引用本文： 戈艷蕾, 劉聰輝, 張嘉賓, 崔紫陽, 李立群, 張盼盼, 譚曦舒, 王紅陽. 慢性阻塞性肺疾病伴或不伴低氧血癥患者外周血 MCP-1、SAA 蛋白及 mRNA 水平與認知功能損傷關系探討. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(4): 327-330. doi: 10.7507/1671-6205.201711033 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種全身系統性疾病，長期缺氧、二氧化碳潴留以及全身及肺部出現明顯炎癥反應，可引發肺臟及肺外臟器功能受損及代謝紊亂，在中樞神經系統即表現為引起認知功能障礙[1-3]。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）屬于趨化因子家族中 CC 亞家族成員，可調節單核/巨噬細胞趨化活性能力，影響細胞因子合成，從而導致內皮細胞激活，參與腦缺氧缺血損傷過程，引發腦損傷[4-5]。血清淀粉樣蛋白 A（serum amyloid A protein，SAA）作為一種急性時相蛋白，在機體出現炎癥反應狀態時明顯增多。當 SAA 在大腦中積聚過多，可以誘發大腦細胞出現炎癥反應，導致神經元和腦白質損傷[6]。流行病學證據顯示老年癡呆患者的血清或腦脊液中 MCP-1 及 SAA 水平明顯提高，這提示 MCP-1 及 SAA 水平可能與患者認知障礙發生有關[4-6]。本研究旨在探討慢阻肺患者血 MCP-1、SAA 及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與認知功能損傷的關系，以期發現慢阻肺伴認知功能障礙的預防和治療方法。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選取華北理工大學附屬醫院呼吸內科 2013 年 1 月至 2017 年 1 月住院的慢阻肺患者 62 例，其中男 34 例，女 28 例，年齡 39～84 歲，平均年齡（66.5±11.3）歲。患者均符合 2011 年慢阻肺全球創議[7]（GOLD）指南中慢阻肺的診斷標準：患者存在暴露于有害氣體或顆粒，導致出現持續性呼吸道癥狀和氣流受限癥狀，所有患者均接受肺功能檢查，在吸入支氣管舒張劑后，患者第 1 秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比 （FEV1/FVC）仍<70%，判定患者為慢阻肺。根據患者 FEV1 占預計值百分比（FEV1%pred），選取 GOLD 3、4 期患者，其中 GOLD 3 期患者 FEV1%pred 在 30%～49%，GOLD 4 期患者 FEV1%pred<30%。排除標準：（1）嚴重腦血管病；（2）存在肺性腦病及血氣分析存在明顯二氧化碳增高；（3）交流障礙人群；（4）嚴重肝腎功能等疾病影響 MCP-1、SAA 水平。依據患者在不吸氧的情況下橈動脈血動脈血氧分壓（PaO2），將慢阻肺患者分為慢阻肺缺氧組（PaO2<60 mm Hg，25 例）和慢阻肺無缺氧組（PaO2≥60 mm Hg，37 例）（1 mm Hg=0.133 kPa）。同期選取健康體檢者 30 例作為對照組。
1.2 方法
1.2.1 認知功能評定
采用蒙特利爾認知評估量表（MoCA 量表）對三組受試者進行認知功能評估，記錄 MoCA 量表總分情況。
1.2.2 血清 MCP-1、SAA 表達水平測定
所有受試者清晨取空腹靜脈血 6 ml，離心 20 min（3 000 r/min），將血漿與紅細胞迅速小心地分離，樣本收集后，按一次量分裝，凍存于–80 ℃ 冰箱，采用酶聯免疫吸附法測定 SAA、MCP-1 濃度，試劑盒購于天津瀚陽生物技術有限公司。
1.2.3 外周血單核細胞 MCP-1、SAA 的 mRNA 表達水平測定
所有受試者清晨取空腹靜脈血 6 ml，加乙二胺四乙酸抗凝，混合 20 min 后離心 20 min（3 000 r/min），將血漿與紅細胞迅速小心地分離，提取外周血單核細胞，采用 RT-PCR 檢測其 MCP-1、SAA 的 mRNA 表達水平。相關基因的引物序列見表 1。基因的上、下游引物各 0.4 μl，cDNA 模板 1 μl，SYBGreen（避光）10 μl，加滅菌蒸餾水至 20 μl。將以上混合物按以下反應條件進行擴增：最初 95 ℃ 預變性 30 s，后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共 40 個循環。分別得到擴增曲線、溶解曲線和待測樣本的表達量。應用分析軟件 Realplex，溶解曲線判斷特異性，擴增曲線判斷是否陽性。采用 2–ΔCt 相對定量分析法，計算出各組基因 mRNA 的相對含量。基因的相對表達水平=2（–ΔCt 實驗組–ΔCt 對照組），其中 ΔCt 實驗組=實驗組目的基因 Ct 值–實驗組管家基因 Ct 值；ΔCt 對照組=對照組目的基因 Ct 值–對照組管家基因 Ct 值。以對照組基因表達水平為基準 1.00，每組實驗重復 3 次，取平均值。
表1
相關基因的引物序列
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。正態分布計量資料用均數±標準差（
±s）表示，采用單因素方差分析進行多組間均數比較，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，應用 Pearson 相關分析進行相關性分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般人口學資料及受教育年限比較
慢阻肺缺氧組 25 例，男 13 例，女 12 例；年齡 41～82 歲，平均年齡（64.7±12.8）歲；平均受教育年限（12.2±4.8）年。慢阻肺無缺氧組 37 例，男 21 例，女 16 例；年齡 39～84 歲，平均年齡（65.9±13.5）歲；平均受教育年限（11.5±5.3）年。健康對照組 30 例，男 16 例，女 14 例；年齡 40～83 歲，平均年齡（66.1±12.9）歲；平均受教育年限（12.6±5.3）年。三組性別、年齡及受教育年限差異無統計學意義。
2.2 外周血 MCP-1、SAA 水平及 MoCA 評分比較
慢阻肺患者血清 MCP-1、SAA 水平及外周血單核細胞 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平顯著高于健康對照組（均 P<0.05）。慢阻肺缺氧組和慢阻肺無缺氧組 MoCA 評分總分較健康對照組顯著降義（均P<0.05）。慢阻肺缺氧組 MoCA 評分低于慢阻肺無缺氧義（P<0.05）。結果見表 2。
表3
外周血 MCP-1、SAA 水平與 MoCA 評分相關性分析
2.3 外周血 MCP-1、SAA 及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與 MoCA 評分相關性分析
血清 MCP-1、SAA 及外周血單核細胞 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與 MoCA 評分總分均呈負相關（均 P<0.05）。結果見表 3。
表2
三組間外周血 MCP-1、SAA 水平及 MoCA 評分比較（
）
3 討論
慢阻肺患者長期缺氧、二氧化碳潴留，可以誘發及全身及肺部出現明顯炎癥反應，可以引發肺臟及肺外臟器功能受損及代謝紊亂。近年來，慢阻肺導致的認知功能受損日益受到關注[1-7]。我們采用 MoCA 量表評定慢阻肺及對照組人群認知功能，發現慢阻肺患者存在明顯認知功能受損，并在合并缺氧的慢阻肺患者中更為顯著。慢阻肺患者并發認知功能損傷的機制尚不明確，可能原因是嚴重的缺氧和（或）合并高碳酸血癥，導致大腦細胞功能受損。多種分子通路也被認為是認知功能缺損的潛在因素，包括全身炎癥反應蛋白介導的核因子 κB 激活下游產品如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素（interleukin，IL）-8等，這些炎癥機制已被確定與慢阻肺相關，是心血管合并癥的重要機制，同時也參與認知功能損傷的發病[8-12]。研究發現老年癡呆患者血清或腦脊液中 MCP-1 及 SAA水平明顯提高，這提示 MCP-1 及 SAA 水平可能與認知障礙發生有關[13]。但目前就慢阻肺患者認知功能障礙與 MCP-1 及 SAA 的相關性研究尚未展開。
目前研究發現 MCP-1 引起慢阻肺患者認知功能障礙的原因分析如下：一方面，慢阻肺患者慢性缺氧、炎癥等情況下，體內出現過度炎癥反應，導致 MCP-1 大量表達阻塞血管，致腦血流量減少，出現缺血缺氧腦損傷，大腦細胞中氧自由基、蛋白酶類及炎性細胞因子分泌增多，致腦細胞損傷[4]；另一方面，MCP-1 屬于趨化因子家族中 CC 亞家族成員，具有調節單核/巨噬細胞趨化活性的能力，可上調細胞間黏附分子-1 等黏附分子，影響細胞因子合成，從而導致內皮細胞激活，參與腦缺氧缺血損傷過程，引發腦損傷[5]。由此可見，MCP-1 在慢阻肺患者認知功能障礙發展過程中發揮重要作用。
SAA 作為一種急性時相蛋白，一個非常敏感的炎性反應因子，在機體出現炎癥反應時可明顯增多。研究已證實 SAA 可作為新的慢阻肺急性加重期的生物標志物。當 SAA 在大腦中積聚過多，可以誘導 IL-6、TNF-α、IL-12 p40 亞基（ IL12p40）、p19 亞基（IL23p19）和 IL-10 mRNA 的表達增加，而 IL-6、TNF-α、IL-12p40、IL23p19 和 IL-10 mRNA 在慢阻肺炎癥反應導致器官功能障礙中發揮重要作用，IL-6、TNF-α、IL-12p40、IL23p19 和 IL-10 mRNA 參與了阿爾茨海默癥發病過程[4, 11-14]。這提示 SAA 蓄積增多，可以引發大腦細胞出現炎癥反應，導致神經元和腦白質損傷[14-17]。此外，SAA 還可以參與細胞內膽固醇逆轉運，同時可以增加高密度脂蛋白清除，導致血管中脂質代謝異常，有助于動脈粥樣硬化斑塊的形成和不穩定，引發缺血性腦血管病，導致腦細胞功能受損[12-15]。
本研究發現外周血 MCP-1、SAA 及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平表達水平趨勢一致，慢阻肺患者血 MCP-1、SAA 水平及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平顯著高于健康對照組；慢阻肺缺氧組和慢阻肺無缺氧組 MoCA 評分總分較對照組低，其中缺氧組 MoCA 評分降低更明顯。血清 SAA、MCP-1 水平及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與 MoCA 總分均呈負相關性。由此可見，慢阻肺患者存在認知障礙，其中合并缺氧的慢阻肺患者認知功能受損更明顯；血 MCP-1、SAA 及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與認知功能損傷存在相關性。這提示 MCP-1、SAA 在慢阻肺患者認知功能受損中發揮作用。下一步我們將依據本研究結果，在慢阻肺合并認知障礙動物模型上，應用 MCP-1、SAA 抗體進行研究，探討其在慢阻肺合并認知障礙動物模型中的作用，以其為臨床開展研究提供理論依據。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種全身系統性疾病，長期缺氧、二氧化碳潴留以及全身及肺部出現明顯炎癥反應，可引發肺臟及肺外臟器功能受損及代謝紊亂，在中樞神經系統即表現為引起認知功能障礙[1-3]。單核細胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）屬于趨化因子家族中 CC 亞家族成員，可調節單核/巨噬細胞趨化活性能力，影響細胞因子合成，從而導致內皮細胞激活，參與腦缺氧缺血損傷過程，引發腦損傷[4-5]。血清淀粉樣蛋白 A（serum amyloid A protein，SAA）作為一種急性時相蛋白，在機體出現炎癥反應狀態時明顯增多。當 SAA 在大腦中積聚過多，可以誘發大腦細胞出現炎癥反應，導致神經元和腦白質損傷[6]。流行病學證據顯示老年癡呆患者的血清或腦脊液中 MCP-1 及 SAA 水平明顯提高，這提示 MCP-1 及 SAA 水平可能與患者認知障礙發生有關[4-6]。本研究旨在探討慢阻肺患者血 MCP-1、SAA 及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與認知功能損傷的關系，以期發現慢阻肺伴認知功能障礙的預防和治療方法。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選取華北理工大學附屬醫院呼吸內科 2013 年 1 月至 2017 年 1 月住院的慢阻肺患者 62 例，其中男 34 例，女 28 例，年齡 39～84 歲，平均年齡（66.5±11.3）歲。患者均符合 2011 年慢阻肺全球創議[7]（GOLD）指南中慢阻肺的診斷標準：患者存在暴露于有害氣體或顆粒，導致出現持續性呼吸道癥狀和氣流受限癥狀，所有患者均接受肺功能檢查，在吸入支氣管舒張劑后，患者第 1 秒用力呼氣容積占用力肺活量百分比 （FEV1/FVC）仍<70%，判定患者為慢阻肺。根據患者 FEV1 占預計值百分比（FEV1%pred），選取 GOLD 3、4 期患者，其中 GOLD 3 期患者 FEV1%pred 在 30%～49%，GOLD 4 期患者 FEV1%pred<30%。排除標準：（1）嚴重腦血管病；（2）存在肺性腦病及血氣分析存在明顯二氧化碳增高；（3）交流障礙人群；（4）嚴重肝腎功能等疾病影響 MCP-1、SAA 水平。依據患者在不吸氧的情況下橈動脈血動脈血氧分壓（PaO2），將慢阻肺患者分為慢阻肺缺氧組（PaO2<60 mm Hg，25 例）和慢阻肺無缺氧組（PaO2≥60 mm Hg，37 例）（1 mm Hg=0.133 kPa）。同期選取健康體檢者 30 例作為對照組。
1.2 方法
1.2.1 認知功能評定
采用蒙特利爾認知評估量表（MoCA 量表）對三組受試者進行認知功能評估，記錄 MoCA 量表總分情況。
1.2.2 血清 MCP-1、SAA 表達水平測定
所有受試者清晨取空腹靜脈血 6 ml，離心 20 min（3 000 r/min），將血漿與紅細胞迅速小心地分離，樣本收集后，按一次量分裝，凍存于–80 ℃ 冰箱，采用酶聯免疫吸附法測定 SAA、MCP-1 濃度，試劑盒購于天津瀚陽生物技術有限公司。
1.2.3 外周血單核細胞 MCP-1、SAA 的 mRNA 表達水平測定
所有受試者清晨取空腹靜脈血 6 ml，加乙二胺四乙酸抗凝，混合 20 min 后離心 20 min（3 000 r/min），將血漿與紅細胞迅速小心地分離，提取外周血單核細胞，采用 RT-PCR 檢測其 MCP-1、SAA 的 mRNA 表達水平。相關基因的引物序列見表 1。基因的上、下游引物各 0.4 μl，cDNA 模板 1 μl，SYBGreen（避光）10 μl，加滅菌蒸餾水至 20 μl。將以上混合物按以下反應條件進行擴增：最初 95 ℃ 預變性 30 s，后 95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，共 40 個循環。分別得到擴增曲線、溶解曲線和待測樣本的表達量。應用分析軟件 Realplex，溶解曲線判斷特異性，擴增曲線判斷是否陽性。采用 2–ΔCt 相對定量分析法，計算出各組基因 mRNA 的相對含量。基因的相對表達水平=2（–ΔCt 實驗組–ΔCt 對照組），其中 ΔCt 實驗組=實驗組目的基因 Ct 值–實驗組管家基因 Ct 值；ΔCt 對照組=對照組目的基因 Ct 值–對照組管家基因 Ct 值。以對照組基因表達水平為基準 1.00，每組實驗重復 3 次，取平均值。
表1
相關基因的引物序列
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 統計軟件。正態分布計量資料用均數±標準差（
±s）表示，采用單因素方差分析進行多組間均數比較，兩組間比較采用獨立樣本 t 檢驗，應用 Pearson 相關分析進行相關性分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般人口學資料及受教育年限比較
慢阻肺缺氧組 25 例，男 13 例，女 12 例；年齡 41～82 歲，平均年齡（64.7±12.8）歲；平均受教育年限（12.2±4.8）年。慢阻肺無缺氧組 37 例，男 21 例，女 16 例；年齡 39～84 歲，平均年齡（65.9±13.5）歲；平均受教育年限（11.5±5.3）年。健康對照組 30 例，男 16 例，女 14 例；年齡 40～83 歲，平均年齡（66.1±12.9）歲；平均受教育年限（12.6±5.3）年。三組性別、年齡及受教育年限差異無統計學意義。
2.2 外周血 MCP-1、SAA 水平及 MoCA 評分比較
慢阻肺患者血清 MCP-1、SAA 水平及外周血單核細胞 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平顯著高于健康對照組（均 P<0.05）。慢阻肺缺氧組和慢阻肺無缺氧組 MoCA 評分總分較健康對照組顯著降義（均P<0.05）。慢阻肺缺氧組 MoCA 評分低于慢阻肺無缺氧義（P<0.05）。結果見表 2。
表3
外周血 MCP-1、SAA 水平與 MoCA 評分相關性分析
2.3 外周血 MCP-1、SAA 及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與 MoCA 評分相關性分析
血清 MCP-1、SAA 及外周血單核細胞 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與 MoCA 評分總分均呈負相關（均 P<0.05）。結果見表 3。
表2
三組間外周血 MCP-1、SAA 水平及 MoCA 評分比較（
）
3 討論
慢阻肺患者長期缺氧、二氧化碳潴留，可以誘發及全身及肺部出現明顯炎癥反應，可以引發肺臟及肺外臟器功能受損及代謝紊亂。近年來，慢阻肺導致的認知功能受損日益受到關注[1-7]。我們采用 MoCA 量表評定慢阻肺及對照組人群認知功能，發現慢阻肺患者存在明顯認知功能受損，并在合并缺氧的慢阻肺患者中更為顯著。慢阻肺患者并發認知功能損傷的機制尚不明確，可能原因是嚴重的缺氧和（或）合并高碳酸血癥，導致大腦細胞功能受損。多種分子通路也被認為是認知功能缺損的潛在因素，包括全身炎癥反應蛋白介導的核因子 κB 激活下游產品如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細胞介素（interleukin，IL）-8等，這些炎癥機制已被確定與慢阻肺相關，是心血管合并癥的重要機制，同時也參與認知功能損傷的發病[8-12]。研究發現老年癡呆患者血清或腦脊液中 MCP-1 及 SAA水平明顯提高，這提示 MCP-1 及 SAA 水平可能與認知障礙發生有關[13]。但目前就慢阻肺患者認知功能障礙與 MCP-1 及 SAA 的相關性研究尚未展開。
目前研究發現 MCP-1 引起慢阻肺患者認知功能障礙的原因分析如下：一方面，慢阻肺患者慢性缺氧、炎癥等情況下，體內出現過度炎癥反應，導致 MCP-1 大量表達阻塞血管，致腦血流量減少，出現缺血缺氧腦損傷，大腦細胞中氧自由基、蛋白酶類及炎性細胞因子分泌增多，致腦細胞損傷[4]；另一方面，MCP-1 屬于趨化因子家族中 CC 亞家族成員，具有調節單核/巨噬細胞趨化活性的能力，可上調細胞間黏附分子-1 等黏附分子，影響細胞因子合成，從而導致內皮細胞激活，參與腦缺氧缺血損傷過程，引發腦損傷[5]。由此可見，MCP-1 在慢阻肺患者認知功能障礙發展過程中發揮重要作用。
SAA 作為一種急性時相蛋白，一個非常敏感的炎性反應因子，在機體出現炎癥反應時可明顯增多。研究已證實 SAA 可作為新的慢阻肺急性加重期的生物標志物。當 SAA 在大腦中積聚過多，可以誘導 IL-6、TNF-α、IL-12 p40 亞基（ IL12p40）、p19 亞基（IL23p19）和 IL-10 mRNA 的表達增加，而 IL-6、TNF-α、IL-12p40、IL23p19 和 IL-10 mRNA 在慢阻肺炎癥反應導致器官功能障礙中發揮重要作用，IL-6、TNF-α、IL-12p40、IL23p19 和 IL-10 mRNA 參與了阿爾茨海默癥發病過程[4, 11-14]。這提示 SAA 蓄積增多，可以引發大腦細胞出現炎癥反應，導致神經元和腦白質損傷[14-17]。此外，SAA 還可以參與細胞內膽固醇逆轉運，同時可以增加高密度脂蛋白清除，導致血管中脂質代謝異常，有助于動脈粥樣硬化斑塊的形成和不穩定，引發缺血性腦血管病，導致腦細胞功能受損[12-15]。
本研究發現外周血 MCP-1、SAA 及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平表達水平趨勢一致，慢阻肺患者血 MCP-1、SAA 水平及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平顯著高于健康對照組；慢阻肺缺氧組和慢阻肺無缺氧組 MoCA 評分總分較對照組低，其中缺氧組 MoCA 評分降低更明顯。血清 SAA、MCP-1 水平及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與 MoCA 總分均呈負相關性。由此可見，慢阻肺患者存在認知障礙，其中合并缺氧的慢阻肺患者認知功能受損更明顯；血 MCP-1、SAA 及 MCP-1 mRNA、SAA mRNA 水平與認知功能損傷存在相關性。這提示 MCP-1、SAA 在慢阻肺患者認知功能受損中發揮作用。下一步我們將依據本研究結果，在慢阻肺合并認知障礙動物模型上，應用 MCP-1、SAA 抗體進行研究，探討其在慢阻肺合并認知障礙動物模型中的作用，以其為臨床開展研究提供理論依據。
