引用本文： 張趁英, 吳興萍, 李春華, 李家樹. 哮喘患者外周血程序性細胞死亡因子-1 的表達研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(4): 390-393. doi: 10.7507/1671-6205.201706008 復制
哮喘是一種慢性氣道炎癥性反應性疾病，以可逆性氣道阻塞、氣道高反應性和氣道炎癥為特征。全球有近 3 億的哮喘患者，我國約 3 000 萬；而且歐美及亞洲的哮喘患病率有上漲趨勢，西歐近十年增長 1 倍，美國自上世紀 80 年代增加了 60% 以上；亞洲的成人患病率 0.7%～11.9%，平均不超過 5%，也呈上升趨勢[1-2]。同時，在基層醫療中，哮喘的診治現狀較差，漏診率大約 54%，誤診率大約 34%[3]。時至今日，哮喘發病機制等諸多環節仍尚未完全清楚，其中免疫因素在哮喘的發病過程中逐漸受重視，但研究相對較少。程序性細胞死亡因子（programmed cell death，PD-1）是一種共刺激分子，參與機體免疫應答，PD-1 與其受體結合后通過抑制 T、B 細胞活性來維持正常機體免疫功能，防止自身性免疫疾病的發生。目前 PD-1 在哮喘中尚無相關的研究，本研究擬通過檢測哮喘患者外周血 PD-1、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）及輔助性 T 細胞（Th 細胞）的表達，探討 PD-1 在哮喘中的作用，并為臨床上找到針對哮喘患者的免疫療法提供證據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇 2016 年 1 月至 2016 年 12 月連云港市第一人民醫院呼吸內科病房收治的哮喘患者 41 例，依據病情分為急性發作組和慢性持續組。急性發作組患者共 20 例，男 8 例，女 12 例，年齡（45.4±12.1）歲；慢性持續組患者共 21 例，男 9 例，女 12 例，年齡（47.2±14.5）歲。另選同期 18 例健康者作為對照組，男 10 例，女 8 例，年齡（51.7±10.9）歲。各組年齡、性別差異無統計學意義。
1.2 方法
1.2.1 納入和排除標準
哮喘診斷及分期參照 2016 版支氣管哮喘防治指南[4]。診斷標準：符合下述癥狀和體征，同時具備氣流受限客觀檢查中的 1 條，并除外其他疾病所引起的喘息、氣促、胸悶及咳嗽。（1）反復發作喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽，夜間及晨間多發，常與接觸變應原、冷空氣、物理、化學性刺激以及病毒性上呼吸道感染、運動等有關。（2）發作時在雙肺可聞及散在或彌漫性哮鳴音，呼氣相延長。（3）上述癥狀和體征可經治療緩解或自行緩解。（4）可變氣流受限的客觀檢查包括：① 支氣管舒張試驗陽性（吸入支氣管舒張劑后，第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）增加≥12%，且 FEV1 增加絕對值>200 ml；② 支氣管激發試驗陽性；③ 呼氣峰流量平均每日晝夜變異率>10%，或呼氣峰流量周變異率>20%。
慢性持續期標準：每周均不同頻度和（或）不同程度地出現喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀。
排除標準：（1）年齡<18 歲；（2）患有自身免疫性疾病者；（3）免疫缺陷性疾病者；（4）腫瘤患者；（5）近期接受免疫抑制劑治療者。
1.2.2 檢測指標
健康對照組隨機抽取外周血，入組患者在入院時抽取外周血 3 管，用乙二胺四乙酸抗凝。一管 3 500 r/min 離心 20 min，酶聯免疫吸附法檢測 PD-1、IFN-γ、IL-4 的濃度。人 PD-1 試劑盒購自美國 R&D 公司，人 IFN-γ 試劑盒、人 IL-4 試劑盒購自上海酶研生物科技公司。兩管外周血參照陶國華等[5]的方法，流式細胞儀檢測 Th1、Th2 的表達。單抗 CD3-PCy5、CD4-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-PE 購自美國貝克曼庫爾特有限公司。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，多樣本間的比較采用多樣本的 q 檢驗，相關性采用 Pearson 相關分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 外周血血清 PD-1 表達量的比較
與健康對照組比較，慢性持續組、急性發作組外周血 PD-1、IFN-γ 濃度降低，且急性發作組組濃度更低，差異有統計學意義（均 P<0.05）。與健康對照組比較，慢性持續組、急性發作組外周血 IL-4 濃度升高，且急性發作組組濃度更高，差異有統計學意義（均P<0.05）。結果見表 1。
表1
三組外周血血清 PD-1 表達量的比較（ng/ml，
）
2.2 外周血血清 Th1、Th2 的比較
與健康對照組比較，慢性持續組、急性發作組外周血 Th1 比例降低，Th1/Th2 比值降低，且急性發作組更低，差異有統計學意義（均 P<0.05）。與健康對照組比，慢性持續組、急性發作組外周血 Th2 比例升高，且急性發作組更高，差異有統計學意義（均P <0.05）。結果見 圖 1 和表 2 。
表2
三組外周血血清 Th1、Th2 的比較（
）
圖1
三組外周血血清 Th1、Th2 的流式細胞檢測像
2.3 急性發作組 PD-1 與 IFN-γ、IL-4、Th1、Th2 相關性分析
急性發作組 PD-1 與 IFN-γ、Th1 呈正相關，與 IL-4、Th2 呈負相關（均 P<0.05）。結果見表 3。
表3
急性發作組 PD-1 與 IFN-γ、IL-4、Th1、Th2 相關性分析
3 討論
PD-1 屬于分化抗原簇 28/細胞毒 T 淋巴細胞相關抗原 4（cluster of differentiation 28/cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CD28/CTLA-4）家族，存在兩個配體，即配體 1 和 2（PD-L1 和 PD-L2），PD-L1 廣泛表達于 T 細胞、B 細胞等淋巴細胞，PD-1 與 PD-L1 結合后通過抑制 T、B 細胞活性來維持正常機體免疫功能，防止自身性免疫疾病的發生；而 PD-L2 主要調控自然環境抗原導致的免疫反應[6]。因此，在調節免疫方面 PD-1/PD-L1 發揮主要作用。支氣管哮喘是一種由多因素引起的氣道免疫變態反應性疾病，發病機制十分復雜。病程上可分為致敏期、氣道炎癥期和氣道重塑期，其發生發展的過程包括過敏原刺激、T 細胞活化及失衡、炎性細胞浸潤，而機體免疫系統在其中起關鍵作用。
目前認為 PD-1 不僅在細胞免疫中起重要作用，在體液免疫中也占有重要地位。T 細胞免疫在人體免疫系統中居重要地位[7]。T 細胞活化后，其表面的 PD-1 可特異性識別抗原呈遞細胞上的 PD-L，激活 PD-1/PD-L 信號通路，導致轉錄因子，如核因子 κB 和激活蛋白-1，表達下降，從而降低 T 細胞功能，抑制免疫[8]；PD-1/PD-L 結合后還可以抑制 CD28 介導的磷脂酰肌醇激酶及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的磷酸化，削弱 T 細胞抗原受體/CD28 信號對免疫細胞的活化作用[9]，從而抑制淋巴細胞的活化，造成機體免疫功能低下。PD-1/PD-L 信號通路除了調節細胞免疫外，還參與體液免疫，該通路能夠直接調控漿細胞產生抗體[10]。文獻報道 PD-L 不僅在 Th 細胞中高表達，并且在 B 細胞生發中心上也有明顯的上調，PD-1/PD-L結合后可直接影響 B 細胞活化，造成免疫低下[11]；另外，研究發現 PD-1/PD-L 信號通路也可通過招募含兩個 Src 同源區的酪氨酸磷酸酶來阻止各種絡氨酸酶的磷酸化，從而直接抑制 B 細胞的活化[12]。
T 細胞主要分為 CD4+ 與 CD8+ T 細胞，CD4+ T 細胞又稱 Th 細胞，是機體對致敏原應答過程中重要的免疫細胞[13]，可分為 Th1、Th2、Th17、調節性 T 細胞等多個細胞亞型。他們主要產生各種細胞因子，并維持機體免疫平衡。Th1 主要分泌 IL-2 和 IFN-γ 等，參與抗炎反應，對機體有保護作用。Th2 主要分泌 IL-4、IL-5、IL-10 和 IL-13 等[14]，參與哮喘發病和氣道炎癥形成。其中 IL-4 是主導因子，Th1 占優勢時，氣道炎癥易清除，Th2 占優勢時，氣道炎癥易加劇，因此哮喘一直被認為是 Th2 疾病。Th1 和 Th2 細胞因子分別以 IFN-γ 和 IL-4 為代表，IL-4 和 IFN-γ 間的相互制約作用是維持 Th1/Th2 平衡的核心環節，IFN-γ 可使 Th0 加速向 Th1 分化，抑制 IL-4 的分泌，而 IL-4 可使 Th0 加速向 Th2 分化，抑制 IFN-γ 分泌[15-16]。正常情況下，通過細胞因子間的相互制約和影響形成的 Th1/Th2 動態平衡，是維持機體正常免疫功能的基礎[17]。機體在各種因素影響下導致 Th1/Th2 細胞相對平衡遭受破壞，就會導致相關的變應性疾病的發生，例如哮喘。本研究發現，相對于健康對照組，慢性持續組、急性發作組在發病時，IFN-γ 濃度降低，IL-4 濃度升高，Th1 比例降低，Th2 比例升高，Th1/Th2 比值降低，而且急性發作組變化更明顯。以上結果提示哮喘患者存在 Th1/Th2 失衡，機體免疫功能紊亂，而且病情越重則免疫紊亂越嚴重。
目前基于 PD-1 的藥物和技術研究在腫瘤治療中是最為活躍的，其中最重要的就是 PD-1 抗體。一項針對晚期腫瘤患者的治療研究發現，應用抗 PD-1 抗體 Nivolumab 封鎖 PD-1/PD-L1 途徑可引起很強的免疫反應，進而殺滅腫瘤[18]。Huang 等[19]在小鼠卵巢癌模型中，同時封閉淋巴活化基因-3（lymph activating gene-3，LAG-3）和 PD-1，可以增強 T 細胞的功能，而且二者具有協同作用，可更好地殺滅腫瘤。在臨床研究中，Nguyen 等[20]發現同時封閉 LAG-3 和 PD-1 可更好地殺滅腫瘤。然而，目前國內外對 PD-1 在哮喘中的作用尚無相關研究。本研究發現，相對于健康對照組，慢性持續組、急性發作組在發病時 PD-1 濃度降低，而且急性發作組更低，同時急性發作組相關性分析提示 PD-1 與 IFN-γ、Th1 呈正相關，與 IL-4、Th2 呈負相關。這提示哮喘患者可能通過 PD-1 與受體結合后抑制 T 細胞、B 細胞活性，造成機體免疫功能紊亂，而且病情越重免疫紊亂越嚴重。因此，阻斷 PD-1/PD-L1 傳導途徑可能成為哮喘患者臨床治療治中一個突破。本研究納入病例樣本量較小，而且目前對哮喘患者外周血 PD-1 的表達研究還很少，相關機制研究須進一步深入。
哮喘是一種慢性氣道炎癥性反應性疾病，以可逆性氣道阻塞、氣道高反應性和氣道炎癥為特征。全球有近 3 億的哮喘患者，我國約 3 000 萬；而且歐美及亞洲的哮喘患病率有上漲趨勢，西歐近十年增長 1 倍，美國自上世紀 80 年代增加了 60% 以上；亞洲的成人患病率 0.7%～11.9%，平均不超過 5%，也呈上升趨勢[1-2]。同時，在基層醫療中，哮喘的診治現狀較差，漏診率大約 54%，誤診率大約 34%[3]。時至今日，哮喘發病機制等諸多環節仍尚未完全清楚，其中免疫因素在哮喘的發病過程中逐漸受重視，但研究相對較少。程序性細胞死亡因子（programmed cell death，PD-1）是一種共刺激分子，參與機體免疫應答，PD-1 與其受體結合后通過抑制 T、B 細胞活性來維持正常機體免疫功能，防止自身性免疫疾病的發生。目前 PD-1 在哮喘中尚無相關的研究，本研究擬通過檢測哮喘患者外周血 PD-1、γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、白細胞介素-4（interleukin-4，IL-4）及輔助性 T 細胞（Th 細胞）的表達，探討 PD-1 在哮喘中的作用，并為臨床上找到針對哮喘患者的免疫療法提供證據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選擇 2016 年 1 月至 2016 年 12 月連云港市第一人民醫院呼吸內科病房收治的哮喘患者 41 例，依據病情分為急性發作組和慢性持續組。急性發作組患者共 20 例，男 8 例，女 12 例，年齡（45.4±12.1）歲；慢性持續組患者共 21 例，男 9 例，女 12 例，年齡（47.2±14.5）歲。另選同期 18 例健康者作為對照組，男 10 例，女 8 例，年齡（51.7±10.9）歲。各組年齡、性別差異無統計學意義。
1.2 方法
1.2.1 納入和排除標準
哮喘診斷及分期參照 2016 版支氣管哮喘防治指南[4]。診斷標準：符合下述癥狀和體征，同時具備氣流受限客觀檢查中的 1 條，并除外其他疾病所引起的喘息、氣促、胸悶及咳嗽。（1）反復發作喘息、氣急，伴或不伴胸悶或咳嗽，夜間及晨間多發，常與接觸變應原、冷空氣、物理、化學性刺激以及病毒性上呼吸道感染、運動等有關。（2）發作時在雙肺可聞及散在或彌漫性哮鳴音，呼氣相延長。（3）上述癥狀和體征可經治療緩解或自行緩解。（4）可變氣流受限的客觀檢查包括：① 支氣管舒張試驗陽性（吸入支氣管舒張劑后，第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）增加≥12%，且 FEV1 增加絕對值>200 ml；② 支氣管激發試驗陽性；③ 呼氣峰流量平均每日晝夜變異率>10%，或呼氣峰流量周變異率>20%。
慢性持續期標準：每周均不同頻度和（或）不同程度地出現喘息、氣促、胸悶、咳嗽等癥狀。
排除標準：（1）年齡<18 歲；（2）患有自身免疫性疾病者；（3）免疫缺陷性疾病者；（4）腫瘤患者；（5）近期接受免疫抑制劑治療者。
1.2.2 檢測指標
健康對照組隨機抽取外周血，入組患者在入院時抽取外周血 3 管，用乙二胺四乙酸抗凝。一管 3 500 r/min 離心 20 min，酶聯免疫吸附法檢測 PD-1、IFN-γ、IL-4 的濃度。人 PD-1 試劑盒購自美國 R&D 公司，人 IFN-γ 試劑盒、人 IL-4 試劑盒購自上海酶研生物科技公司。兩管外周血參照陶國華等[5]的方法，流式細胞儀檢測 Th1、Th2 的表達。單抗 CD3-PCy5、CD4-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-PE 購自美國貝克曼庫爾特有限公司。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計軟件進行數據處理。計量資料以均數±標準差（
±s）表示，多樣本間的比較采用多樣本的 q 檢驗，相關性采用 Pearson 相關分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 外周血血清 PD-1 表達量的比較
與健康對照組比較，慢性持續組、急性發作組外周血 PD-1、IFN-γ 濃度降低，且急性發作組組濃度更低，差異有統計學意義（均 P<0.05）。與健康對照組比較，慢性持續組、急性發作組外周血 IL-4 濃度升高，且急性發作組組濃度更高，差異有統計學意義（均P<0.05）。結果見表 1。
表1
三組外周血血清 PD-1 表達量的比較（ng/ml，
）
2.2 外周血血清 Th1、Th2 的比較
與健康對照組比較，慢性持續組、急性發作組外周血 Th1 比例降低，Th1/Th2 比值降低，且急性發作組更低，差異有統計學意義（均 P<0.05）。與健康對照組比，慢性持續組、急性發作組外周血 Th2 比例升高，且急性發作組更高，差異有統計學意義（均P <0.05）。結果見 圖 1 和表 2 。
表2
三組外周血血清 Th1、Th2 的比較（
）
圖1
三組外周血血清 Th1、Th2 的流式細胞檢測像
2.3 急性發作組 PD-1 與 IFN-γ、IL-4、Th1、Th2 相關性分析
急性發作組 PD-1 與 IFN-γ、Th1 呈正相關，與 IL-4、Th2 呈負相關（均 P<0.05）。結果見表 3。
表3
急性發作組 PD-1 與 IFN-γ、IL-4、Th1、Th2 相關性分析
3 討論
PD-1 屬于分化抗原簇 28/細胞毒 T 淋巴細胞相關抗原 4（cluster of differentiation 28/cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CD28/CTLA-4）家族，存在兩個配體，即配體 1 和 2（PD-L1 和 PD-L2），PD-L1 廣泛表達于 T 細胞、B 細胞等淋巴細胞，PD-1 與 PD-L1 結合后通過抑制 T、B 細胞活性來維持正常機體免疫功能，防止自身性免疫疾病的發生；而 PD-L2 主要調控自然環境抗原導致的免疫反應[6]。因此，在調節免疫方面 PD-1/PD-L1 發揮主要作用。支氣管哮喘是一種由多因素引起的氣道免疫變態反應性疾病，發病機制十分復雜。病程上可分為致敏期、氣道炎癥期和氣道重塑期，其發生發展的過程包括過敏原刺激、T 細胞活化及失衡、炎性細胞浸潤，而機體免疫系統在其中起關鍵作用。
目前認為 PD-1 不僅在細胞免疫中起重要作用，在體液免疫中也占有重要地位。T 細胞免疫在人體免疫系統中居重要地位[7]。T 細胞活化后，其表面的 PD-1 可特異性識別抗原呈遞細胞上的 PD-L，激活 PD-1/PD-L 信號通路，導致轉錄因子，如核因子 κB 和激活蛋白-1，表達下降，從而降低 T 細胞功能，抑制免疫[8]；PD-1/PD-L 結合后還可以抑制 CD28 介導的磷脂酰肌醇激酶及絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的磷酸化，削弱 T 細胞抗原受體/CD28 信號對免疫細胞的活化作用[9]，從而抑制淋巴細胞的活化，造成機體免疫功能低下。PD-1/PD-L 信號通路除了調節細胞免疫外，還參與體液免疫，該通路能夠直接調控漿細胞產生抗體[10]。文獻報道 PD-L 不僅在 Th 細胞中高表達，并且在 B 細胞生發中心上也有明顯的上調，PD-1/PD-L結合后可直接影響 B 細胞活化，造成免疫低下[11]；另外，研究發現 PD-1/PD-L 信號通路也可通過招募含兩個 Src 同源區的酪氨酸磷酸酶來阻止各種絡氨酸酶的磷酸化，從而直接抑制 B 細胞的活化[12]。
T 細胞主要分為 CD4+ 與 CD8+ T 細胞，CD4+ T 細胞又稱 Th 細胞，是機體對致敏原應答過程中重要的免疫細胞[13]，可分為 Th1、Th2、Th17、調節性 T 細胞等多個細胞亞型。他們主要產生各種細胞因子，并維持機體免疫平衡。Th1 主要分泌 IL-2 和 IFN-γ 等，參與抗炎反應，對機體有保護作用。Th2 主要分泌 IL-4、IL-5、IL-10 和 IL-13 等[14]，參與哮喘發病和氣道炎癥形成。其中 IL-4 是主導因子，Th1 占優勢時，氣道炎癥易清除，Th2 占優勢時，氣道炎癥易加劇，因此哮喘一直被認為是 Th2 疾病。Th1 和 Th2 細胞因子分別以 IFN-γ 和 IL-4 為代表，IL-4 和 IFN-γ 間的相互制約作用是維持 Th1/Th2 平衡的核心環節，IFN-γ 可使 Th0 加速向 Th1 分化，抑制 IL-4 的分泌，而 IL-4 可使 Th0 加速向 Th2 分化，抑制 IFN-γ 分泌[15-16]。正常情況下，通過細胞因子間的相互制約和影響形成的 Th1/Th2 動態平衡，是維持機體正常免疫功能的基礎[17]。機體在各種因素影響下導致 Th1/Th2 細胞相對平衡遭受破壞，就會導致相關的變應性疾病的發生，例如哮喘。本研究發現，相對于健康對照組，慢性持續組、急性發作組在發病時，IFN-γ 濃度降低，IL-4 濃度升高，Th1 比例降低，Th2 比例升高，Th1/Th2 比值降低，而且急性發作組變化更明顯。以上結果提示哮喘患者存在 Th1/Th2 失衡，機體免疫功能紊亂，而且病情越重則免疫紊亂越嚴重。
目前基于 PD-1 的藥物和技術研究在腫瘤治療中是最為活躍的，其中最重要的就是 PD-1 抗體。一項針對晚期腫瘤患者的治療研究發現，應用抗 PD-1 抗體 Nivolumab 封鎖 PD-1/PD-L1 途徑可引起很強的免疫反應，進而殺滅腫瘤[18]。Huang 等[19]在小鼠卵巢癌模型中，同時封閉淋巴活化基因-3（lymph activating gene-3，LAG-3）和 PD-1，可以增強 T 細胞的功能，而且二者具有協同作用，可更好地殺滅腫瘤。在臨床研究中，Nguyen 等[20]發現同時封閉 LAG-3 和 PD-1 可更好地殺滅腫瘤。然而，目前國內外對 PD-1 在哮喘中的作用尚無相關研究。本研究發現，相對于健康對照組，慢性持續組、急性發作組在發病時 PD-1 濃度降低，而且急性發作組更低，同時急性發作組相關性分析提示 PD-1 與 IFN-γ、Th1 呈正相關，與 IL-4、Th2 呈負相關。這提示哮喘患者可能通過 PD-1 與受體結合后抑制 T 細胞、B 細胞活性，造成機體免疫功能紊亂，而且病情越重免疫紊亂越嚴重。因此，阻斷 PD-1/PD-L1 傳導途徑可能成為哮喘患者臨床治療治中一個突破。本研究納入病例樣本量較小，而且目前對哮喘患者外周血 PD-1 的表達研究還很少，相關機制研究須進一步深入。
