引用本文： 郭國華, 肖建宏, 宋彬, 曾林淼. 沉默信息調節因子 2 相關酶 1 在慢性阻塞性肺疾病患者血清中的表達水平及臨床意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(4): 336-340. doi: 10.7507/1671-6205.201706042 復制
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的呼吸系統疾病，其特征在于肺功能逐漸下降及慢性炎癥反應。慢阻肺在老年人中的發病率及死亡率極高，然而目前藥物治療仍不足以緩解疾病進展并降低死亡率，且對于慢阻肺發作和進展相關分子機制的研究相對缺乏。鑒定有效的生物標志物及相關分子通路有助于闡明慢阻肺發病機制，對開發新的藥物及治療方法，以便更好地對該疾病進行臨床管理具有十分積極的意義。研究表明，沉默信息調節因子 2 相關酶 1（SIR2-related enzyme 1，SIRT1）在調控細胞應激管理及生命周期中具有關鍵作用，參與包括糖尿病、神經性病變及心血管疾病等多種年齡相關疾病癥[1]。然而，其在慢阻肺患者中的研究相對較少。本研究旨在探究 SIRT1 在慢阻肺患者血清中的表達水平及臨床意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取本院 2015 年 5 月至 2016 年 5 月住院的慢阻肺急性加重期患者 40 例，其中男 31 例，女 9 例，年齡 49～80 歲，平均年齡（64±8）歲；本院同期慢阻肺穩定期患者 30 例，其中男 19 例，女 11 例，年齡 50～79 歲，平均年齡（65±7）歲。所有患者診斷均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》（2013 年修訂版）[2]診斷標準，并結合肺功能、影像學檢查明確診斷；急性加重期患者入選標準[3]：二氧化碳分壓>50 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），同時伴有氧分壓<60 mm Hg，呼吸頻率>30 次/min，咳嗽、咯痰、呼吸困難癥狀明顯加重。排除標準[4]：（1）伴有急性肺栓塞，合并肺結核、肺炎、哮喘；（2）患有惡性腫瘤；（3）伴有急性心臟血管疾病；（4）伴有嚴重肝腎功能衰竭；（5）患有糖尿病、風濕結締組織疾病；（6）患有自身免疫性疾病。另選本院肺功能正常的健康體檢者 20 例作為對照組，其中男 11 例，女 8 例，年齡 50～80 歲，平均年齡（65±8）歲。3 組受試者年齡、性別等一般資料均衡，差異無統計學意義，具有可比性（均 P>0.05）。本研究經本院倫理委員會批準。所有受試者均知情同意。
1.2 方法
1.2.1 肺功能檢查
急性加重期慢阻肺患者治療前、穩定期慢阻肺患者和對照組受試者入院時使用 MasterScreen（Erich Jaeger GmbH，Würzburg，Germany）進行肺功能測試，其中包括第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）占預測值百分比（FEV1%pred）、第 1 秒用力呼氣容積與用力肺活量比率（FEV1/FVC）。測試前 24 h 慢阻肺患者不使用支氣管舒張劑。
1.2.2 樣品收集
急性加重期慢阻肺患者治療前、穩定期慢阻肺患者入院次日清晨和對照組受試者空腹外周靜脈血，于室溫下以 1 500×g 離心 15 min，分離上清液作為血清樣品，立即儲存于–80 ℃ 以備后續使用。
1.2.3 酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清 SIRT1、核因子（nuclear factor，NF）-κB、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-9 水平
SIRT1、NF-κB、MMP-9 ELISA 試劑盒購自安杰生物技術有限公司，所有操作均嚴格按照說明書進行。
1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 蛋白表達
使用 RIPA 蛋白提取試劑（Beyotime Biotechnology）從血清中提取蛋白質。在 4 ℃ 下 12 000×g 離心 10 min 后，通過 10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清液，將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜（Sigma）上。將膜在 5% 脫脂乳中封閉 1 h，并用抗 SIRT1、抗 NF-κB、抗 MMP-9 的多克隆抗體和內部對照抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（Cell Signaling Technology）4 ℃ 孵育過夜。將膜用過氧化物酶綴合的二抗（Cell Signaling Technology）在室溫下孵育 1 h。使用 Quantity One 軟件（Life Technologies）評估蛋白相對表達水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 軟件。各組受試者 SIRT1、NF-κB、MMP-9 血清水平和蛋白表達以均數±標準差（
±s）表示，采用單因素方差分析進行比較，采用 t 檢驗進行兩兩比較。采用 Pearson 直線相關法進行血清 SIRT1 與 NF-κB、MMP-9 水平及肺功能的相關性分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組受試者肺功能指標
與對照組相比，慢阻肺穩定期組和慢阻肺急性加重組患者 FEV1%pred 及 FEV1/FVC 均顯著降低（均 P<0.05）。與慢阻肺穩定期組相比，慢阻肺急性加重組患者 FEV1%pred 及 FEV1/FVC 均顯著降低（均 P<0.05）。結果見表 1。
表1
各組受試者肺功能指標（
）
2.2 各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 ELISA 檢測結果
與對照組相比，慢阻肺穩定期組和慢阻肺急性加重組患者血清 SIRT1 水平均顯著降低，而 NF-κB 和 MMP-9 水平均顯著增加（均 P<0.05）。與慢阻肺穩定期組患者相比，慢阻肺急性加重組患者血清 SIRT1 水平顯著降低，而 NF-κB 和 MMP-9 水平均顯著升高（均P<0.05）。結果見表 2。
表2
各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 ELISA 檢測結果（ng/ml，
）
2.3 各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 Western blot 檢測結果
與對照組相比，慢阻肺穩定期組和慢阻肺急性加重組患者血清 SIRT1 蛋白表達水平均顯著降低，而 NF-κB 和 MMP-9 表達水平均顯著增加（均 P<0.05）。與慢阻肺穩定期組患者相比，慢阻肺急性加重組患者血清 SIRT1 蛋白表達水平顯著下降，而 NF-κB 和 MMP-9 表達水平均顯著增加（均P<0.05）。結果見圖 1、表 3。
圖1
各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 蛋白表達 Western blot 檢測像
表3
各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 Western blot 檢測結果（
）
2.4 慢阻肺患者血清 SIRT1 蛋白相對表達量與肺功能指標的相關性分析
經 Pearson 直線相關法分析，血清 SIRT1 蛋白相對表達量與慢阻肺患者 FEV1%pred、FEV1/FVC 呈顯著正相關。結果見圖 2。
圖2
慢阻肺患者 SIRT1 蛋白相對表達量與肺功能指標的相關性分析
a. 與 FEV1%pred 的相關性分析；b. 與 FEV1/FVC 的相關性分析
2.5 慢阻肺患者血清 SIRT1 與 NF-κB、MMP-9 蛋白相對表達量的相關性分析
經 Pearson 直線相關法分析，慢阻肺患者 SIRT1 與 NF-κB、MMP-9 蛋白相對表達量呈顯著負相關。結果見圖 3。
圖3
慢阻肺患者血清 SIRT1 與 NF-κB、MMP-9 蛋白相對表達量的相關性分析
a. 與 NF-κB 的相關性分析；b. 與 MMP-9 的相關性分析
3 討論
慢阻肺主要由有毒氣體，如煙霧等引起，其特征是不良反應性小氣道阻塞、肺氣腫和皮質類固醇不敏感性炎癥[5]。慢阻肺進展緩慢，因此大多數患者是老年人，且證據表明它反映了肺的加速老化[6]。機體中多種炎性介質、細胞因子在慢阻肺的發生發展過程中發揮重要作用，在臨床研究中受到廣泛重視[7]。SIRT1 是沉默信息調節因子（SIR2）家族的同源物，是一類高度保守的基因，編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白質脫乙酰酶[8]。它通過調節乙酰化/脫乙酰化平衡多重底物蛋白而調節各種細胞反應，如細胞凋亡、細胞衰老、內分泌代謝、葡萄糖體內平衡等[9-10]。SIRT1 可穿梭于細胞核和細胞質，在血清中可檢測 SIRT1 的表達情況[11]。血清 SIRT1 隨老齡增長而持續降低，在阿爾茨海默病等神經系統疾病中血清 SIRT1 加速減少[12]。提示血清 SIRT1 可能是各種老齡化相關疾病的潛在生物標志物[13]。在 SIRT1 與呼吸系統疾病的關系研究中，國外學者發現慢阻肺患者組織中 SIRT1 表達水平顯著下調[14]。李芳等[7]也發現，慢阻肺急性加重期患者外周血單個核細胞中 SIRT1 表達水平顯著降低。本研究通過 ELISA 和 Western blot 法測定慢阻肺患者血清 SIRT1 水平，結果發現慢阻肺急性加重期和慢阻肺穩定期患者血清 SIRT1 水平均顯著下調，且急性加重期患者下調更明顯。本研究進一步分析了血清 SIRT1 蛋白相對表達量與慢阻肺患者肺功能指標的相關性，結果顯示，血清 SIRT1 蛋白相對表達量與氣道阻塞（FEV1/FVC）呈顯著正相關，且與氣道阻塞嚴重程度（FEV1%pred）呈正相關，表明 SIRT1 表達隨慢阻肺進展而逐漸降低，提示血清 SIRT1 可作為評估慢阻肺的生物標志物。
慢阻肺的發病機制與炎癥介質和細胞因子等引起的慢性炎性反應密切相關。研究表明，SIRT1 可與不同的靶蛋白結合，以響應細胞外刺激，從而參與慢阻肺的發生進展[15]，然而具體機制尚不清楚。既往研究已證實，在不同時期的慢阻肺中均有 NF-κB 激活，其表達水平的增加與慢阻肺發病及進展密切相關[16]。與此一致，本研究發現，慢阻肺患者血清 NF-κB 水平顯著增加，且急性加重期患者血清 NF-κB 水平顯著高于穩定期患者。NF-κB 受 SIRT1 的直接調控，SIRT1 表達水平的降低與 NF-κB 激活的增加相關[17]。本研究發現 NF-κB 與 SIRT1 蛋白相對表達量呈顯著負相關，與既往研究一致。MMP-9 參與細胞外基質的破壞，與炎癥性疾病，如哮喘、肺癌等密切相關，在慢阻肺患者中的表達顯著增加[18]。與此一致，本研究發現慢阻肺患者中 MMP-9 表達水平顯著增加，且急性加重期患者血清 MMP-9 表達水平顯著高于穩定期患者。Nakamaru 等[19]發現，通過氧化應激誘導的 SIRT1 降低可導致 MMP-9 表達的增加，相反，增加 SIRT1 活性可抑制 MMP-9 的表達。同時，他們發現慢阻肺患者 SIRT1 表達和活性逐漸降低，而 MMP-9 和白細胞介素-8 的轉錄水平隨著疾病嚴重程度而增加。與這些研究一致，本研究發現慢阻肺患者中 MMP-9 與 SIRT1 蛋白相對表達量呈顯著負相關。結合既往研究推測，SIRT1 對慢阻肺發生進展的調控作用可能與其對 NF-κB、MMP-9 炎癥介質或細胞因子的調節作用有關，然而具體調控機制還有待深入探究。
綜上所述，本研究發現慢阻肺患者血清 SIRT1 水平降低，且這種降低與肺功能下降相關。因此，血清 SIRT1 有可能作為慢阻肺的潛在生物標志物。
慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）是一種常見的呼吸系統疾病，其特征在于肺功能逐漸下降及慢性炎癥反應。慢阻肺在老年人中的發病率及死亡率極高，然而目前藥物治療仍不足以緩解疾病進展并降低死亡率，且對于慢阻肺發作和進展相關分子機制的研究相對缺乏。鑒定有效的生物標志物及相關分子通路有助于闡明慢阻肺發病機制，對開發新的藥物及治療方法，以便更好地對該疾病進行臨床管理具有十分積極的意義。研究表明，沉默信息調節因子 2 相關酶 1（SIR2-related enzyme 1，SIRT1）在調控細胞應激管理及生命周期中具有關鍵作用，參與包括糖尿病、神經性病變及心血管疾病等多種年齡相關疾病癥[1]。然而，其在慢阻肺患者中的研究相對較少。本研究旨在探究 SIRT1 在慢阻肺患者血清中的表達水平及臨床意義。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
選取本院 2015 年 5 月至 2016 年 5 月住院的慢阻肺急性加重期患者 40 例，其中男 31 例，女 9 例，年齡 49～80 歲，平均年齡（64±8）歲；本院同期慢阻肺穩定期患者 30 例，其中男 19 例，女 11 例，年齡 50～79 歲，平均年齡（65±7）歲。所有患者診斷均符合《慢性阻塞性肺疾病診治指南》（2013 年修訂版）[2]診斷標準，并結合肺功能、影像學檢查明確診斷；急性加重期患者入選標準[3]：二氧化碳分壓>50 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），同時伴有氧分壓<60 mm Hg，呼吸頻率>30 次/min，咳嗽、咯痰、呼吸困難癥狀明顯加重。排除標準[4]：（1）伴有急性肺栓塞，合并肺結核、肺炎、哮喘；（2）患有惡性腫瘤；（3）伴有急性心臟血管疾病；（4）伴有嚴重肝腎功能衰竭；（5）患有糖尿病、風濕結締組織疾病；（6）患有自身免疫性疾病。另選本院肺功能正常的健康體檢者 20 例作為對照組，其中男 11 例，女 8 例，年齡 50～80 歲，平均年齡（65±8）歲。3 組受試者年齡、性別等一般資料均衡，差異無統計學意義，具有可比性（均 P>0.05）。本研究經本院倫理委員會批準。所有受試者均知情同意。
1.2 方法
1.2.1 肺功能檢查
急性加重期慢阻肺患者治療前、穩定期慢阻肺患者和對照組受試者入院時使用 MasterScreen（Erich Jaeger GmbH，Würzburg，Germany）進行肺功能測試，其中包括第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）占預測值百分比（FEV1%pred）、第 1 秒用力呼氣容積與用力肺活量比率（FEV1/FVC）。測試前 24 h 慢阻肺患者不使用支氣管舒張劑。
1.2.2 樣品收集
急性加重期慢阻肺患者治療前、穩定期慢阻肺患者入院次日清晨和對照組受試者空腹外周靜脈血，于室溫下以 1 500×g 離心 15 min，分離上清液作為血清樣品，立即儲存于–80 ℃ 以備后續使用。
1.2.3 酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測血清 SIRT1、核因子（nuclear factor，NF）-κB、基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-9 水平
SIRT1、NF-κB、MMP-9 ELISA 試劑盒購自安杰生物技術有限公司，所有操作均嚴格按照說明書進行。
1.2.4 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 蛋白表達
使用 RIPA 蛋白提取試劑（Beyotime Biotechnology）從血清中提取蛋白質。在 4 ℃ 下 12 000×g 離心 10 min 后，通過 10% 十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離上清液，將分離的蛋白質轉移到硝酸纖維素膜（Sigma）上。將膜在 5% 脫脂乳中封閉 1 h，并用抗 SIRT1、抗 NF-κB、抗 MMP-9 的多克隆抗體和內部對照抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗體（Cell Signaling Technology）4 ℃ 孵育過夜。將膜用過氧化物酶綴合的二抗（Cell Signaling Technology）在室溫下孵育 1 h。使用 Quantity One 軟件（Life Technologies）評估蛋白相對表達水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 20.0 軟件。各組受試者 SIRT1、NF-κB、MMP-9 血清水平和蛋白表達以均數±標準差（
±s）表示，采用單因素方差分析進行比較，采用 t 檢驗進行兩兩比較。采用 Pearson 直線相關法進行血清 SIRT1 與 NF-κB、MMP-9 水平及肺功能的相關性分析。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組受試者肺功能指標
與對照組相比，慢阻肺穩定期組和慢阻肺急性加重組患者 FEV1%pred 及 FEV1/FVC 均顯著降低（均 P<0.05）。與慢阻肺穩定期組相比，慢阻肺急性加重組患者 FEV1%pred 及 FEV1/FVC 均顯著降低（均 P<0.05）。結果見表 1。
表1
各組受試者肺功能指標（
）
2.2 各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 ELISA 檢測結果
與對照組相比，慢阻肺穩定期組和慢阻肺急性加重組患者血清 SIRT1 水平均顯著降低，而 NF-κB 和 MMP-9 水平均顯著增加（均 P<0.05）。與慢阻肺穩定期組患者相比，慢阻肺急性加重組患者血清 SIRT1 水平顯著降低，而 NF-κB 和 MMP-9 水平均顯著升高（均P<0.05）。結果見表 2。
表2
各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 ELISA 檢測結果（ng/ml，
）
2.3 各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 Western blot 檢測結果
與對照組相比，慢阻肺穩定期組和慢阻肺急性加重組患者血清 SIRT1 蛋白表達水平均顯著降低，而 NF-κB 和 MMP-9 表達水平均顯著增加（均 P<0.05）。與慢阻肺穩定期組患者相比，慢阻肺急性加重組患者血清 SIRT1 蛋白表達水平顯著下降，而 NF-κB 和 MMP-9 表達水平均顯著增加（均P<0.05）。結果見圖 1、表 3。
圖1
各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 蛋白表達 Western blot 檢測像
表3
各組受試者血清 SIRT1、NF-κB、MMP-9 Western blot 檢測結果（
）
2.4 慢阻肺患者血清 SIRT1 蛋白相對表達量與肺功能指標的相關性分析
經 Pearson 直線相關法分析，血清 SIRT1 蛋白相對表達量與慢阻肺患者 FEV1%pred、FEV1/FVC 呈顯著正相關。結果見圖 2。
圖2
慢阻肺患者 SIRT1 蛋白相對表達量與肺功能指標的相關性分析
a. 與 FEV1%pred 的相關性分析；b. 與 FEV1/FVC 的相關性分析
2.5 慢阻肺患者血清 SIRT1 與 NF-κB、MMP-9 蛋白相對表達量的相關性分析
經 Pearson 直線相關法分析，慢阻肺患者 SIRT1 與 NF-κB、MMP-9 蛋白相對表達量呈顯著負相關。結果見圖 3。
圖3
慢阻肺患者血清 SIRT1 與 NF-κB、MMP-9 蛋白相對表達量的相關性分析
a. 與 NF-κB 的相關性分析；b. 與 MMP-9 的相關性分析
3 討論
慢阻肺主要由有毒氣體，如煙霧等引起，其特征是不良反應性小氣道阻塞、肺氣腫和皮質類固醇不敏感性炎癥[5]。慢阻肺進展緩慢，因此大多數患者是老年人，且證據表明它反映了肺的加速老化[6]。機體中多種炎性介質、細胞因子在慢阻肺的發生發展過程中發揮重要作用，在臨床研究中受到廣泛重視[7]。SIRT1 是沉默信息調節因子（SIR2）家族的同源物，是一類高度保守的基因，編碼煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴性蛋白質脫乙酰酶[8]。它通過調節乙酰化/脫乙酰化平衡多重底物蛋白而調節各種細胞反應，如細胞凋亡、細胞衰老、內分泌代謝、葡萄糖體內平衡等[9-10]。SIRT1 可穿梭于細胞核和細胞質，在血清中可檢測 SIRT1 的表達情況[11]。血清 SIRT1 隨老齡增長而持續降低，在阿爾茨海默病等神經系統疾病中血清 SIRT1 加速減少[12]。提示血清 SIRT1 可能是各種老齡化相關疾病的潛在生物標志物[13]。在 SIRT1 與呼吸系統疾病的關系研究中，國外學者發現慢阻肺患者組織中 SIRT1 表達水平顯著下調[14]。李芳等[7]也發現，慢阻肺急性加重期患者外周血單個核細胞中 SIRT1 表達水平顯著降低。本研究通過 ELISA 和 Western blot 法測定慢阻肺患者血清 SIRT1 水平，結果發現慢阻肺急性加重期和慢阻肺穩定期患者血清 SIRT1 水平均顯著下調，且急性加重期患者下調更明顯。本研究進一步分析了血清 SIRT1 蛋白相對表達量與慢阻肺患者肺功能指標的相關性，結果顯示，血清 SIRT1 蛋白相對表達量與氣道阻塞（FEV1/FVC）呈顯著正相關，且與氣道阻塞嚴重程度（FEV1%pred）呈正相關，表明 SIRT1 表達隨慢阻肺進展而逐漸降低，提示血清 SIRT1 可作為評估慢阻肺的生物標志物。
慢阻肺的發病機制與炎癥介質和細胞因子等引起的慢性炎性反應密切相關。研究表明，SIRT1 可與不同的靶蛋白結合，以響應細胞外刺激，從而參與慢阻肺的發生進展[15]，然而具體機制尚不清楚。既往研究已證實，在不同時期的慢阻肺中均有 NF-κB 激活，其表達水平的增加與慢阻肺發病及進展密切相關[16]。與此一致，本研究發現，慢阻肺患者血清 NF-κB 水平顯著增加，且急性加重期患者血清 NF-κB 水平顯著高于穩定期患者。NF-κB 受 SIRT1 的直接調控，SIRT1 表達水平的降低與 NF-κB 激活的增加相關[17]。本研究發現 NF-κB 與 SIRT1 蛋白相對表達量呈顯著負相關，與既往研究一致。MMP-9 參與細胞外基質的破壞，與炎癥性疾病，如哮喘、肺癌等密切相關，在慢阻肺患者中的表達顯著增加[18]。與此一致，本研究發現慢阻肺患者中 MMP-9 表達水平顯著增加，且急性加重期患者血清 MMP-9 表達水平顯著高于穩定期患者。Nakamaru 等[19]發現，通過氧化應激誘導的 SIRT1 降低可導致 MMP-9 表達的增加，相反，增加 SIRT1 活性可抑制 MMP-9 的表達。同時，他們發現慢阻肺患者 SIRT1 表達和活性逐漸降低，而 MMP-9 和白細胞介素-8 的轉錄水平隨著疾病嚴重程度而增加。與這些研究一致，本研究發現慢阻肺患者中 MMP-9 與 SIRT1 蛋白相對表達量呈顯著負相關。結合既往研究推測，SIRT1 對慢阻肺發生進展的調控作用可能與其對 NF-κB、MMP-9 炎癥介質或細胞因子的調節作用有關，然而具體調控機制還有待深入探究。
綜上所述，本研究發現慢阻肺患者血清 SIRT1 水平降低，且這種降低與肺功能下降相關。因此，血清 SIRT1 有可能作為慢阻肺的潛在生物標志物。
