引用本文： 王程, 馬云勝, 閻文柱. 氯氣誘導急性氣管上皮損傷后修復機制的組織形態學研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(1): 76-80. doi: 10.7507/1671-6205.201706041 復制
氯氣吸入可損傷呼吸道上皮細胞并導致急性肺水腫、肺炎和肺功能異常[1-2]。高濃度的氯接觸導致氣管近端假復層上皮，包括分泌細胞、纖毛細胞和基底細胞的脫落[3-4]。了解氯氣吸入性氣道損傷的過程可能為治療氣管損傷和肺損傷或促進上皮修復提供有效策略。損傷后的氣管上皮修復可以由局部的祖細胞和干細胞協調行動并最終恢復上皮的完整性[5-6]。氣管上皮損傷后，恢復正常的結構和功能必須由有效的細胞對受傷的上皮細胞進行修復，因此我們制備了小鼠氯氣吸入性氣道損傷模型，觀察小鼠急性氯氣吸入損傷后氣管上皮細胞的修復過程。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
健康雄性 C57BL/6 小鼠，15 只，3 月齡，體重 35～40 g，購置于中國醫科大學實驗動物中心。死亡小鼠不計入統計。小鼠隨機分為氯氣暴露組（12 只）和對照組（3 只）。氯氣暴露組于特制的接觸室內給予 240 mg/L 劑量的氯氣[3]，暴露時間為 1 h。分別于氯氣暴露后的第 2、4、7、10 d 處死。在處死小鼠的 18 h 前分別向小鼠腹腔內注射 10 mg/kg 的5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）用以標記增殖的細胞。收集氣管組織于 10% 中性緩沖福爾馬林中固定，在石蠟包埋前按照近端、中段和遠端分成三等份。
1.2 主要儀器和試劑
EdU 為 Sigma-Aldrich 公司產品；EdU 檢測試劑盒為碧云天生物科技有限公司產品；兔抗角蛋白 5（K5）抗體、小鼠抗角蛋白 14（K14）抗體、α-平滑肌動蛋白（α-SMA）抗體、Alexa Fluor 594 驢抗兔 IgG、Alexa Fluor 594 驢抗小鼠 IgG 為博奧森生物技術有限公司產品；Masson 染色試劑盒購于南京建成生物技術有限公司。主要儀器有萊卡 2365 石蠟切片機，日本尼康 70I 光學顯微鏡，日本奧林巴斯 BX-41 倒置熒光顯微鏡。
1.3 方法
1.3.1 免疫熒光雙標法檢測 EdU 及上皮細胞標志物 石蠟切片脫蠟，梯度入水，pH6.0 的 10 mmol/L檸檬酸鹽 95 ℃ 下抗原修復 30 min；室溫下 1% 牛血清白蛋白、0.3% Triton X-100 封閉液孵育 30 min；沖洗，分別兔抗 K5（1∶1 000）、鼠抗 K14（1∶1 000）在室溫下孵育 1 h；沖洗，切片在室溫下與對應二抗孵育 1 h；沖洗，DAPI 復染細胞核，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.2 三色染色法和 α-SMA 免疫組化檢測 按照說明書步驟對氣管組織進行 Masson 三重染色。免疫組織化學檢測 α-SMA：切片脫蠟并水化，0.3% 過氧化氫滅活內源性過氧化物酶 30 min。然后 3% 牛血清白蛋白-0.3% Triton X-100 封閉液室溫孵育 30 min。切片沖洗后與 α-SMA 抗體（1∶500）室溫孵育 1 h。再沖洗，切片與 HRP 標記的羊抗鼠 IgG（1∶200）室溫下孵育 1 h。沖洗后，用 DAB 試劑進行顯色，適時終止顯色。蘇木素復染細胞核，脫水后封片。
1.3.3 形態學觀察 取近端、中段和遠端氣管組織的橫切面，選取包含完整圓形輪廓的氣管橫截面數字圖像。氣管上皮修復過程采用上皮基底膜評分法進行評估，設 4 個級別：正常、修復、扁平和剝脫[6]。（1）正常：柱狀或立方形的假復層上皮，含纖毛細胞；（2）修復：立方形，常見多層上皮但缺少纖毛細胞；（3）扁平：扁平上皮；（4）裸露：基底膜上沒有上皮覆蓋。對氣管上皮部分進行組織染色評估。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（
）表示，組間比較采用方差分析以及多重比較檢驗方法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 氣管修復區域的組織學觀察結果
2.1.1 第 2 d 的變化 對照組小鼠的氣管壁各段均由假復層上皮構成（圖 1a～c）。接觸氯氣 2 d 時大多數氣管上皮脫落（圖 1d～f）；此時，氣管腔的平直部分可以看到一層薄薄的扁平上皮（圖 1d），而其他區域似乎完全沒有上皮覆蓋（圖 1e、圖 1f）；氣管近端上皮修復的速度比中間或遠端部分快。
2.1.2 第 4 d 的變化 第 4 d 時，近端氣管的許多區域已經出現正常假復層上皮（圖 2a）。其他區域顯示修復上皮細胞內常包含未分化的立方形的細胞，傾向于形成多層的上皮細胞（圖 1g）。中、遠端氣管顯示處于修復的早期階段，包含單層扁平和單層立方上皮，但仍有區域缺乏上皮細胞覆蓋，特別是在遠端氣管部分（圖 1h、圖 1i）。
2.1.3 第 7 d 的變化 第 7 d 時，近端氣管主要由假復層上皮覆蓋（圖 1j），而中遠端氣管顯示含有假復層上皮以及修復和未修復的上皮（圖 1k、圖 1l）。氣管腹側部分和背側部分的修復過程相似，遠端氣管大部分區域未能有效修復，該區域主要為纖維化組織修復（圖 1l）。
2.1.4 第 10 d 的變化 第 10 d 時，遠端部分顯示為修復良好的假復層上皮區域以及少量修復不良的纖維化區域（圖 1o）。纖維化病變組織從氣管壁凸出到管腔中，部分堵塞氣管（圖 2c）。纖維化病灶在遠端氣管的腹側和背側均可見，但似乎在背側更常見。
三色染色法證實遠端氣管纖維化區域存在膠原成分（圖 3a）。免疫組化染色法顯示纖維化組織表達 α-SMA，說明有成肌纖維細胞的存在。
圖1
氯氣暴露小鼠氣管上皮的組織學觀察（HE 染色，標尺 40 μm）
圖2
氯氣暴露小鼠氣管纖維化情況（標尺 50 μm）
a. 對照組氣管管腔結構； b. 氯氣暴露后 7 d 氣管管腔形態，可見纖維組織突入管腔； c. 氯氣暴露后 10 d 可見纖維組織突入管腔
圖3
氯氣暴露后 7 d 的氣管組織 Masson 染色和 α-SMA 組織化學染色結果
a. 遠端氣管 Masson 染色，箭頭示纖維化區域的膠原（藍色）（標尺 100 μm）； b. 氣管遠端 α-SMA 免疫組織化學染色，顯示修復不良的區域無表達（標尺 20 μm）； c. 在氣管遠端纖維化區域 α-SMA 染色陽性，箭頭所示為纖維化區域 α-SMA 染色陽性表達
2.2 基底細胞增殖修復氣管上皮的結果
近端和遠端氣管的染色結果雖然稍有不同但與中間段相似，因此用中間段氣管的染色圖片代表。即使在相同的段內，也可見隨區域不同其修復過程不同。對照組小鼠幾乎所有的基底細胞都表達了 K5（圖 4a），但表達 K14 的細胞極少，個別小鼠甚至沒有表達（圖 5a）。
暴露組小鼠中，在扁平上皮修復的早期階段即可觀察到 K5 和 K14 染色（圖 4b、圖 5b）。第 4 d ，在修復中的多層上皮基底和管腔面上可見大量的 K5 和 K14 表達陽性的細胞，同時這些表達 K5 和 K14 的細胞中 EdU 染色也是陽性的（圖 4c、圖 5c）。第 7 d，修復上皮細胞依然表達 K5 和 K14，但是增殖的細胞明顯減少（圖 4d、圖 5d）；在此時期，K5 和 K14 的表達較局限于基底的位置；與對照組小鼠的基底細胞比較，在暴露組中有很多染色陽性的細胞胞漿和胞核尺寸較大。第 10 d，K5 染色陽性的細胞主要集中在基底位置，而基底面的細胞體積變小接近于正常基底細胞，在基底面和腔面上仍可見少量的較大的 K5 染色陽性細胞（圖 4e）；K14 表達與早期相比有所減少，但仍比對照組的小鼠多（圖 5e）；此時間點上未能檢測到細胞增殖。
形態學定量分析顯示，在第 2 d 和第 4 d 時 K5 染色細胞分布有所改變，但 K5 表達細胞數量沒有減少趨勢（P>0.05）（圖 4a）。暴露組小鼠 K14 陽性細胞數量增加明顯，在第 2～4 d 時達頂峰，第 10 d 時逐漸減少但仍存在（圖5b）。K5 和 K14 表達細胞處于增殖狀態，近端氣管在第 2 d 時增殖達到峰值；中間和遠端氣管在第 4 d 時達到增殖高峰，在第 10 d時細胞增殖恢復到接近零的狀態（圖 5c、圖5d）。
圖4
氯氣損傷后細胞增殖和 K5 表達的熒光染色（標尺 40 μm）
圖5
氯氣損傷后細胞增殖和 K14 表達的熒光染色（標尺 40 μm）
3 討論
本研究明確了氯氣吸入性氣管損傷后上皮細胞自然修復的時間和過程。氯氣暴露導致大部分氣管上皮缺失，包括幾乎所有的纖毛細胞。在正常小鼠氣管上皮的穩定期內，氣管上皮只有極少的細胞有增殖，而在氯氣損傷后細胞增殖呈爆發式增長。氣管近端的上皮組織修復時間和修復速度都較氣管遠端部分早而快。修復期間，大量的基底細胞表達增殖標志物 K5 和 K14。與此不同的是，增殖修復階段沒有出現纖毛細胞，而只在修復的后期才觀察到這些分化細胞的標志物的表達。在上皮組織未能有效修復的區域由纖維增生組織取代。
目前研究證明基底細胞在氯氣吸入損傷氣管后作為祖細胞的功能發揮修復氣管上皮的作用。氯氣損傷氣管后導致大部分上皮細胞缺失，僅存的基底層細胞在氣管腔面以一層扁平的上皮開始重塑氣管上皮組織。從基底細胞在氣管上皮修復過程中分布的量和廣泛程度上看，其功能更接近于祖細胞，而不是一群數量稀少的干細胞。研究發現氣管支氣管上皮的基底細胞構成了一個多能祖細胞群，這群細胞在損傷后能自我更新并分化為纖毛細胞[7-8]。本研究結果支持參與修復組織的基底細胞為祖細胞的結論。而在二氧化硫損傷氣管的研究中，基底細胞被認為是參與修復的主要祖細胞成分，存活下來的克拉拉細胞發揮次要的修復氣管上皮的作用[9-10]。
在氯氣吸入損傷氣管后，我們檢測了基底細胞標志物細胞角蛋白的動態表達。在正常穩定狀態下，大部分基底細胞表達 K5，一部分亞群表達 K14。修復過程中 K14 陽性細胞的增多與萘損傷的報道相似[11]。而在皮膚和角膜組織中 K5 和 K14 為典型的共表達，呈現異二聚體角蛋白結合伴侶形式[12]。K14 在損傷后的上調以及它與增殖期的關聯表明了該蛋白在修復氣管上皮中的特定功能。我們還觀察到了修復過程中 K5 和 K14 表達細胞外形和大小的重要改變，從覆蓋在基底膜上的薄扁平細胞發展而來，然后變成較大的細胞，細胞核也增大，最后又發展為小錐體細胞并同時喪失 K14 表達。由于角蛋白參與控制細胞形狀和運動，一過性的 K14 表達可能反映了在修復過程中的上皮形態動態變化的過程。
氣管上皮的修復沿著氣管的近端和遠端軸變化，氣管近端上皮的修復速度和完整度都較遠端好。一種解釋是氣管的近端較中遠段或主支氣管具有更好的潛在修復能力。另一種解釋似乎更加合理，即氯氣吸入導致近端氣管的初始損傷較小。因為我們觀察到在氯氣暴露發生損傷的第 2 d，氣管遠端損傷更為嚴重，裸露的氣管表面區域明顯增多。而被認為是保護基底干細胞位點的黏膜下腺體都局限于小鼠近端氣管部位[13]。我們發現大量且分布廣泛的參與修復過程的基底祖細胞不是從基底干細胞位點處遷移而來，也不是參與修復氣管上皮的主力。在氣管遠端，K5 表達有減少趨勢，表明該處基底細胞較少，但是修復后效果卻沒有顯著差異。這可能是因為氣道其他解剖上的差異使得不同部位的修復得以保證，從而保證高效的修復。
綜上，本研究結果證明 K5 和 K14 表達細胞作為祖細胞開始增殖并啟動修復；盡管纖毛細胞缺失，但基底細胞全部保留，因此氣管上皮修復較好；但在高劑量氯氣暴露后，大量基底細胞缺失導致修復受限或延遲。
氯氣吸入可損傷呼吸道上皮細胞并導致急性肺水腫、肺炎和肺功能異常[1-2]。高濃度的氯接觸導致氣管近端假復層上皮，包括分泌細胞、纖毛細胞和基底細胞的脫落[3-4]。了解氯氣吸入性氣道損傷的過程可能為治療氣管損傷和肺損傷或促進上皮修復提供有效策略。損傷后的氣管上皮修復可以由局部的祖細胞和干細胞協調行動并最終恢復上皮的完整性[5-6]。氣管上皮損傷后，恢復正常的結構和功能必須由有效的細胞對受傷的上皮細胞進行修復，因此我們制備了小鼠氯氣吸入性氣道損傷模型，觀察小鼠急性氯氣吸入損傷后氣管上皮細胞的修復過程。
1 材料與方法
1.1 實驗動物和分組
健康雄性 C57BL/6 小鼠，15 只，3 月齡，體重 35～40 g，購置于中國醫科大學實驗動物中心。死亡小鼠不計入統計。小鼠隨機分為氯氣暴露組（12 只）和對照組（3 只）。氯氣暴露組于特制的接觸室內給予 240 mg/L 劑量的氯氣[3]，暴露時間為 1 h。分別于氯氣暴露后的第 2、4、7、10 d 處死。在處死小鼠的 18 h 前分別向小鼠腹腔內注射 10 mg/kg 的5-乙炔基-2'-脫氧尿苷（EdU）用以標記增殖的細胞。收集氣管組織于 10% 中性緩沖福爾馬林中固定，在石蠟包埋前按照近端、中段和遠端分成三等份。
1.2 主要儀器和試劑
EdU 為 Sigma-Aldrich 公司產品；EdU 檢測試劑盒為碧云天生物科技有限公司產品；兔抗角蛋白 5（K5）抗體、小鼠抗角蛋白 14（K14）抗體、α-平滑肌動蛋白（α-SMA）抗體、Alexa Fluor 594 驢抗兔 IgG、Alexa Fluor 594 驢抗小鼠 IgG 為博奧森生物技術有限公司產品；Masson 染色試劑盒購于南京建成生物技術有限公司。主要儀器有萊卡 2365 石蠟切片機，日本尼康 70I 光學顯微鏡，日本奧林巴斯 BX-41 倒置熒光顯微鏡。
1.3 方法
1.3.1 免疫熒光雙標法檢測 EdU 及上皮細胞標志物 石蠟切片脫蠟，梯度入水，pH6.0 的 10 mmol/L檸檬酸鹽 95 ℃ 下抗原修復 30 min；室溫下 1% 牛血清白蛋白、0.3% Triton X-100 封閉液孵育 30 min；沖洗，分別兔抗 K5（1∶1 000）、鼠抗 K14（1∶1 000）在室溫下孵育 1 h；沖洗，切片在室溫下與對應二抗孵育 1 h；沖洗，DAPI 復染細胞核，封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。
1.3.2 三色染色法和 α-SMA 免疫組化檢測 按照說明書步驟對氣管組織進行 Masson 三重染色。免疫組織化學檢測 α-SMA：切片脫蠟并水化，0.3% 過氧化氫滅活內源性過氧化物酶 30 min。然后 3% 牛血清白蛋白-0.3% Triton X-100 封閉液室溫孵育 30 min。切片沖洗后與 α-SMA 抗體（1∶500）室溫孵育 1 h。再沖洗，切片與 HRP 標記的羊抗鼠 IgG（1∶200）室溫下孵育 1 h。沖洗后，用 DAB 試劑進行顯色，適時終止顯色。蘇木素復染細胞核，脫水后封片。
1.3.3 形態學觀察 取近端、中段和遠端氣管組織的橫切面，選取包含完整圓形輪廓的氣管橫截面數字圖像。氣管上皮修復過程采用上皮基底膜評分法進行評估，設 4 個級別：正常、修復、扁平和剝脫[6]。（1）正常：柱狀或立方形的假復層上皮，含纖毛細胞；（2）修復：立方形，常見多層上皮但缺少纖毛細胞；（3）扁平：扁平上皮；（4）裸露：基底膜上沒有上皮覆蓋。對氣管上皮部分進行組織染色評估。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 16.0 軟件進行統計分析。數據以均數±標準差（
）表示，組間比較采用方差分析以及多重比較檢驗方法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 氣管修復區域的組織學觀察結果
2.1.1 第 2 d 的變化 對照組小鼠的氣管壁各段均由假復層上皮構成（圖 1a～c）。接觸氯氣 2 d 時大多數氣管上皮脫落（圖 1d～f）；此時，氣管腔的平直部分可以看到一層薄薄的扁平上皮（圖 1d），而其他區域似乎完全沒有上皮覆蓋（圖 1e、圖 1f）；氣管近端上皮修復的速度比中間或遠端部分快。
2.1.2 第 4 d 的變化 第 4 d 時，近端氣管的許多區域已經出現正常假復層上皮（圖 2a）。其他區域顯示修復上皮細胞內常包含未分化的立方形的細胞，傾向于形成多層的上皮細胞（圖 1g）。中、遠端氣管顯示處于修復的早期階段，包含單層扁平和單層立方上皮，但仍有區域缺乏上皮細胞覆蓋，特別是在遠端氣管部分（圖 1h、圖 1i）。
2.1.3 第 7 d 的變化 第 7 d 時，近端氣管主要由假復層上皮覆蓋（圖 1j），而中遠端氣管顯示含有假復層上皮以及修復和未修復的上皮（圖 1k、圖 1l）。氣管腹側部分和背側部分的修復過程相似，遠端氣管大部分區域未能有效修復，該區域主要為纖維化組織修復（圖 1l）。
2.1.4 第 10 d 的變化 第 10 d 時，遠端部分顯示為修復良好的假復層上皮區域以及少量修復不良的纖維化區域（圖 1o）。纖維化病變組織從氣管壁凸出到管腔中，部分堵塞氣管（圖 2c）。纖維化病灶在遠端氣管的腹側和背側均可見，但似乎在背側更常見。
三色染色法證實遠端氣管纖維化區域存在膠原成分（圖 3a）。免疫組化染色法顯示纖維化組織表達 α-SMA，說明有成肌纖維細胞的存在。
圖1
氯氣暴露小鼠氣管上皮的組織學觀察（HE 染色，標尺 40 μm）
圖2
氯氣暴露小鼠氣管纖維化情況（標尺 50 μm）
a. 對照組氣管管腔結構； b. 氯氣暴露后 7 d 氣管管腔形態，可見纖維組織突入管腔； c. 氯氣暴露后 10 d 可見纖維組織突入管腔
圖3
氯氣暴露后 7 d 的氣管組織 Masson 染色和 α-SMA 組織化學染色結果
a. 遠端氣管 Masson 染色，箭頭示纖維化區域的膠原（藍色）（標尺 100 μm）； b. 氣管遠端 α-SMA 免疫組織化學染色，顯示修復不良的區域無表達（標尺 20 μm）； c. 在氣管遠端纖維化區域 α-SMA 染色陽性，箭頭所示為纖維化區域 α-SMA 染色陽性表達
2.2 基底細胞增殖修復氣管上皮的結果
近端和遠端氣管的染色結果雖然稍有不同但與中間段相似，因此用中間段氣管的染色圖片代表。即使在相同的段內，也可見隨區域不同其修復過程不同。對照組小鼠幾乎所有的基底細胞都表達了 K5（圖 4a），但表達 K14 的細胞極少，個別小鼠甚至沒有表達（圖 5a）。
暴露組小鼠中，在扁平上皮修復的早期階段即可觀察到 K5 和 K14 染色（圖 4b、圖 5b）。第 4 d ，在修復中的多層上皮基底和管腔面上可見大量的 K5 和 K14 表達陽性的細胞，同時這些表達 K5 和 K14 的細胞中 EdU 染色也是陽性的（圖 4c、圖 5c）。第 7 d，修復上皮細胞依然表達 K5 和 K14，但是增殖的細胞明顯減少（圖 4d、圖 5d）；在此時期，K5 和 K14 的表達較局限于基底的位置；與對照組小鼠的基底細胞比較，在暴露組中有很多染色陽性的細胞胞漿和胞核尺寸較大。第 10 d，K5 染色陽性的細胞主要集中在基底位置，而基底面的細胞體積變小接近于正常基底細胞，在基底面和腔面上仍可見少量的較大的 K5 染色陽性細胞（圖 4e）；K14 表達與早期相比有所減少，但仍比對照組的小鼠多（圖 5e）；此時間點上未能檢測到細胞增殖。
形態學定量分析顯示，在第 2 d 和第 4 d 時 K5 染色細胞分布有所改變，但 K5 表達細胞數量沒有減少趨勢（P>0.05）（圖 4a）。暴露組小鼠 K14 陽性細胞數量增加明顯，在第 2～4 d 時達頂峰，第 10 d 時逐漸減少但仍存在（圖5b）。K5 和 K14 表達細胞處于增殖狀態，近端氣管在第 2 d 時增殖達到峰值；中間和遠端氣管在第 4 d 時達到增殖高峰，在第 10 d時細胞增殖恢復到接近零的狀態（圖 5c、圖5d）。
圖4
氯氣損傷后細胞增殖和 K5 表達的熒光染色（標尺 40 μm）
圖5
氯氣損傷后細胞增殖和 K14 表達的熒光染色（標尺 40 μm）
3 討論
本研究明確了氯氣吸入性氣管損傷后上皮細胞自然修復的時間和過程。氯氣暴露導致大部分氣管上皮缺失，包括幾乎所有的纖毛細胞。在正常小鼠氣管上皮的穩定期內，氣管上皮只有極少的細胞有增殖，而在氯氣損傷后細胞增殖呈爆發式增長。氣管近端的上皮組織修復時間和修復速度都較氣管遠端部分早而快。修復期間，大量的基底細胞表達增殖標志物 K5 和 K14。與此不同的是，增殖修復階段沒有出現纖毛細胞，而只在修復的后期才觀察到這些分化細胞的標志物的表達。在上皮組織未能有效修復的區域由纖維增生組織取代。
目前研究證明基底細胞在氯氣吸入損傷氣管后作為祖細胞的功能發揮修復氣管上皮的作用。氯氣損傷氣管后導致大部分上皮細胞缺失，僅存的基底層細胞在氣管腔面以一層扁平的上皮開始重塑氣管上皮組織。從基底細胞在氣管上皮修復過程中分布的量和廣泛程度上看，其功能更接近于祖細胞，而不是一群數量稀少的干細胞。研究發現氣管支氣管上皮的基底細胞構成了一個多能祖細胞群，這群細胞在損傷后能自我更新并分化為纖毛細胞[7-8]。本研究結果支持參與修復組織的基底細胞為祖細胞的結論。而在二氧化硫損傷氣管的研究中，基底細胞被認為是參與修復的主要祖細胞成分，存活下來的克拉拉細胞發揮次要的修復氣管上皮的作用[9-10]。
在氯氣吸入損傷氣管后，我們檢測了基底細胞標志物細胞角蛋白的動態表達。在正常穩定狀態下，大部分基底細胞表達 K5，一部分亞群表達 K14。修復過程中 K14 陽性細胞的增多與萘損傷的報道相似[11]。而在皮膚和角膜組織中 K5 和 K14 為典型的共表達，呈現異二聚體角蛋白結合伴侶形式[12]。K14 在損傷后的上調以及它與增殖期的關聯表明了該蛋白在修復氣管上皮中的特定功能。我們還觀察到了修復過程中 K5 和 K14 表達細胞外形和大小的重要改變，從覆蓋在基底膜上的薄扁平細胞發展而來，然后變成較大的細胞，細胞核也增大，最后又發展為小錐體細胞并同時喪失 K14 表達。由于角蛋白參與控制細胞形狀和運動，一過性的 K14 表達可能反映了在修復過程中的上皮形態動態變化的過程。
氣管上皮的修復沿著氣管的近端和遠端軸變化，氣管近端上皮的修復速度和完整度都較遠端好。一種解釋是氣管的近端較中遠段或主支氣管具有更好的潛在修復能力。另一種解釋似乎更加合理，即氯氣吸入導致近端氣管的初始損傷較小。因為我們觀察到在氯氣暴露發生損傷的第 2 d，氣管遠端損傷更為嚴重，裸露的氣管表面區域明顯增多。而被認為是保護基底干細胞位點的黏膜下腺體都局限于小鼠近端氣管部位[13]。我們發現大量且分布廣泛的參與修復過程的基底祖細胞不是從基底干細胞位點處遷移而來，也不是參與修復氣管上皮的主力。在氣管遠端，K5 表達有減少趨勢，表明該處基底細胞較少，但是修復后效果卻沒有顯著差異。這可能是因為氣道其他解剖上的差異使得不同部位的修復得以保證，從而保證高效的修復。
綜上，本研究結果證明 K5 和 K14 表達細胞作為祖細胞開始增殖并啟動修復；盡管纖毛細胞缺失，但基底細胞全部保留，因此氣管上皮修復較好；但在高劑量氯氣暴露后，大量基底細胞缺失導致修復受限或延遲。
