引用本文： 汪小亞, 濮家源, 白雪, 魯文強, 馮濤. 阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者胰島素抵抗狀態及與外周血單個核細胞的內源性大麻素Ⅰ型受體蛋白表達的關系. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(4): 383-389. doi: 10.7507/1671-6205.201706024 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是指在睡眠過程中由于睡眠時上氣道反復發生完全或部分塌陷，進而阻塞氣道引起的通氣不足和呼吸暫停，同時伴有打鼾、頻繁的血氧飽和度（blood oxygen saturation，SaO2）下降、睡眠結構紊亂以及白天嗜睡等表現的臨床綜合征。由于長期反復發作的低氧血癥和高碳酸血癥可以引起機體各器官系統廣泛的損傷，因此 OSAHS 對機體各器官系統的影響尤其是代謝系統的影響是目前研究的熱點。2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是當前另外一種也可以引起全身各器官系統廣泛損傷并對人類健康有重要影響的常見病和多發病。近年來，大量的研究開始關注 OSAHS 與代謝綜合征及糖尿病的關系。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是糖尿病前期的重要特征。許多研究已證實 OSAHS 是 IR 及 T2DM 的獨立危險因素，T2DM 在 OSAHS 患者中的患病率高達 15%～30%[1]。目前認為，間歇性低氧對胰島素信號通路的抑制作用有可能是 OSAHS 導致 IR 的重要機制[2]。
內源性大麻素系統（endocannabinoid system，ECS）包括內源性大麻素、內源性大麻素受體（cannabinoid receptor，CBR）及內源性大麻素降解酶[3]。幾乎所有類型的細胞都可以產生內源性大麻素，然而其最重要來源是血管平滑肌細胞、內皮細胞、神經細胞和血細胞[4]。ECS 在體內參與糖類、脂肪代謝、調控能量平衡及調控體重，具有廣泛的生理功能[5]。ECS 異常活化在糖代謝紊亂及 T2DM 的發生發展過程中發揮重要的作用。臨床研究表明，肥胖患者、IR 患者及 OSAHS 患者血液循環中 N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）、2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol，2-AG）等內源性大麻素增加[6-7]。由此我們推測 ECS 可能參與 OSAHS 導致 IR 的病理生理過程。外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）即外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞，是機體免疫系統的重要組成部分。PBMC 中的巨噬細胞、單核細胞具有獨立表達內源性大麻素Ⅰ型受體（cannabinoid receptor 1，CB1R）、內源性大麻素Ⅱ型受體（cannabinoid receptor 2，CB2R）和分泌內源性大麻素的功能[8]，很多促炎細胞因子可以增加 CB1R 和 CB2R 在 PBMC 的表達水平，可能是很多疾病 PBMC 中 CB1R 和 CB2R 表達增加的原因[9]。目前認為 PBMC 是機體整體 ECS 的重要組成部分，研究 PBMC 所具有的內源性大麻素代謝狀況，有助于了解機體整體 ECS 的代謝狀況[9-10]。
本研究旨在通過分析 OSAHS 對糖代謝及胰島素敏感性的影響，同時檢測 OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達，初步判斷 OSAHS 患者 ECS 與胰島素敏感性之間的關系，探索 OSAHS 患者發生糖代謝紊亂及 IR 的機制。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究方案在蘭州大學第一醫院倫理委員會備案并獲批準，所有受試者均簽署知情同意書。選擇 2014 年 10 月至 2015 年 7 月期間在蘭州大學第一醫院就診并主訴睡眠時打鼾、憋氣及白天嗜睡者為初步研究對象，經過詢問病史、體格檢查、常規檢查及知情同意后排除既往診斷過 OSAHS、糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病，感染性疾病，內分泌失調、長期嚴重酗酒、有嚴重肺部疾病（如哮喘、支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病）、嚴重肝臟疾病、腎臟、腦部疾病及不同意參與本研究者。同時需要排除近期或正在服用糖皮質激素、降壓藥、減肥降脂藥物者，以及其他可能影響血液葡萄糖、胰島素及內源性大麻素水平者。研究對象的納入、排除標準參考文獻[6]設定。
1.2 方法
1.2.1 多導睡眠圖（polysomnography，PSG）監測
監測當天要求受試者禁止飲酒、飲茶、禁服鎮靜劑、催眠藥及咖啡因類藥物。剃胡須、洗臉。監測當晚清淡飲食，不宜飲食過飽。于晚 10 時之前到達睡眠監測室。PSG 監測過程符合標準操作規程，監測指標包括胸腹運動、口鼻氣流、心電圖、眼動圖、腦電圖、下頜肌電圖、腿動、體位、鼾聲、SaO2 等。查看各導聯信號情況，必要時進行調整直至滿意。
1.2.2 PSG 監測后數據采集
（1）空腹 8 h 后在靜息狀態下測量身高、體重、頸圍、腹圍、血壓：使用經過校正的醫用體重秤測量體重及身高，體重讀數要求精確至 0.5 kg，身高讀數要求準確至 1 mm。依據體重和身高計算體重指數（body mass index，BMI），BMI=體重/身高2，單位為 kg/m2。測量腹圍和頸圍的讀數準確至 1 mm。
（2）血液標本的采集及處理：采取受試者靜脈血約 10 ml，分成 3 份，3 ml 靜脈血經常規離心后檢測血糖及血脂，2 ml 靜脈血經乙二胺四乙酸抗凝后檢測胰島素水平，5 ml 靜脈血經提取 PBMC 后保存于–80 ℃ 冰箱用于檢測 CB1R 蛋白表達。所有研究對象抽血標本均無溶血。PBMC 提取采用 Ficoll 密度梯度分離法，具體方法：于放置 5 ml 外周靜脈血的乙二胺四乙酸抗凝管中加入等體積的 0.9% 生理鹽水稀釋，輕搖混勻；將冷藏回溫的適量淋巴細胞分離液加入 15 ml 離心管中，小心吸取已稀釋的外周靜脈血標本，按 1.5∶1 的比例沿管壁緩慢、勻速加入，確保血液標本與分離液無混合；離心管放入水平離心機，配平，2 000 r/min，離心 20 min；離心后取出可觀察標本分成 5 層，由上至下分別為血漿層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液、白細胞層、紅細胞層；小心吸取呈白色霧狀的單個核細胞層，置于新的離心管中，加入 PBS 緩沖液，1 000 r/min，離心 5 min，洗滌 2 次后棄掉離心管上面的 PBS 緩沖液，保留余下的細胞；加入適量 PBS 緩沖液懸浮細胞，–80 ℃ 冰箱冷凍備用。
（3）生化指標測定及 IR 程度的計算：使用全自動生化分析儀（美國 Beckman Coulter LX-20 型）檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）和血糖等指標。血清胰島素水平檢測采用放射免疫法（天津九鼎生物技術有限公司藥盒）。以上指標均在蘭州大學第一醫院檢驗科及內分泌研究室檢測。空腹血糖受損定義為空腹血糖高于正常，但尚未達到糖尿病水平，即≥6.1 mmol/L 但<7.0 mmol/L。空腹血糖≥7.0 mmol/L 定義為糖尿病。利用穩態模型的胰島素抵抗指數（homeostasis model of assessment for insulin resistance index，HOMA-IR）評價 IR 程度，應用牛津大學在線計算器（www.dtu.ox.ac.uk/homacalculator）計算，在對話框中輸入空腹葡萄糖和胰島素水平可自動計算出 HOMA% 和 HOMA-IR。HOMA% 表示該受試者的胰島素敏感性相當于正常成年人胰島素敏感性的百分比。HOMA-IR 是 HOMA% 的倒數，表示 IR 的程度。該方法計算的胰島素敏感性與經典的葡萄糖鉗夾試驗的結果具有非常高的相關性，其準確性已經得到研究證實[11]。
（4）PBMC 的 CB1R 蛋白檢測：隨機選擇各組研究對象 6 例（其中男 4 例，女 2 例），采用蛋白免疫印跡（Western blot）技術檢測每位研究對象 PBMC 的 CB1R 表達水平。包括蛋白樣品制備、蛋白電泳分離、轉膜、封閉、加一抗、加二抗、顯色、曝光、圖像獲取和定量分析等步驟，用 Quantity One 軟件對所有條帶進行灰度掃描而獲得灰度值。用 CB1R 蛋白目的條帶（分子量 64 kD）的灰度值比上 β-肌動蛋白（β-actin）內對照（分子量 43 kD）的灰度值進行半定量分析，具體方法參考 Nong 等[12]的方法。
1.2.3 OSAHS 診斷標準及分組
OSAHS 診斷標準參照我國最新的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南（2011 年修訂版）》[13]。符合 OSAHS 診斷標準的患者根據呼吸暫停低通氣指數（apnea hypopnea index，AHI）分為三個亞組：5 次/h≤AHI≤15 次/h 為輕度 OSAHS 組，15 次/h<AHI≤30 次/h 為中度 OSAHS 組，AHI>30 次/h 為重度 OSAHS 組。AHI<5 次/h 者納入對照組。
1.3 統計學方法
采用 IBM SPSS 19.0 （SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA）軟件。使用柯爾莫諾夫-斯米爾諾夫（Kolmogorov-Smirnov）檢驗檢測數據分布方式。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示。兩組均數之間的比較采用 T 檢驗，多組均數之間的比較采用單因素方差分析和最小差異法。計數資料的比較使用 χ2 檢驗。不同變量之間的相關性分析采用皮爾森相關系數（Pearson correlation coefficient）。去除混雜因素的相關性分析采用偏相關分析。所有統計檢驗均為雙側，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組研究對象的各項檢測指標比較
本研究共納入 88 例受試者，經行 PSG 監測，其中 64 例符合 OSAHS 診斷，24 例受試者 AHI<5 次/h，遂納入作為對照組。OSAHS 組和對照組患者之間年齡、性別構成、BMI、腰圍、甘油三脂和空腹血糖水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），而收縮壓、舒張壓、AHI、平均血氧飽和度（mean oxygen saturation，MSaO2）、最低血氧飽和度（lowest oxygen saturation，LSaO2）、血氧飽和度低于 90% 所占總睡眠時間的百分比（percentage of time that oxygen saturation below90%，SIT90）、TC、LDL-C、HDL-C、空腹胰島素水平和 HOMA-IR 兩組之間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 1。
表1
兩組研究對象臨床特征比較（
）
2.2 OSAHS 患者各亞組之間各項檢測指標比較
64 例 OSAHS 患者依據 AHI 分為輕度、中度、重度三個亞組，分別有 18、24 和 22 例。三組患者之間年齡、性別構成、腰圍、SIT90 及空腹血糖比較，差異無統計學意義（P>0.05），而 BMI、收縮壓、舒張壓、AHI、MSaO2、LSaO2、SIT90 、TC、LDL-C、HDL-C、TG、空腹胰島素水平及 HOMA-IR 三組之間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 2。
表2
輕度、中度及重度 OSAHS 患者各檢測指標比較（
）
2.3 兩組研究對象糖代謝紊亂檢出情況比較
依據相關診斷標準，OSAHS 組患者中糖尿病及空腹血糖受損者分別有 5 和 13 例，而對照組中糖尿病及空腹血糖受損者均只有 1 例。OSAHS 組患者中糖尿病及空腹血糖受損者比例顯著高于對照組糖尿病及空腹血糖受損者的比例（28.12% 比 8.33%，χ2=3.89，P<0.05）。
2.4 OSAHS 患者胰島素敏感性和睡眠監測指標之間的關系
相關分析表明，HOMA-IR 與 AHI、LSaO2、MSaO2及 SIT90 均呈顯著相關（r 值分別為 0.44、–0.44、–0.25 和 0.34；均 P <0.05）（ 圖 1）。控制了各組患者年齡、身高、體重、BMI、腰圍、收縮壓、舒張壓和血脂后的偏相關分析顯示，HOMA-IR 與 AHI 及 LSaO2仍具有統計學意義（r 值分別為 0.32 和–0.41，均 P<0.05），而與 MSaO2 及 SIT90 的相關性不再具有顯著性（均 P>0.05）。
圖1
OSAHS 患者 HOMA-IR 與睡眠監測各指標的相關性分析
2.5 各組研究對象 PBMC 的 CB1R 蛋白表達情況
Western blot 檢測結果表明，對照組、輕度 OSAHS 組、中度 OSAHS 組及重度 OSAHS 組 PBMC 表面 CB1R 蛋白相對表達量分別為 0.04±0.01、0.37±0.09、0.40±0.07 和 0.62±0.14。OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達量明顯高于對照組（t=–9.84，P<0.01），并且隨著 OSAHS 病情加重，PBMC 的 CB1R 蛋白表達量也逐步升高，重度 OSAHS 組 PBMC 的 CB1R 蛋白表達量明顯高于輕度及中度 OSAHS 組（t 值分別為 3.80 和 3.35，P<0.01），而輕度 OSAHS 組和中度 OSAHS 組之間 PBMC 的 CB1R 蛋白表達量比較，差異無統計學意義（t=0.62，P>0.05）（圖 2）。
圖2
各組患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達情況
a. Western blot 檢測像；b. 蛋白相對表達量。OSAHS 組患者 PBMC 的 CB1R 蛋白較對照組顯著增多，且重度 OSAHS 組 PBMC 的 CB1R 蛋白較輕中度 OSAHS 組增多。與對照組比較，**
2.6 PBMC 表面 CB1R 蛋白表達與其他指標的相關分析
PBMC 的 CB1R 蛋白表達與 AHI、MSaO2、LSaO2、TC、LDL-C、空腹胰島素及 HOMA-IR 等指標的相關性具有顯著性（均 P<0.05）（表 3）。
表3
PBMC 表面 CB1R 蛋白表達與其他指標的相關性分析
3 討論
本研究的目的在于探索 OSAHS 患者胰島素敏感性的變化及其與 ECS 之間的關系。結果表明，OSAHS 患者發生 IR 及糖尿病的概率明顯高于對照組，且與 OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達增加密切相關。
IR 是 T2DM 的早期階段，持續的 IR 可最終導致 T2DM。研究證明，OSAHS 可引起 IR 且 IR 的程度與 OSAHS 病情密切相關，AHI 每增加 1 次/h，則 IR 增加 0.5%[14]。本研究表明，相對于對照組，OSAHS 患者 HOMA-IR 明顯增加，且 HOMA-IR 隨著 OSAHS 病情的加重而逐漸升高。在排除了年齡、BMI、腰圍、血脂等混雜因素后，HOMA-IR 仍與 AHI 顯著正相關。另外，OSAHS 患者糖代謝紊亂（包括空腹血糖受損及糖尿病）的檢出比例高于對照組，這些研究結果均提示 OSAHS 是引起 IR 及糖代謝紊亂的獨立危險因素。
OSAHS 引起 IR 的機制非常復雜，包括 OSAHS 對自主神經的影響、對神經內分泌功能的影響以及間歇性低氧本身對糖代謝的影響等[15]，另外，也可能與 OSAHS 引起的促炎細胞因子異常分泌（如白細胞介素-6 和腫瘤壞死因子-α）有關[16]。除了上述機制之外，本研究還發現，作為 ECS 的重要組成部分，OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平顯著升高，并與 OSAHS 患者病情及 IR 狀態密切相關。
ECS 與機體物質能量代謝，尤其是糖代謝關系密切，可以通過以下途徑參與糖代謝調控：（1）直接或間接增進食欲，增加攝入食物，增加體重；（2）促進腹部脂肪沉積，形成肥胖，誘發 IR 形成；（3）刺激胰島素分泌，提高脂肪組織和肌肉組織對葡萄糖的攝取效率[17]。已有研究證實 OSAHS 患者的 ECS 發生相應的變化。Engeli 等[6]發現外周血內源性大麻素水平升高，并推測對 OSAHS 的作用包括對神經系統的保護、對睡眠剝奪的代償[18-19]以及對呼吸模式的調節等方面[20]。另外，OSAHS 患者內源性大麻素水平升高也可能與 OSAHS 患者內源性大麻素降解系統功能下調有關。肥胖患者脂肪組織的脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）表達減少，而 FAAH 是內源性大麻素，尤其是 AEA 和 2-AG 最主要的降解水解酶[21]。由于 OSAHS 患者大多合并肥胖，因此推測類似的機制可能存在于 OSAHS 患者。此外，既往研究證實瘦素可以引起 FAAH 活性增加[22]，而 OSAHS 患者普遍存在瘦素抵抗及瘦素功能失調，繼而引起 FAAH 活性受抑制以及循環中內源性大麻素水平升高[23]。最后，OSAHS 患者血漿內源性大麻素水平升高也可能與并存的 IR 有關，由于胰島素被證實是內源性大麻素的負性調節因子，而 IR 狀態下其負性調節作用減弱，繼而可以引起內源性大麻素水平升高[24]。反過來，血漿內源性大麻素水平升高又可作為 OSAHS 狀態下胰島素敏感性下降的初步補償機制。內源性大麻素與 IR 也有密切關系[25]，升高的內源性大麻素可以激活大麻素 CB1R 蛋白，繼而抑制骨骼肌對葡萄糖的攝取，增加腹部脂肪的沉積以及增加游離脂肪酸從脂肪組織進入肝臟，這些都有助于促使 IR 的發生發展[26]。
本研究表明，相對于對照組，OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平明顯升高，并且隨著 AHI 增加，CB1R 蛋白表達水平也隨之升高。通過相關分析發現，OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達量與 AHI、MSaO2、LSaO2 等睡眠監測指標及空腹胰島素及 HOMA-IR 等糖代謝紊亂指標具有顯著的相關性，提示 CB1R 蛋白表達水平與 OSAHS 引起的糖代謝紊亂具有密切關系。
CB1R 蛋白是 ECS 的重要組成部分，CB1R 蛋白活化可引起食欲增強、攝食增多、脂肪沉積增多、脂聯素分泌減少、IR 形成等，并最終導致糖代謝紊亂和糖尿病的發生[27]。CB1R 蛋白拮抗劑可減輕內源性大麻素紊亂造成的 IR 和糖代謝異常[28]。給予大鼠口服 CB1R 蛋白拮抗劑后，在引起大鼠食欲減退的同時[29]，葡萄糖和脂肪的氧化分解增加、肝糖原分解增加和總體能量消耗的增高，胰島素敏感性隨之改善，其原因可能為 CB1R 蛋白拮抗后葡萄糖和脂肪氧化作用增強[30]。小鼠 CB1R 蛋白基因敲除后也可觀察到脂肪含量減少、體重下降、血中的胰島素水平降低、胰島素敏感性提高、骨骼肌攝取葡萄糖增加、糖代謝改善等類似現象[31-33]。另外，在胰島 β 細胞的 CB1R 蛋白抑制后可刺激胰島素的分泌、促進靶器官葡萄糖轉運蛋白 4 的表達及葡萄糖的攝取，達到調控血糖水平穩定的目的[34-35]。
本研究有幾點局限性。首先，我們得出的結論主要是基于相關分析。這種分析方法僅僅在宏觀上說明 OSAHS 的嚴重程度、IR 及 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平的關系，而不是從分子機制等深層次方面解釋它們之間的內在聯系。其次，由于經費有限，我們只檢測了部分納入對象 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平，而內源性大麻素是一個龐大的系統，所以單純檢測 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平并不能充分代表真實的 ECS 的活性狀態。因此，有必要進行更深入更系統的研究進一步明確內源性大麻素在 OSAHS 發病過程及引起并發癥的過程中的作用及其機制。上述不足之處也是我們將來科研的發展方向和研究領域。
總之，本研究結果表明 OSAHS 患者存在 IR，并且 IR 程度與 OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平密切相關，提示內源性大麻素在 OSAHS 引起 IR 過程中可能起重要作用。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS）是指在睡眠過程中由于睡眠時上氣道反復發生完全或部分塌陷，進而阻塞氣道引起的通氣不足和呼吸暫停，同時伴有打鼾、頻繁的血氧飽和度（blood oxygen saturation，SaO2）下降、睡眠結構紊亂以及白天嗜睡等表現的臨床綜合征。由于長期反復發作的低氧血癥和高碳酸血癥可以引起機體各器官系統廣泛的損傷，因此 OSAHS 對機體各器官系統的影響尤其是代謝系統的影響是目前研究的熱點。2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是當前另外一種也可以引起全身各器官系統廣泛損傷并對人類健康有重要影響的常見病和多發病。近年來，大量的研究開始關注 OSAHS 與代謝綜合征及糖尿病的關系。胰島素抵抗（insulin resistance，IR）是糖尿病前期的重要特征。許多研究已證實 OSAHS 是 IR 及 T2DM 的獨立危險因素，T2DM 在 OSAHS 患者中的患病率高達 15%～30%[1]。目前認為，間歇性低氧對胰島素信號通路的抑制作用有可能是 OSAHS 導致 IR 的重要機制[2]。
內源性大麻素系統（endocannabinoid system，ECS）包括內源性大麻素、內源性大麻素受體（cannabinoid receptor，CBR）及內源性大麻素降解酶[3]。幾乎所有類型的細胞都可以產生內源性大麻素，然而其最重要來源是血管平滑肌細胞、內皮細胞、神經細胞和血細胞[4]。ECS 在體內參與糖類、脂肪代謝、調控能量平衡及調控體重，具有廣泛的生理功能[5]。ECS 異常活化在糖代謝紊亂及 T2DM 的發生發展過程中發揮重要的作用。臨床研究表明，肥胖患者、IR 患者及 OSAHS 患者血液循環中 N-花生四烯酸氨基乙醇（anandamide，AEA）、2-花生四烯酸甘油（2-arachidonoylglycerol，2-AG）等內源性大麻素增加[6-7]。由此我們推測 ECS 可能參與 OSAHS 導致 IR 的病理生理過程。外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）即外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞，是機體免疫系統的重要組成部分。PBMC 中的巨噬細胞、單核細胞具有獨立表達內源性大麻素Ⅰ型受體（cannabinoid receptor 1，CB1R）、內源性大麻素Ⅱ型受體（cannabinoid receptor 2，CB2R）和分泌內源性大麻素的功能[8]，很多促炎細胞因子可以增加 CB1R 和 CB2R 在 PBMC 的表達水平，可能是很多疾病 PBMC 中 CB1R 和 CB2R 表達增加的原因[9]。目前認為 PBMC 是機體整體 ECS 的重要組成部分，研究 PBMC 所具有的內源性大麻素代謝狀況，有助于了解機體整體 ECS 的代謝狀況[9-10]。
本研究旨在通過分析 OSAHS 對糖代謝及胰島素敏感性的影響，同時檢測 OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達，初步判斷 OSAHS 患者 ECS 與胰島素敏感性之間的關系，探索 OSAHS 患者發生糖代謝紊亂及 IR 的機制。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
本研究方案在蘭州大學第一醫院倫理委員會備案并獲批準，所有受試者均簽署知情同意書。選擇 2014 年 10 月至 2015 年 7 月期間在蘭州大學第一醫院就診并主訴睡眠時打鼾、憋氣及白天嗜睡者為初步研究對象，經過詢問病史、體格檢查、常規檢查及知情同意后排除既往診斷過 OSAHS、糖尿病、惡性腫瘤、自身免疫性疾病，感染性疾病，內分泌失調、長期嚴重酗酒、有嚴重肺部疾病（如哮喘、支氣管擴張、慢性阻塞性肺疾病）、嚴重肝臟疾病、腎臟、腦部疾病及不同意參與本研究者。同時需要排除近期或正在服用糖皮質激素、降壓藥、減肥降脂藥物者，以及其他可能影響血液葡萄糖、胰島素及內源性大麻素水平者。研究對象的納入、排除標準參考文獻[6]設定。
1.2 方法
1.2.1 多導睡眠圖（polysomnography，PSG）監測
監測當天要求受試者禁止飲酒、飲茶、禁服鎮靜劑、催眠藥及咖啡因類藥物。剃胡須、洗臉。監測當晚清淡飲食，不宜飲食過飽。于晚 10 時之前到達睡眠監測室。PSG 監測過程符合標準操作規程，監測指標包括胸腹運動、口鼻氣流、心電圖、眼動圖、腦電圖、下頜肌電圖、腿動、體位、鼾聲、SaO2 等。查看各導聯信號情況，必要時進行調整直至滿意。
1.2.2 PSG 監測后數據采集
（1）空腹 8 h 后在靜息狀態下測量身高、體重、頸圍、腹圍、血壓：使用經過校正的醫用體重秤測量體重及身高，體重讀數要求精確至 0.5 kg，身高讀數要求準確至 1 mm。依據體重和身高計算體重指數（body mass index，BMI），BMI=體重/身高2，單位為 kg/m2。測量腹圍和頸圍的讀數準確至 1 mm。
（2）血液標本的采集及處理：采取受試者靜脈血約 10 ml，分成 3 份，3 ml 靜脈血經常規離心后檢測血糖及血脂，2 ml 靜脈血經乙二胺四乙酸抗凝后檢測胰島素水平，5 ml 靜脈血經提取 PBMC 后保存于–80 ℃ 冰箱用于檢測 CB1R 蛋白表達。所有研究對象抽血標本均無溶血。PBMC 提取采用 Ficoll 密度梯度分離法，具體方法：于放置 5 ml 外周靜脈血的乙二胺四乙酸抗凝管中加入等體積的 0.9% 生理鹽水稀釋，輕搖混勻；將冷藏回溫的適量淋巴細胞分離液加入 15 ml 離心管中，小心吸取已稀釋的外周靜脈血標本，按 1.5∶1 的比例沿管壁緩慢、勻速加入，確保血液標本與分離液無混合；離心管放入水平離心機，配平，2 000 r/min，離心 20 min；離心后取出可觀察標本分成 5 層，由上至下分別為血漿層、單個核細胞層、淋巴細胞分離液、白細胞層、紅細胞層；小心吸取呈白色霧狀的單個核細胞層，置于新的離心管中，加入 PBS 緩沖液，1 000 r/min，離心 5 min，洗滌 2 次后棄掉離心管上面的 PBS 緩沖液，保留余下的細胞；加入適量 PBS 緩沖液懸浮細胞，–80 ℃ 冰箱冷凍備用。
（3）生化指標測定及 IR 程度的計算：使用全自動生化分析儀（美國 Beckman Coulter LX-20 型）檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein-cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein-cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）和血糖等指標。血清胰島素水平檢測采用放射免疫法（天津九鼎生物技術有限公司藥盒）。以上指標均在蘭州大學第一醫院檢驗科及內分泌研究室檢測。空腹血糖受損定義為空腹血糖高于正常，但尚未達到糖尿病水平，即≥6.1 mmol/L 但<7.0 mmol/L。空腹血糖≥7.0 mmol/L 定義為糖尿病。利用穩態模型的胰島素抵抗指數（homeostasis model of assessment for insulin resistance index，HOMA-IR）評價 IR 程度，應用牛津大學在線計算器（www.dtu.ox.ac.uk/homacalculator）計算，在對話框中輸入空腹葡萄糖和胰島素水平可自動計算出 HOMA% 和 HOMA-IR。HOMA% 表示該受試者的胰島素敏感性相當于正常成年人胰島素敏感性的百分比。HOMA-IR 是 HOMA% 的倒數，表示 IR 的程度。該方法計算的胰島素敏感性與經典的葡萄糖鉗夾試驗的結果具有非常高的相關性，其準確性已經得到研究證實[11]。
（4）PBMC 的 CB1R 蛋白檢測：隨機選擇各組研究對象 6 例（其中男 4 例，女 2 例），采用蛋白免疫印跡（Western blot）技術檢測每位研究對象 PBMC 的 CB1R 表達水平。包括蛋白樣品制備、蛋白電泳分離、轉膜、封閉、加一抗、加二抗、顯色、曝光、圖像獲取和定量分析等步驟，用 Quantity One 軟件對所有條帶進行灰度掃描而獲得灰度值。用 CB1R 蛋白目的條帶（分子量 64 kD）的灰度值比上 β-肌動蛋白（β-actin）內對照（分子量 43 kD）的灰度值進行半定量分析，具體方法參考 Nong 等[12]的方法。
1.2.3 OSAHS 診斷標準及分組
OSAHS 診斷標準參照我國最新的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南（2011 年修訂版）》[13]。符合 OSAHS 診斷標準的患者根據呼吸暫停低通氣指數（apnea hypopnea index，AHI）分為三個亞組：5 次/h≤AHI≤15 次/h 為輕度 OSAHS 組，15 次/h<AHI≤30 次/h 為中度 OSAHS 組，AHI>30 次/h 為重度 OSAHS 組。AHI<5 次/h 者納入對照組。
1.3 統計學方法
采用 IBM SPSS 19.0 （SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA）軟件。使用柯爾莫諾夫-斯米爾諾夫（Kolmogorov-Smirnov）檢驗檢測數據分布方式。符合正態分布的計量資料以均數±標準差（
±s）表示。兩組均數之間的比較采用 T 檢驗，多組均數之間的比較采用單因素方差分析和最小差異法。計數資料的比較使用 χ2 檢驗。不同變量之間的相關性分析采用皮爾森相關系數（Pearson correlation coefficient）。去除混雜因素的相關性分析采用偏相關分析。所有統計檢驗均為雙側，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 兩組研究對象的各項檢測指標比較
本研究共納入 88 例受試者，經行 PSG 監測，其中 64 例符合 OSAHS 診斷，24 例受試者 AHI<5 次/h，遂納入作為對照組。OSAHS 組和對照組患者之間年齡、性別構成、BMI、腰圍、甘油三脂和空腹血糖水平比較，差異無統計學意義（P>0.05），而收縮壓、舒張壓、AHI、平均血氧飽和度（mean oxygen saturation，MSaO2）、最低血氧飽和度（lowest oxygen saturation，LSaO2）、血氧飽和度低于 90% 所占總睡眠時間的百分比（percentage of time that oxygen saturation below90%，SIT90）、TC、LDL-C、HDL-C、空腹胰島素水平和 HOMA-IR 兩組之間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 1。
表1
兩組研究對象臨床特征比較（
）
2.2 OSAHS 患者各亞組之間各項檢測指標比較
64 例 OSAHS 患者依據 AHI 分為輕度、中度、重度三個亞組，分別有 18、24 和 22 例。三組患者之間年齡、性別構成、腰圍、SIT90 及空腹血糖比較，差異無統計學意義（P>0.05），而 BMI、收縮壓、舒張壓、AHI、MSaO2、LSaO2、SIT90 、TC、LDL-C、HDL-C、TG、空腹胰島素水平及 HOMA-IR 三組之間比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 2。
表2
輕度、中度及重度 OSAHS 患者各檢測指標比較（
）
2.3 兩組研究對象糖代謝紊亂檢出情況比較
依據相關診斷標準，OSAHS 組患者中糖尿病及空腹血糖受損者分別有 5 和 13 例，而對照組中糖尿病及空腹血糖受損者均只有 1 例。OSAHS 組患者中糖尿病及空腹血糖受損者比例顯著高于對照組糖尿病及空腹血糖受損者的比例（28.12% 比 8.33%，χ2=3.89，P<0.05）。
2.4 OSAHS 患者胰島素敏感性和睡眠監測指標之間的關系
相關分析表明，HOMA-IR 與 AHI、LSaO2、MSaO2及 SIT90 均呈顯著相關（r 值分別為 0.44、–0.44、–0.25 和 0.34；均 P <0.05）（ 圖 1）。控制了各組患者年齡、身高、體重、BMI、腰圍、收縮壓、舒張壓和血脂后的偏相關分析顯示，HOMA-IR 與 AHI 及 LSaO2仍具有統計學意義（r 值分別為 0.32 和–0.41，均 P<0.05），而與 MSaO2 及 SIT90 的相關性不再具有顯著性（均 P>0.05）。
圖1
OSAHS 患者 HOMA-IR 與睡眠監測各指標的相關性分析
2.5 各組研究對象 PBMC 的 CB1R 蛋白表達情況
Western blot 檢測結果表明，對照組、輕度 OSAHS 組、中度 OSAHS 組及重度 OSAHS 組 PBMC 表面 CB1R 蛋白相對表達量分別為 0.04±0.01、0.37±0.09、0.40±0.07 和 0.62±0.14。OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達量明顯高于對照組（t=–9.84，P<0.01），并且隨著 OSAHS 病情加重，PBMC 的 CB1R 蛋白表達量也逐步升高，重度 OSAHS 組 PBMC 的 CB1R 蛋白表達量明顯高于輕度及中度 OSAHS 組（t 值分別為 3.80 和 3.35，P<0.01），而輕度 OSAHS 組和中度 OSAHS 組之間 PBMC 的 CB1R 蛋白表達量比較，差異無統計學意義（t=0.62，P>0.05）（圖 2）。
圖2
各組患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達情況
a. Western blot 檢測像；b. 蛋白相對表達量。OSAHS 組患者 PBMC 的 CB1R 蛋白較對照組顯著增多，且重度 OSAHS 組 PBMC 的 CB1R 蛋白較輕中度 OSAHS 組增多。與對照組比較，**
2.6 PBMC 表面 CB1R 蛋白表達與其他指標的相關分析
PBMC 的 CB1R 蛋白表達與 AHI、MSaO2、LSaO2、TC、LDL-C、空腹胰島素及 HOMA-IR 等指標的相關性具有顯著性（均 P<0.05）（表 3）。
表3
PBMC 表面 CB1R 蛋白表達與其他指標的相關性分析
3 討論
本研究的目的在于探索 OSAHS 患者胰島素敏感性的變化及其與 ECS 之間的關系。結果表明，OSAHS 患者發生 IR 及糖尿病的概率明顯高于對照組，且與 OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達增加密切相關。
IR 是 T2DM 的早期階段，持續的 IR 可最終導致 T2DM。研究證明，OSAHS 可引起 IR 且 IR 的程度與 OSAHS 病情密切相關，AHI 每增加 1 次/h，則 IR 增加 0.5%[14]。本研究表明，相對于對照組，OSAHS 患者 HOMA-IR 明顯增加，且 HOMA-IR 隨著 OSAHS 病情的加重而逐漸升高。在排除了年齡、BMI、腰圍、血脂等混雜因素后，HOMA-IR 仍與 AHI 顯著正相關。另外，OSAHS 患者糖代謝紊亂（包括空腹血糖受損及糖尿病）的檢出比例高于對照組，這些研究結果均提示 OSAHS 是引起 IR 及糖代謝紊亂的獨立危險因素。
OSAHS 引起 IR 的機制非常復雜，包括 OSAHS 對自主神經的影響、對神經內分泌功能的影響以及間歇性低氧本身對糖代謝的影響等[15]，另外，也可能與 OSAHS 引起的促炎細胞因子異常分泌（如白細胞介素-6 和腫瘤壞死因子-α）有關[16]。除了上述機制之外，本研究還發現，作為 ECS 的重要組成部分，OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平顯著升高，并與 OSAHS 患者病情及 IR 狀態密切相關。
ECS 與機體物質能量代謝，尤其是糖代謝關系密切，可以通過以下途徑參與糖代謝調控：（1）直接或間接增進食欲，增加攝入食物，增加體重；（2）促進腹部脂肪沉積，形成肥胖，誘發 IR 形成；（3）刺激胰島素分泌，提高脂肪組織和肌肉組織對葡萄糖的攝取效率[17]。已有研究證實 OSAHS 患者的 ECS 發生相應的變化。Engeli 等[6]發現外周血內源性大麻素水平升高，并推測對 OSAHS 的作用包括對神經系統的保護、對睡眠剝奪的代償[18-19]以及對呼吸模式的調節等方面[20]。另外，OSAHS 患者內源性大麻素水平升高也可能與 OSAHS 患者內源性大麻素降解系統功能下調有關。肥胖患者脂肪組織的脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，FAAH）表達減少，而 FAAH 是內源性大麻素，尤其是 AEA 和 2-AG 最主要的降解水解酶[21]。由于 OSAHS 患者大多合并肥胖，因此推測類似的機制可能存在于 OSAHS 患者。此外，既往研究證實瘦素可以引起 FAAH 活性增加[22]，而 OSAHS 患者普遍存在瘦素抵抗及瘦素功能失調，繼而引起 FAAH 活性受抑制以及循環中內源性大麻素水平升高[23]。最后，OSAHS 患者血漿內源性大麻素水平升高也可能與并存的 IR 有關，由于胰島素被證實是內源性大麻素的負性調節因子，而 IR 狀態下其負性調節作用減弱，繼而可以引起內源性大麻素水平升高[24]。反過來，血漿內源性大麻素水平升高又可作為 OSAHS 狀態下胰島素敏感性下降的初步補償機制。內源性大麻素與 IR 也有密切關系[25]，升高的內源性大麻素可以激活大麻素 CB1R 蛋白，繼而抑制骨骼肌對葡萄糖的攝取，增加腹部脂肪的沉積以及增加游離脂肪酸從脂肪組織進入肝臟，這些都有助于促使 IR 的發生發展[26]。
本研究表明，相對于對照組，OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平明顯升高，并且隨著 AHI 增加，CB1R 蛋白表達水平也隨之升高。通過相關分析發現，OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達量與 AHI、MSaO2、LSaO2 等睡眠監測指標及空腹胰島素及 HOMA-IR 等糖代謝紊亂指標具有顯著的相關性，提示 CB1R 蛋白表達水平與 OSAHS 引起的糖代謝紊亂具有密切關系。
CB1R 蛋白是 ECS 的重要組成部分，CB1R 蛋白活化可引起食欲增強、攝食增多、脂肪沉積增多、脂聯素分泌減少、IR 形成等，并最終導致糖代謝紊亂和糖尿病的發生[27]。CB1R 蛋白拮抗劑可減輕內源性大麻素紊亂造成的 IR 和糖代謝異常[28]。給予大鼠口服 CB1R 蛋白拮抗劑后，在引起大鼠食欲減退的同時[29]，葡萄糖和脂肪的氧化分解增加、肝糖原分解增加和總體能量消耗的增高，胰島素敏感性隨之改善，其原因可能為 CB1R 蛋白拮抗后葡萄糖和脂肪氧化作用增強[30]。小鼠 CB1R 蛋白基因敲除后也可觀察到脂肪含量減少、體重下降、血中的胰島素水平降低、胰島素敏感性提高、骨骼肌攝取葡萄糖增加、糖代謝改善等類似現象[31-33]。另外，在胰島 β 細胞的 CB1R 蛋白抑制后可刺激胰島素的分泌、促進靶器官葡萄糖轉運蛋白 4 的表達及葡萄糖的攝取，達到調控血糖水平穩定的目的[34-35]。
本研究有幾點局限性。首先，我們得出的結論主要是基于相關分析。這種分析方法僅僅在宏觀上說明 OSAHS 的嚴重程度、IR 及 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平的關系，而不是從分子機制等深層次方面解釋它們之間的內在聯系。其次，由于經費有限，我們只檢測了部分納入對象 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平，而內源性大麻素是一個龐大的系統，所以單純檢測 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平并不能充分代表真實的 ECS 的活性狀態。因此，有必要進行更深入更系統的研究進一步明確內源性大麻素在 OSAHS 發病過程及引起并發癥的過程中的作用及其機制。上述不足之處也是我們將來科研的發展方向和研究領域。
總之，本研究結果表明 OSAHS 患者存在 IR，并且 IR 程度與 OSAHS 患者 PBMC 的 CB1R 蛋白表達水平密切相關，提示內源性大麻素在 OSAHS 引起 IR 過程中可能起重要作用。
