較差異無統計學意義。
圖2
qRT-PCR 檢測顯示低氧處理后 MALAT1 mRNA 的 相對表達
與 N 組比較，**
表2
低氧處理后 MALAT1 mRNA 的相對表達（n=8，
）
2.2 低氧處理 3 周時 MALAT1 相關炎癥因子 mRNA 的表達量
如圖 3 所示，低氧處理 3 周時 IHH 組 HIF-1α、TLR4、IL-6 的 mRNA 表達量均較其他三組顯著升高，此結果與 MALAT1 的變化趨勢一致。缺氧處理的 TNF-α 表達量較 N 組也有升高趨勢，但差異沒有顯著性。
圖3
qRT-PCR 檢測顯示低氧處理 3 周后各組 HIF-1α、TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA 的相對表達
與 N 組比較，*
3 討論
本研究結果顯示，間歇低氧伴高二氧化碳（IHH 組）處理 2 周和 3 周后，大鼠心肌組織中 MALAT1 的 mRNA 表達量較其他三組顯著升高，而與之相關的 HIF-1α、TLR4 及炎癥因子 IL-6 的 RNA 也在 IHH 組升高最為顯著，呈現出與 MALAT1 一致的變化趨勢。由以上結果我們可以推測：MALAT1 參與了 OSA 的免疫炎癥反應。
文獻研究表明，MALAT1 作為在各組織作用廣泛的 lncRNA，同時參與了機體缺血缺氧損傷和炎癥反應過程，與內皮細胞關系密切。研究在急性心肌梗死患者全血細胞及缺氧小鼠的腎臟、睪丸等組織中，均發現 MALAT1 表達升高[13-14]，提示 MALAT1 參與缺血缺氧損傷的全身和局部調控。抑制缺氧誘導的 MALAT1 表達，可減少內皮細胞增殖并促進其生長和遷移[9]。此外，干擾 MALAT1 表達會抑制缺血前肢的血管再生[9]，同時可改善糖尿病血管損害及視網膜細胞的功能，減少其死亡[12]。我們的研究發現，間歇低氧伴高二氧化碳處理 2 周和 3 周的大鼠心肌 MALAT1 表達顯著上升，提示其可能參與了 OSA 心肌和內皮損害的病理生理過程。
MALAT1 對很多關鍵炎癥因子和分子具有重要的調控作用。其主要在細胞核內發揮作用，通過調節一種 RNA 結合蛋白——絲氨酸/色氨酸剪接蛋白（SR protein）的磷酸化水平從而對 pre-mRNA 進行選擇性剪接，在 mRNA 水平調控基因表達[7]。本研究所測定的 TLR4、HIF-1α、IL-6、TNF-α 是缺氧損傷和心血管疾病發病機制中的關鍵分子，并都直接或間接受 MALAT1 調控。MALAT1 受脂多糖（lipopolysacchride，LPS）刺激上調，并通過 TLR4 通路下的信號分子核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性調節炎癥水平[16]。缺氧可通過 CaMKK/AMPK/HIF-1α 軸上調 MALAT1 表達[11]，而在砷化物誘導的肝內皮細胞中 MALAT1 通過調節 HIF-1α 促進糖酵解[10]，這提示 MALAT1 與 HIF-1α 在缺氧和損傷條件下可以相互調節促進疾病進展。Puthanveetil 等[15]研究發現高糖刺激的內皮細胞中 MALAT1 表達上調，并通過刺激血清淀粉樣蛋白 3（serum amyloid protein A3，SAA3）上調 IL-6 和 TNF-α mRNA 和蛋白的表達，促進炎癥的級聯反應。我們的研究也發現 MALAT1 的表達與上述相關因子上調趨勢一致，推測它可能通過調控這些因子參與到 OSA 的炎癥反應中。但它具體在 OSA 損傷中起何種作用，還需要進一步通過功能實驗驗證。
但需要指出的是，MALAT1 在復雜的炎癥因子網絡中的角色仍有爭議。有報道顯示心肌細胞 MALAT1 可被 LPS 刺激產生的 IL-6 上調，進一步通過 SAA3 促進 TNF-α 等炎癥因子的表達[17]。而另一些研究發現 MALAT1 是炎癥反應通路中的負反饋因子，具有抵抗缺血性卒中引起的腦組織炎癥和抗凋亡作用[18]，也可通過與 NF-κB 負反饋降低 LPS 引起的巨噬細胞炎癥反應[16]。上述研究關于 MALAT1 是炎癥反應的促進因子還是抑制因子結論不一致，可能與其研究的組織細胞、生理過程及給予的刺激物不同有關。
本研究的另一發現是，與 CH 組和 IH 組不同，IHH 組的 MALAT1 及其相關因子表達上調最顯著，且與對照組比較差異有統計學意義。既往關于 OSA 低氧損傷機制的研究多采用單純間歇低氧模型，但 OSA 的特征病理生理變化是低氧伴高二氧化碳（高碳酸血癥），因此我們在本研究中加入了該種低氧模式。結果也提示，相較于單純持續缺氧，慢性間歇低氧伴高二氧化碳對 MALAT1 及炎癥的影響更嚴重。這也提示 OSA 相關間歇低氧伴高二氧化碳的病理生理損害是不同于其他低氧模式的，但具體機制仍不清楚。目前二氧化碳在某些病生理過程中到底是損傷作用還是保護作用的結果并不一致[19]，可能與不同的疾病過程和研究方法有關。動物實驗發現，二氧化碳噴霧預處理可以減輕大鼠心肌梗死的損傷程度[20]。在急性呼吸窘迫綜合征小潮氣量保護性通氣策略中，曾有實驗和觀點認為二氧化碳可能具有一定臟器保護作用[21]，但也有研究認為長期高二氧化碳是有害的[22-23]。另一些研究發現，高二氧化碳不僅可導致副交感神經功能紊亂[24]，還可改變 NF-κB 信號通路基因表達水平[25]，加重肺的炎癥損傷[26-27]；腹腔二氧化碳濃度上升可引起脾臟炎癥反應和血白細胞及中性粒細胞水平上升[28]。我們的研究結果提示，高碳酸血癥可能在 OSA 中協同低氧進一步促進 MALAT1 及炎癥因子表達。
本研究也存在一定的局限性：（1）動物模型研究，樣本量較小；（2）僅檢測 mRNA 水平，未檢測炎癥因子的蛋白表達水平；（3）單純檢測上述因子的表達量變化，沒有干預實驗、信號通路研究和與病理生理的相關分析，不能說明因果關系，還需后續實驗進行功能研究，并明確組織定位，闡明 MALAT1 在 OSA 損傷的具體作用；（4）沒有單純高二氧化碳組探討二氧化碳的作用，需要后續完善。
總之，本研究結果顯示心肌 MALAT1 在間歇低氧伴高二氧化碳處理后表達升高，并與相關因子 TLR4、HIF-1α、IL-6、TNF-α 趨勢一致，提示 MALAT1 可受低氧伴高二氧化碳影響而上調，并參與 OSA 炎癥損傷。未來需要臨床研究驗證 MALAT1 與 OSA 心血管合并癥之間的關系，并通過體外實驗和功能研究進一步闡明 MALAT1 在 OSA 缺氧模式中的作用機制。
阻塞性睡眠呼吸暫停（obstructive sleep apnea，OSA）的臨床特征為睡眠時反復發生上氣道阻塞或狹窄所致間歇低氧伴高二氧化碳，并伴微覺醒，是多種心血管疾病及代謝綜合征等的獨立危險因素[1]。慢性間歇低氧伴二氧化碳潴留是 OSA 特征性的病理生理改變，Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）、缺氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）、白細胞介素（interleukins，ILs）、γ 干擾素、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多種重要的天然免疫分子和炎癥因子參與間歇低氧造成的組織損傷[2-3]。然而在動物實驗中，針對上述單一因子的干預都未取得理想效果。因此，我們推測 OSA 引起的損傷機制中可能還存在其他上游關鍵因子參與了炎癥調控。
在調控細胞因子功能的分子中，長鏈非編碼 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）越來越受到關注。它們位于基因非編碼區，不編碼蛋白質，卻能通過在細胞核內調控轉錄因子、改變染色質、剪切前體 mRNA（pre-mRNA）和在細胞質內干擾核糖核蛋白及影響 mRNA 穩定性等機制來調控許多蛋白和分子的表達，進而在腫瘤、炎癥、心血管疾病和代謝性疾病中起到關鍵調控作用[4-5]，并成為心血管疾病治療的潛在靶位[6]。其中，轉移相關肺腺癌轉錄本 1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）與內皮細胞和心血管疾病關系十分密切。它可通過調節 pre-mRNA 的選擇性剪接來調節細胞功能[7-8]，參與內皮細胞的損傷修復[7-9]，與 HIF-1α 存在相互作用[9-10]，調控急性缺血缺氧損傷后反應[9, 11-15]。
基于以上線索，我們推測 MALAT1 可能作為上游因子也參與了 OSA 相關慢性間歇低氧的病理生理過程。因此，本研究通過檢測心肌中 MALAT1 及其相關因子在 OSA 缺氧模式下的表達，探索 MALAT1 是否參與了 OSA 相關的免疫炎癥調控。
1 材料與方法
1.1 試驗動物和分組
成年健康雄性 SD 大鼠，體重 280～350 g，由北京聯合利華實驗動物中心提供。設正常對照組（N 組，呼吸空氣），持續低氧組（CH 組，氧濃度持續 10.0%±0.5%），間歇低氧組（IH 組，氧濃度在 10%～21% 之間循環），間歇低氧伴高二氧化碳組（IHH 組，氧濃度在 10%～21% 之間循環，二氧化碳濃度在 5%～0% 之間與氧氣同步循環）。
1.2 方法
各組循環方法如圖 1 所示。各組呼吸氣體濃度處理由低氧艙自動控制，每 2 min 循環 1 次。每天 6 h。1 周、2 周、3 周后處死并提取心臟組織轉移至–80 ℃ 保存。稱取 50 mg 心肌組織進行 qPCR 檢測。
圖1
不同組別不同氧環境中氣體濃度的變化曲線
使用 TransZol Up 及 TransScript All-in-one First-Strand cDNA Synthesis 反轉錄試劑盒（TransGen Biotech）提取心肌 RNA 并反轉錄成 cDNA，操作均按照說明書進行。所得 cDNA 置于–20 ℃ 保存。
使用 ABI 7500 型定量 PCR 儀、TransStart Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech）試劑盒，對各組心肌組織中 MALAT1、HIF-1α、TLR4、IL-6、TNF-α 的 RNA 相對表達量進行 qRT-PCR 檢測。內參基因為 GAPDH。引物合成由生工生物公司提供。各基因引物序列如表 1 所示。用 2–ΔΔCt法計算靶基因的相對表達量。
表1
引物序列
1.3 統計學方法
使用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。數據采用均數±標準差（
±s）表示。樣本均數的比較采用單因素方差分析，樣本均數間的兩兩比較用 LSD 法，相關性分析采用 Spearman 法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 低氧處理對 MALAT1 RNA 表達量的影響
如圖 2 和表 2 所示，各組處理 1 周、2 周及 3 周，CH 組、IH 組、IHH 組心肌 MALAT1 的 mRNA 表達量較 N 組均有升高趨勢。但僅 IHH 組在處理 2 周及 3 周時 MALAT1 表達量較 N 組、IH 組及 CH 組顯著升高，差異有統計學意義。N 組與 CH 及 IH 組比較差異無統計學意義。
圖2
qRT-PCR 檢測顯示低氧處理后 MALAT1 mRNA 的 相對表達
與 N 組比較，**
表2
低氧處理后 MALAT1 mRNA 的相對表達（n=8，
）
2.2 低氧處理 3 周時 MALAT1 相關炎癥因子 mRNA 的表達量
如圖 3 所示，低氧處理 3 周時 IHH 組 HIF-1α、TLR4、IL-6 的 mRNA 表達量均較其他三組顯著升高，此結果與 MALAT1 的變化趨勢一致。缺氧處理的 TNF-α 表達量較 N 組也有升高趨勢，但差異沒有顯著性。
圖3
qRT-PCR 檢測顯示低氧處理 3 周后各組 HIF-1α、TLR4、TNF-α、IL-6 mRNA 的相對表達
與 N 組比較，*
3 討論
本研究結果顯示，間歇低氧伴高二氧化碳（IHH 組）處理 2 周和 3 周后，大鼠心肌組織中 MALAT1 的 mRNA 表達量較其他三組顯著升高，而與之相關的 HIF-1α、TLR4 及炎癥因子 IL-6 的 RNA 也在 IHH 組升高最為顯著，呈現出與 MALAT1 一致的變化趨勢。由以上結果我們可以推測：MALAT1 參與了 OSA 的免疫炎癥反應。
文獻研究表明，MALAT1 作為在各組織作用廣泛的 lncRNA，同時參與了機體缺血缺氧損傷和炎癥反應過程，與內皮細胞關系密切。研究在急性心肌梗死患者全血細胞及缺氧小鼠的腎臟、睪丸等組織中，均發現 MALAT1 表達升高[13-14]，提示 MALAT1 參與缺血缺氧損傷的全身和局部調控。抑制缺氧誘導的 MALAT1 表達，可減少內皮細胞增殖并促進其生長和遷移[9]。此外，干擾 MALAT1 表達會抑制缺血前肢的血管再生[9]，同時可改善糖尿病血管損害及視網膜細胞的功能，減少其死亡[12]。我們的研究發現，間歇低氧伴高二氧化碳處理 2 周和 3 周的大鼠心肌 MALAT1 表達顯著上升，提示其可能參與了 OSA 心肌和內皮損害的病理生理過程。
MALAT1 對很多關鍵炎癥因子和分子具有重要的調控作用。其主要在細胞核內發揮作用，通過調節一種 RNA 結合蛋白——絲氨酸/色氨酸剪接蛋白（SR protein）的磷酸化水平從而對 pre-mRNA 進行選擇性剪接，在 mRNA 水平調控基因表達[7]。本研究所測定的 TLR4、HIF-1α、IL-6、TNF-α 是缺氧損傷和心血管疾病發病機制中的關鍵分子，并都直接或間接受 MALAT1 調控。MALAT1 受脂多糖（lipopolysacchride，LPS）刺激上調，并通過 TLR4 通路下的信號分子核因子 κB（nuclear factor-κB，NF-κB）活性調節炎癥水平[16]。缺氧可通過 CaMKK/AMPK/HIF-1α 軸上調 MALAT1 表達[11]，而在砷化物誘導的肝內皮細胞中 MALAT1 通過調節 HIF-1α 促進糖酵解[10]，這提示 MALAT1 與 HIF-1α 在缺氧和損傷條件下可以相互調節促進疾病進展。Puthanveetil 等[15]研究發現高糖刺激的內皮細胞中 MALAT1 表達上調，并通過刺激血清淀粉樣蛋白 3（serum amyloid protein A3，SAA3）上調 IL-6 和 TNF-α mRNA 和蛋白的表達，促進炎癥的級聯反應。我們的研究也發現 MALAT1 的表達與上述相關因子上調趨勢一致，推測它可能通過調控這些因子參與到 OSA 的炎癥反應中。但它具體在 OSA 損傷中起何種作用，還需要進一步通過功能實驗驗證。
但需要指出的是，MALAT1 在復雜的炎癥因子網絡中的角色仍有爭議。有報道顯示心肌細胞 MALAT1 可被 LPS 刺激產生的 IL-6 上調，進一步通過 SAA3 促進 TNF-α 等炎癥因子的表達[17]。而另一些研究發現 MALAT1 是炎癥反應通路中的負反饋因子，具有抵抗缺血性卒中引起的腦組織炎癥和抗凋亡作用[18]，也可通過與 NF-κB 負反饋降低 LPS 引起的巨噬細胞炎癥反應[16]。上述研究關于 MALAT1 是炎癥反應的促進因子還是抑制因子結論不一致，可能與其研究的組織細胞、生理過程及給予的刺激物不同有關。
本研究的另一發現是，與 CH 組和 IH 組不同，IHH 組的 MALAT1 及其相關因子表達上調最顯著，且與對照組比較差異有統計學意義。既往關于 OSA 低氧損傷機制的研究多采用單純間歇低氧模型，但 OSA 的特征病理生理變化是低氧伴高二氧化碳（高碳酸血癥），因此我們在本研究中加入了該種低氧模式。結果也提示，相較于單純持續缺氧，慢性間歇低氧伴高二氧化碳對 MALAT1 及炎癥的影響更嚴重。這也提示 OSA 相關間歇低氧伴高二氧化碳的病理生理損害是不同于其他低氧模式的，但具體機制仍不清楚。目前二氧化碳在某些病生理過程中到底是損傷作用還是保護作用的結果并不一致[19]，可能與不同的疾病過程和研究方法有關。動物實驗發現，二氧化碳噴霧預處理可以減輕大鼠心肌梗死的損傷程度[20]。在急性呼吸窘迫綜合征小潮氣量保護性通氣策略中，曾有實驗和觀點認為二氧化碳可能具有一定臟器保護作用[21]，但也有研究認為長期高二氧化碳是有害的[22-23]。另一些研究發現，高二氧化碳不僅可導致副交感神經功能紊亂[24]，還可改變 NF-κB 信號通路基因表達水平[25]，加重肺的炎癥損傷[26-27]；腹腔二氧化碳濃度上升可引起脾臟炎癥反應和血白細胞及中性粒細胞水平上升[28]。我們的研究結果提示，高碳酸血癥可能在 OSA 中協同低氧進一步促進 MALAT1 及炎癥因子表達。
本研究也存在一定的局限性：（1）動物模型研究，樣本量較小；（2）僅檢測 mRNA 水平，未檢測炎癥因子的蛋白表達水平；（3）單純檢測上述因子的表達量變化，沒有干預實驗、信號通路研究和與病理生理的相關分析，不能說明因果關系，還需后續實驗進行功能研究，并明確組織定位，闡明 MALAT1 在 OSA 損傷的具體作用；（4）沒有單純高二氧化碳組探討二氧化碳的作用，需要后續完善。
總之，本研究結果顯示心肌 MALAT1 在間歇低氧伴高二氧化碳處理后表達升高，并與相關因子 TLR4、HIF-1α、IL-6、TNF-α 趨勢一致，提示 MALAT1 可受低氧伴高二氧化碳影響而上調，并參與 OSA 炎癥損傷。未來需要臨床研究驗證 MALAT1 與 OSA 心血管合并癥之間的關系，并通過體外實驗和功能研究進一步闡明 MALAT1 在 OSA 缺氧模式中的作用機制。
