引用本文： 鐘蓮娣, 張春來, 左萬里, 周偉, 黃勝起, 張鑫, 黃炎明. 羅格列酮抑制慢性阻塞性肺疾病模型大鼠炎性反應的機制研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(3): 230-236. doi: 10.7507/1671-6205.201708052 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）的病理基礎是反復的炎癥作用下引起的不可逆的氣道重塑[1]。吸煙是目前公認的慢阻肺發病的重要危險因素。香煙中的氧自由基和毒性成分，可通過損傷氣管上皮細胞和誘發肺內炎性反應等導致慢阻肺的發生[2]。最近的研究發現，格列酮類藥物作為過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的外源性高選擇性激動劑，除了調節糖脂代謝外，還具有減輕炎癥和抑制器官纖維化等作用，有望成為改善慢阻肺預后的新手段[3-4]。為此，本課題組利用氣管內滴注脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）聯合香煙煙霧暴露建立慢阻肺大鼠模型，觀察梯度濃度的羅格列酮（rosiglitazone）灌胃給藥后，慢阻肺大鼠氣管炎性反應和肺氣腫病理改變，并觀察肺組織內核轉錄因子 κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）信號通路和信號傳導與轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription，Stat3）信號通路的激活情況，進而驗證羅格列酮用于慢阻肺臨床治療的潛在可能性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物來源、主要試劑與儀器
SPF 級健康成年雄性 Wistar 大鼠 50 只，體重 193～218 g。動物提供及飼養均為中山大學實驗動物中心［實驗動物合格證號：SCXK（粵）2011-0029］。羅格列酮鈉片為太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司產品；戊巴比妥鈉購自上海伊普瑞斯公司；LPS 購自 Sigma 公司。針對 p-Stat3（T705）和 p-NF-κB（S536）兔單抗均為 CST 公司產品；免疫組化二抗及顯色系統為 Ventana 公司產品。BX51 光學顯微鏡為奧林巴斯公司產品。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組及處理
實驗動物隨機均分為 5 組，健康對照組（A 組）、模型組（B 組）、0.1 mg/kg 羅格列酮組（C 組）、0.15 mg/kg 羅格列酮組（D 組）和 0.2 mg/kg 羅格列酮組（E 組）。每組 10 只，各組間體重差異無明顯統計學差異（P>0.05）。參考文獻[5]的方法，建立氣管內滴注 LPS 聯合香煙煙熏模型，其中 B、C、D、E 組于實驗第 1、15 d 分別用 2% 戊巴比妥溶液（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，無菌行頸正中切口并逐層分離顯露氣管，頭皮針穿刺，氣管內滴注濃度為 1 g/L 的 LPS 溶液 2 mg/kg，注射后立即將大鼠直立旋轉 2 min，使兩肺內藥物分布均勻，縫合皮膚后原環境繼續飼養，該日不予煙熏。余時間在有機玻璃箱內被動吸煙 12 支，2 次/d，30 min/次，兩次煙熏時間間隔 4 h，共 30 d。健康對照組以同樣方法氣管內滴注生理鹽水，不予煙熏，余飼養時間及條件與其他組相同。此外，C 組、D 組、E 組每天上午煙熏前分別予羅格列酮鈉片 0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg 灌胃。A 組、B 組給予 1 ml 生理鹽水灌胃，共 30 d。
1.2.2 實驗后取材
造模結束后，以 2% 戊巴比妥溶液 50 mg/kg 腹腔內注射麻醉大鼠，采用頸部脫臼法處死大鼠，沿胸骨旁軟骨剪開胸腔，取出大鼠右肺用生理鹽水沖洗后，浸泡于 4% 多聚甲醛緩沖液固定 24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規石蠟浸蠟并包埋，在肺門區矢狀方向切片。
1.2.3 蘇木精-伊紅染色及氣管與肺組織病理分析
先將組織切片脫蠟、水化，置切片于蘇木精染液浸染，1% 鹽酸酒精分化，流水沖洗反藍；隨后置切片于伊紅染液浸染，水稍洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。參考文獻[6]的方法進行氣道炎癥病理分析，選取 300～1 100 μm 的支氣管，觀察以下指標：（1）上皮脫落、糜爛；（2）杯狀細胞增生；（3）管壁有炎性細胞浸潤，管腔有滲出；（4）管壁有淋巴小結形成；（5）小氣管管腔狹窄；（6）呼吸道平滑肌增生；（7）氣管管壁結締組織增生；（8）黏膜細胞鱗狀化生；（9）管壁充血、水腫；（10）管壁色素沉積。各項指標滿分為 3 分，各病理切片任意選取 3 個小氣管，每項指標得分=總分×100/3，每只大鼠的病理學評分為得分和×100/30。參考文獻[7]的方法計算平均內襯間隔（mean linear intercept，MLI）和平均肺泡數（mean alveolar numbers，MAN）。其中，MLI 反映肺泡平均直徑，其以視野中央為中心劃十字交叉，計數通過該交叉線的肺泡間隔數，MLI=十字線總長度/肺泡間隔數；MAN 反映肺泡密度，需計數各視野內肺泡數，測出各視野面積，MAN=視野內肺泡數/各視野面積。
1.2.4 免疫組化染色及評分
先將組織切片脫蠟、水化，過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，pH9.0 的乙二胺四乙酸高壓修復，山羊血清封閉，一抗 4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育 40 min，二氨基聯苯胺顯色 5 min，蘇木精染液復染，脫水、封片。根據免疫組化的細胞陽性率及染色深度對蛋白的表達進行綜合評分。首先根據細胞陽性率進行評分，沒有陽性細胞為 0 分；<10% 陽性為 1 分；10%～35% 陽性為 2 分；35%～70% 陽性為 3 分；>70% 陽性為 4 分。再根據陽性細胞的總體染色深度進行評分，沒有染色信號為 0 分；淡黃色為 1 分；深黃色為 2 分；棕黃色為 3 分。最后將陽性率評分與染色強度評分相乘，得到 0、1、2、3、4、6、8、9 或 12 共 9 個等級的免疫組化染色指數（staining index，SI）。
1.3 統計學方法
采用 Excel 2010、GraphPad Prism 5 及 SPSS 19.0 軟件。計量資料使用均值±標準差（
±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方法為 Tukey 檢驗，檢驗水平 α=0.05。
2 結果
2.1 氣道炎癥病理變化比較
如圖 1 所示，A 組大鼠氣管黏膜上皮完整，纖毛排列整齊，黏膜下層和肌層未見明顯炎性細胞浸潤。B 組大鼠氣管黏膜上皮細胞脫落，纖毛排列紊亂，黏膜下層和肌層可見大量炎性細胞浸潤，管腔內有明顯滲出物，局部管壁可見淋巴小結形成，平滑肌增殖紊亂。5 組大鼠氣道炎癥病理評分分別為（46.5±6.8）、（223.5±26.0）、（188.9±27.7）、（160.4±30.3）、（119.3±17.3）分，B 組大鼠的氣道炎癥病理評分最高（F=68.95，P<0.05），A 組最低（F=68.95，P<0.05）。其中，C 組、D 組、E 組三組大鼠氣道炎癥病理變化介于 A 組與 B 組之間，相鄰兩組間炎癥病理改變基本持平，但 C 組和 E 組間差異較為明顯（F=68.95，P<0.05）。
圖1
各組大鼠氣管病理檢查像（蘇木精-伊紅染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管黏膜上皮完整，未見明顯炎性細胞浸潤；B 組大鼠氣管黏膜上皮細胞脫落，見淋巴小結形成，平滑肌增殖紊亂；C 組到 E 組大鼠氣管炎癥病變逐步減輕
2.2 氣管 p-Stat3 和 p-NF-κB 表達水平比較
如圖 2、圖 3 及表 1 所示，A 組大鼠淋巴細胞少量表達 p-Stat3 和 p-NF-κB，而氣管黏膜上皮的表達量更低；B 組大鼠氣管黏膜上皮及浸潤的淋巴細胞均強表達 p-Stat3 和 p-NF-κB，相對于 A 組，兩種蛋白的表達顯著上升（P<0.05）。C 組、D 組、E 組的淋巴細胞表達較強的 p-Stat3 及 p-NF-κB，但都低于 B 組，且兩種蛋白的表達隨給藥濃度增加而顯著降低（P<0.05）；C 組、D 組、E 組的氣管黏膜上皮中，p-NF-κB 表達隨給藥濃度增加而顯著降低（P<0.05），而 p-Stat3 的表達水平基本不變（P>0.05）。
表1
各組大鼠氣管組織中 p-Stat3 和 p-NF-κB 的染色指數（
）
2.3 肺組織病理變化比較
如圖 4 所示，A 組大鼠肺泡大小、結構正常，肺泡腔內未見明顯滲出，肺泡間隔未見增厚及炎性細胞浸潤。B 組大鼠肺泡結構紊亂，肺泡壁斷裂融合，肺泡腔及肺泡間隔有大量炎性細胞的浸潤，肺泡間隔增寬，見毛細血管擴張充血。C 組、D 組、E 組的上述肺氣腫病變介于 A 組與 B 組之間，且 E 組較 C 組有明顯改善（P<0.05）。如表 2 所示，B 組的 MAN 較 A 組明顯減低（P<0.05），MLI 則增高（P<0.05）。C 組、D 組、E 組的 MLI 和 MAN 介于 A 組與 B 組之間（P<0.05），其中 C 組與 E 組之間差異有統計學意義（P<0.05）。
圖2
各組大鼠氣管 p-Stat3 免疫組化檢查像（蘇木精染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管 p-Stat3 低表達；B 組大鼠氣管 p-Stat3 強陽性彌漫表達；C 組到 E 組大鼠氣管淋巴細胞中 p-Stat3 表達有所降低，上皮細胞中 p-Stat3 表達變化不顯著
圖3
各組大鼠氣管 p-NF-κB 免疫組化檢查像（蘇木精染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管 p-NF-κB 低表達；B 組大鼠氣管 p-NF-κB 強陽性彌漫表達；C 組到 E 組大鼠氣管淋巴細胞和上皮細胞中 p-NF-κB 表達降低
圖4
各組大鼠肺組織病理檢查像（蘇木精-伊紅染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠肺泡結構正常，肺泡間隔未見增厚及炎性細胞浸潤；B 組大鼠肺泡壁斷裂融合結構紊亂，有大量炎性細胞的浸潤，肺泡間隔增寬；C 組到 E 組大鼠肺氣腫病變逐步減輕
圖5
各組大鼠肺組織 p-Stat3 免疫組化檢查像（蘇木精染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管黏膜上皮較肺泡上皮高表達 p-Stat3；B 組大鼠氣管黏膜上皮和肺泡上皮均強表達 p-Stat3；C 組到 E 組大鼠氣管黏膜上皮與肺泡上皮的 p-Stat3 的表達水平基本不變
圖6
各組大鼠肺組織 p-NF-κB 免疫組化檢查像（蘇木精染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管黏膜上皮較肺泡上皮高表達 p-NF-κB；B 組大鼠氣管黏膜上皮和肺泡上皮均強表達 p-NF-κB；C 組到 E 組大鼠氣管黏膜上皮和肺泡上皮中，p-NF-κB 表達水平隨給藥濃度增加而顯著降低
表2
各組大鼠肺組織 MLI 和 MAN 的對比（
）
2.4 肺組織中 p-Stat3 和 p-NF-κB 表達水平比較
如圖 5、圖 6 及表 3 所示，A 組大鼠小氣管黏膜上皮表達一定量的 p-Stat3 和 p-NF-κB，而肺泡上皮僅少量表達；B 組大鼠的小氣管黏膜上皮和肺泡上皮均強表達 p-Stat3 和 p-NF-κB，相對于 A 組，兩種蛋白的表達顯著上升（P<0.05）。C 組、D 組、E 組的小氣管黏膜上皮和肺泡上皮中，p-NF-κB 表達隨給藥濃度增加而顯著降低（P<0.05），而 p-Stat3 的表達水平基本不變（P>0.05）。
表3
各組大鼠肺組織中 p-Stat3 和 p-NF-κB 的染色指數（
）
3 討論
香煙煙熏法可有效建立慢阻肺大鼠模型[8]。本研究采用氣管內滴注 LPS 聯合香煙煙熏建立慢阻肺大鼠模型，病理檢查結果顯示，該模型能較好模擬慢阻肺的疾病特征，且較單純香煙煙熏能有效縮短建模時間。根據羅格列酮的藥品說明書及文獻報道，大鼠灌胃給藥羅格列酮 0.2 mg/kg 的血藥濃度-時間曲線下面積與人口服 8 mg 基本一致，約為 6 g/(h·L)[9-10]，因此本研究選用 0.1 mg/kg、0.15 mg/kg 及 0.2 mg/kg 三個給藥濃度進行實驗。我們的前期研究發現，慢阻肺大鼠模型的肺勻漿液中炎性因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的表達量顯著升高，而給予藥羅格列酮灌胃處理后，IL-6 和 TNF-α 的含量均有所降低，表明 PPARγ 激動劑羅格列酮能顯著降低肺組織中炎性因子 IL-6 和 TNF-α 的含量[11]。但是肺組織勻漿無法反映肺部不同組織細胞中 NF-кB 和 Stat3 信號通路為主的炎癥信號通路激活情況，所以本研究進一步利用免疫組化檢測的方法結合病理評分，綜合分析判斷羅格列酮對慢阻肺大鼠肺組織中炎癥病理病變及 NF-кB 和 Stat3 信號通路的影響。
格列酮類藥物作為 PPARγ 的高選擇性配體，可使 PPARγ 的活化增加。當位于氣管炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞、肺泡巨噬細胞等中的 PPARγ 被激活時，直接結合 NF-κB 亞單位 p65/p50，使其與 DNA 的結合轉錄活性降低，抑制 NF-κB 下游炎癥相關基因的表達，減少炎性因子和趨化因子等（如 IL-6、TNF-α）的分泌，從而發揮抗炎作用[12-13]。本研究結果顯示，慢阻肺模型組大鼠的氣管下淋巴組織浸潤增生顯著，且 p-NF-кB 和 p-Stat3 呈強陽性彌漫表達，在給予羅格列酮后，氣管下淋巴組織浸潤增生減輕，呈濃度梯度效應；p-NF-кB 和 p-Stat3 的表達水平降低，但無濃度梯度效應。Das 等[14]研究發現，羅格列酮能通過上調 SOCS3 蛋白的表達，降低 p-Stat3 水平進而抑制 Stat3 信號通路，提示我們，在慢阻肺大鼠模型中，羅格列酮能同時抑制氣管炎性細胞中 NF-кB 和 Stat3 信號通路，抑制氣管下淋巴組織浸潤增生。
與炎性細胞的反應情況不一致的是，本研究結果顯示，慢阻肺模型組大鼠的氣管上皮與肺組織中，NF-κB 信號通路和 Stat3 信號通路都明顯激活，在羅格列酮處理后，NF-κB 信號通路的激活水平明顯降低，但 Stat3 信號通路依然維持較高的激活狀態。雖然本研究的結果無法系統性排除，羅格列酮對 Stat3 信號通路不存在影響，但 Lakshmi 等[15]的實驗結果同樣支持我們的觀點，即羅格列酮通過抑制 NF-κB 信號通路的激活對慢阻肺中的氣管上皮起保護作用。近期，Zepp 等[16]通過單細胞測序等方法鑒定出，肺泡組織存在間充質肺泡壁龕細胞（mesenchymal alveolar niche cell，MANC），是肺泡組織修復和抗纖維化的關鍵細胞群；而 MANC 細胞中 IL-6/STAT3 信號通路的激活，是維持其自我更新及有序分化能力的關鍵信號通路，這提示我們，羅格列酮對肺上皮細胞 NF-κB 信號通路抑制和 Stat3 信號通路的不干擾，是保護慢阻肺病理進展的關鍵。后續的研究中，我們將進一步通過實驗明確，羅格列酮即抑制淋巴細胞卻不影響肺上皮細胞 Stat3 信號通路的分子機制，同時需要觀察羅格列酮對 MANC 自我更新及有序分化的影響。
綜合本課題組前期研究[11]及本研究結果，格列酮類藥物通過抑制肺部炎癥介質的釋放、基質金屬蛋白酶的產生和膠原的分泌，提高機體抗氧化能力來延緩慢阻肺的形成，減輕氣管炎性反應，抑制氣道重塑，但是格列酮類藥物的不良反應和適合的劑量仍需進一步探討。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）的病理基礎是反復的炎癥作用下引起的不可逆的氣道重塑[1]。吸煙是目前公認的慢阻肺發病的重要危險因素。香煙中的氧自由基和毒性成分，可通過損傷氣管上皮細胞和誘發肺內炎性反應等導致慢阻肺的發生[2]。最近的研究發現，格列酮類藥物作為過氧化物酶體增殖物激活受體 γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的外源性高選擇性激動劑，除了調節糖脂代謝外，還具有減輕炎癥和抑制器官纖維化等作用，有望成為改善慢阻肺預后的新手段[3-4]。為此，本課題組利用氣管內滴注脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）聯合香煙煙霧暴露建立慢阻肺大鼠模型，觀察梯度濃度的羅格列酮（rosiglitazone）灌胃給藥后，慢阻肺大鼠氣管炎性反應和肺氣腫病理改變，并觀察肺組織內核轉錄因子 κB（nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells，NF-κB）信號通路和信號傳導與轉錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription，Stat3）信號通路的激活情況，進而驗證羅格列酮用于慢阻肺臨床治療的潛在可能性。
1 材料與方法
1.1 實驗動物來源、主要試劑與儀器
SPF 級健康成年雄性 Wistar 大鼠 50 只，體重 193～218 g。動物提供及飼養均為中山大學實驗動物中心［實驗動物合格證號：SCXK（粵）2011-0029］。羅格列酮鈉片為太極集團重慶涪陵制藥廠有限公司產品；戊巴比妥鈉購自上海伊普瑞斯公司；LPS 購自 Sigma 公司。針對 p-Stat3（T705）和 p-NF-κB（S536）兔單抗均為 CST 公司產品；免疫組化二抗及顯色系統為 Ventana 公司產品。BX51 光學顯微鏡為奧林巴斯公司產品。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組及處理
實驗動物隨機均分為 5 組，健康對照組（A 組）、模型組（B 組）、0.1 mg/kg 羅格列酮組（C 組）、0.15 mg/kg 羅格列酮組（D 組）和 0.2 mg/kg 羅格列酮組（E 組）。每組 10 只，各組間體重差異無明顯統計學差異（P>0.05）。參考文獻[5]的方法，建立氣管內滴注 LPS 聯合香煙煙熏模型，其中 B、C、D、E 組于實驗第 1、15 d 分別用 2% 戊巴比妥溶液（50 mg/kg）腹腔注射麻醉大鼠，無菌行頸正中切口并逐層分離顯露氣管，頭皮針穿刺，氣管內滴注濃度為 1 g/L 的 LPS 溶液 2 mg/kg，注射后立即將大鼠直立旋轉 2 min，使兩肺內藥物分布均勻，縫合皮膚后原環境繼續飼養，該日不予煙熏。余時間在有機玻璃箱內被動吸煙 12 支，2 次/d，30 min/次，兩次煙熏時間間隔 4 h，共 30 d。健康對照組以同樣方法氣管內滴注生理鹽水，不予煙熏，余飼養時間及條件與其他組相同。此外，C 組、D 組、E 組每天上午煙熏前分別予羅格列酮鈉片 0.1 mg/kg、0.15 mg/kg、0.2 mg/kg 灌胃。A 組、B 組給予 1 ml 生理鹽水灌胃，共 30 d。
1.2.2 實驗后取材
造模結束后，以 2% 戊巴比妥溶液 50 mg/kg 腹腔內注射麻醉大鼠，采用頸部脫臼法處死大鼠，沿胸骨旁軟骨剪開胸腔，取出大鼠右肺用生理鹽水沖洗后，浸泡于 4% 多聚甲醛緩沖液固定 24 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明，常規石蠟浸蠟并包埋，在肺門區矢狀方向切片。
1.2.3 蘇木精-伊紅染色及氣管與肺組織病理分析
先將組織切片脫蠟、水化，置切片于蘇木精染液浸染，1% 鹽酸酒精分化，流水沖洗反藍；隨后置切片于伊紅染液浸染，水稍洗，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。參考文獻[6]的方法進行氣道炎癥病理分析，選取 300～1 100 μm 的支氣管，觀察以下指標：（1）上皮脫落、糜爛；（2）杯狀細胞增生；（3）管壁有炎性細胞浸潤，管腔有滲出；（4）管壁有淋巴小結形成；（5）小氣管管腔狹窄；（6）呼吸道平滑肌增生；（7）氣管管壁結締組織增生；（8）黏膜細胞鱗狀化生；（9）管壁充血、水腫；（10）管壁色素沉積。各項指標滿分為 3 分，各病理切片任意選取 3 個小氣管，每項指標得分=總分×100/3，每只大鼠的病理學評分為得分和×100/30。參考文獻[7]的方法計算平均內襯間隔（mean linear intercept，MLI）和平均肺泡數（mean alveolar numbers，MAN）。其中，MLI 反映肺泡平均直徑，其以視野中央為中心劃十字交叉，計數通過該交叉線的肺泡間隔數，MLI=十字線總長度/肺泡間隔數；MAN 反映肺泡密度，需計數各視野內肺泡數，測出各視野面積，MAN=視野內肺泡數/各視野面積。
1.2.4 免疫組化染色及評分
先將組織切片脫蠟、水化，過氧化氫滅活內源性過氧化物酶，pH9.0 的乙二胺四乙酸高壓修復，山羊血清封閉，一抗 4 ℃ 孵育過夜，二抗室溫孵育 40 min，二氨基聯苯胺顯色 5 min，蘇木精染液復染，脫水、封片。根據免疫組化的細胞陽性率及染色深度對蛋白的表達進行綜合評分。首先根據細胞陽性率進行評分，沒有陽性細胞為 0 分；<10% 陽性為 1 分；10%～35% 陽性為 2 分；35%～70% 陽性為 3 分；>70% 陽性為 4 分。再根據陽性細胞的總體染色深度進行評分，沒有染色信號為 0 分；淡黃色為 1 分；深黃色為 2 分；棕黃色為 3 分。最后將陽性率評分與染色強度評分相乘，得到 0、1、2、3、4、6、8、9 或 12 共 9 個等級的免疫組化染色指數（staining index，SI）。
1.3 統計學方法
采用 Excel 2010、GraphPad Prism 5 及 SPSS 19.0 軟件。計量資料使用均值±標準差（
±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，方法為 Tukey 檢驗，檢驗水平 α=0.05。
2 結果
2.1 氣道炎癥病理變化比較
如圖 1 所示，A 組大鼠氣管黏膜上皮完整，纖毛排列整齊，黏膜下層和肌層未見明顯炎性細胞浸潤。B 組大鼠氣管黏膜上皮細胞脫落，纖毛排列紊亂，黏膜下層和肌層可見大量炎性細胞浸潤，管腔內有明顯滲出物，局部管壁可見淋巴小結形成，平滑肌增殖紊亂。5 組大鼠氣道炎癥病理評分分別為（46.5±6.8）、（223.5±26.0）、（188.9±27.7）、（160.4±30.3）、（119.3±17.3）分，B 組大鼠的氣道炎癥病理評分最高（F=68.95，P<0.05），A 組最低（F=68.95，P<0.05）。其中，C 組、D 組、E 組三組大鼠氣道炎癥病理變化介于 A 組與 B 組之間，相鄰兩組間炎癥病理改變基本持平，但 C 組和 E 組間差異較為明顯（F=68.95，P<0.05）。
圖1
各組大鼠氣管病理檢查像（蘇木精-伊紅染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管黏膜上皮完整，未見明顯炎性細胞浸潤；B 組大鼠氣管黏膜上皮細胞脫落，見淋巴小結形成，平滑肌增殖紊亂；C 組到 E 組大鼠氣管炎癥病變逐步減輕
2.2 氣管 p-Stat3 和 p-NF-κB 表達水平比較
如圖 2、圖 3 及表 1 所示，A 組大鼠淋巴細胞少量表達 p-Stat3 和 p-NF-κB，而氣管黏膜上皮的表達量更低；B 組大鼠氣管黏膜上皮及浸潤的淋巴細胞均強表達 p-Stat3 和 p-NF-κB，相對于 A 組，兩種蛋白的表達顯著上升（P<0.05）。C 組、D 組、E 組的淋巴細胞表達較強的 p-Stat3 及 p-NF-κB，但都低于 B 組，且兩種蛋白的表達隨給藥濃度增加而顯著降低（P<0.05）；C 組、D 組、E 組的氣管黏膜上皮中，p-NF-κB 表達隨給藥濃度增加而顯著降低（P<0.05），而 p-Stat3 的表達水平基本不變（P>0.05）。
表1
各組大鼠氣管組織中 p-Stat3 和 p-NF-κB 的染色指數（
）
2.3 肺組織病理變化比較
如圖 4 所示，A 組大鼠肺泡大小、結構正常，肺泡腔內未見明顯滲出，肺泡間隔未見增厚及炎性細胞浸潤。B 組大鼠肺泡結構紊亂，肺泡壁斷裂融合，肺泡腔及肺泡間隔有大量炎性細胞的浸潤，肺泡間隔增寬，見毛細血管擴張充血。C 組、D 組、E 組的上述肺氣腫病變介于 A 組與 B 組之間，且 E 組較 C 組有明顯改善（P<0.05）。如表 2 所示，B 組的 MAN 較 A 組明顯減低（P<0.05），MLI 則增高（P<0.05）。C 組、D 組、E 組的 MLI 和 MAN 介于 A 組與 B 組之間（P<0.05），其中 C 組與 E 組之間差異有統計學意義（P<0.05）。
圖2
各組大鼠氣管 p-Stat3 免疫組化檢查像（蘇木精染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管 p-Stat3 低表達；B 組大鼠氣管 p-Stat3 強陽性彌漫表達；C 組到 E 組大鼠氣管淋巴細胞中 p-Stat3 表達有所降低，上皮細胞中 p-Stat3 表達變化不顯著
圖3
各組大鼠氣管 p-NF-κB 免疫組化檢查像（蘇木精染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管 p-NF-κB 低表達；B 組大鼠氣管 p-NF-κB 強陽性彌漫表達；C 組到 E 組大鼠氣管淋巴細胞和上皮細胞中 p-NF-κB 表達降低
圖4
各組大鼠肺組織病理檢查像（蘇木精-伊紅染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠肺泡結構正常，肺泡間隔未見增厚及炎性細胞浸潤；B 組大鼠肺泡壁斷裂融合結構紊亂，有大量炎性細胞的浸潤，肺泡間隔增寬；C 組到 E 組大鼠肺氣腫病變逐步減輕
圖5
各組大鼠肺組織 p-Stat3 免疫組化檢查像（蘇木精染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管黏膜上皮較肺泡上皮高表達 p-Stat3；B 組大鼠氣管黏膜上皮和肺泡上皮均強表達 p-Stat3；C 組到 E 組大鼠氣管黏膜上皮與肺泡上皮的 p-Stat3 的表達水平基本不變
圖6
各組大鼠肺組織 p-NF-κB 免疫組化檢查像（蘇木精染色）
a~e. ×200；f~j. ×600，為相應組圖框區放大圖。a、f. A 組；b、g. B 組；c、h. C 組；d、i. D 組；e、j. E 組。A 組大鼠氣管黏膜上皮較肺泡上皮高表達 p-NF-κB；B 組大鼠氣管黏膜上皮和肺泡上皮均強表達 p-NF-κB；C 組到 E 組大鼠氣管黏膜上皮和肺泡上皮中，p-NF-κB 表達水平隨給藥濃度增加而顯著降低
表2
各組大鼠肺組織 MLI 和 MAN 的對比（
）
2.4 肺組織中 p-Stat3 和 p-NF-κB 表達水平比較
如圖 5、圖 6 及表 3 所示，A 組大鼠小氣管黏膜上皮表達一定量的 p-Stat3 和 p-NF-κB，而肺泡上皮僅少量表達；B 組大鼠的小氣管黏膜上皮和肺泡上皮均強表達 p-Stat3 和 p-NF-κB，相對于 A 組，兩種蛋白的表達顯著上升（P<0.05）。C 組、D 組、E 組的小氣管黏膜上皮和肺泡上皮中，p-NF-κB 表達隨給藥濃度增加而顯著降低（P<0.05），而 p-Stat3 的表達水平基本不變（P>0.05）。
表3
各組大鼠肺組織中 p-Stat3 和 p-NF-κB 的染色指數（
）
3 討論
香煙煙熏法可有效建立慢阻肺大鼠模型[8]。本研究采用氣管內滴注 LPS 聯合香煙煙熏建立慢阻肺大鼠模型，病理檢查結果顯示，該模型能較好模擬慢阻肺的疾病特征，且較單純香煙煙熏能有效縮短建模時間。根據羅格列酮的藥品說明書及文獻報道，大鼠灌胃給藥羅格列酮 0.2 mg/kg 的血藥濃度-時間曲線下面積與人口服 8 mg 基本一致，約為 6 g/(h·L)[9-10]，因此本研究選用 0.1 mg/kg、0.15 mg/kg 及 0.2 mg/kg 三個給藥濃度進行實驗。我們的前期研究發現，慢阻肺大鼠模型的肺勻漿液中炎性因子白介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）的表達量顯著升高，而給予藥羅格列酮灌胃處理后，IL-6 和 TNF-α 的含量均有所降低，表明 PPARγ 激動劑羅格列酮能顯著降低肺組織中炎性因子 IL-6 和 TNF-α 的含量[11]。但是肺組織勻漿無法反映肺部不同組織細胞中 NF-кB 和 Stat3 信號通路為主的炎癥信號通路激活情況，所以本研究進一步利用免疫組化檢測的方法結合病理評分，綜合分析判斷羅格列酮對慢阻肺大鼠肺組織中炎癥病理病變及 NF-кB 和 Stat3 信號通路的影響。
格列酮類藥物作為 PPARγ 的高選擇性配體，可使 PPARγ 的活化增加。當位于氣管炎性細胞如中性粒細胞、淋巴細胞、肺泡巨噬細胞等中的 PPARγ 被激活時，直接結合 NF-κB 亞單位 p65/p50，使其與 DNA 的結合轉錄活性降低，抑制 NF-κB 下游炎癥相關基因的表達，減少炎性因子和趨化因子等（如 IL-6、TNF-α）的分泌，從而發揮抗炎作用[12-13]。本研究結果顯示，慢阻肺模型組大鼠的氣管下淋巴組織浸潤增生顯著，且 p-NF-кB 和 p-Stat3 呈強陽性彌漫表達，在給予羅格列酮后，氣管下淋巴組織浸潤增生減輕，呈濃度梯度效應；p-NF-кB 和 p-Stat3 的表達水平降低，但無濃度梯度效應。Das 等[14]研究發現，羅格列酮能通過上調 SOCS3 蛋白的表達，降低 p-Stat3 水平進而抑制 Stat3 信號通路，提示我們，在慢阻肺大鼠模型中，羅格列酮能同時抑制氣管炎性細胞中 NF-кB 和 Stat3 信號通路，抑制氣管下淋巴組織浸潤增生。
與炎性細胞的反應情況不一致的是，本研究結果顯示，慢阻肺模型組大鼠的氣管上皮與肺組織中，NF-κB 信號通路和 Stat3 信號通路都明顯激活，在羅格列酮處理后，NF-κB 信號通路的激活水平明顯降低，但 Stat3 信號通路依然維持較高的激活狀態。雖然本研究的結果無法系統性排除，羅格列酮對 Stat3 信號通路不存在影響，但 Lakshmi 等[15]的實驗結果同樣支持我們的觀點，即羅格列酮通過抑制 NF-κB 信號通路的激活對慢阻肺中的氣管上皮起保護作用。近期，Zepp 等[16]通過單細胞測序等方法鑒定出，肺泡組織存在間充質肺泡壁龕細胞（mesenchymal alveolar niche cell，MANC），是肺泡組織修復和抗纖維化的關鍵細胞群；而 MANC 細胞中 IL-6/STAT3 信號通路的激活，是維持其自我更新及有序分化能力的關鍵信號通路，這提示我們，羅格列酮對肺上皮細胞 NF-κB 信號通路抑制和 Stat3 信號通路的不干擾，是保護慢阻肺病理進展的關鍵。后續的研究中，我們將進一步通過實驗明確，羅格列酮即抑制淋巴細胞卻不影響肺上皮細胞 Stat3 信號通路的分子機制，同時需要觀察羅格列酮對 MANC 自我更新及有序分化的影響。
綜合本課題組前期研究[11]及本研究結果，格列酮類藥物通過抑制肺部炎癥介質的釋放、基質金屬蛋白酶的產生和膠原的分泌，提高機體抗氧化能力來延緩慢阻肺的形成，減輕氣管炎性反應，抑制氣道重塑，但是格列酮類藥物的不良反應和適合的劑量仍需進一步探討。
