引用本文： 蔣涵, 賈超. 血小板白細胞聚集體水平在膿毒癥并發急性呼吸窘迫綜合征中的診斷價值. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(1): 42-45. doi: 10.7507/1671-6205.201705039 復制
近年來，膿毒癥患者并發急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的概率上升，并發 ARDS 后死亡率增加[1]。目前 ARDS 診斷的“柏林標準”[2]提高了臨床可操作性，但其診斷缺乏預見性，準確性仍然存在一些缺憾：首先，標準中缺乏生物標志物作為量化指標，降低了診斷的特異性；其次，盡管對胸部 X 線片的診斷依據較前有所完善，但評價標準依然不清楚，可能會出現診斷可靠性的下降；最后，柏林標準來源于一些研究的臨床數據和專家意見，能否符合臨床診斷并且廣泛推廣，可能還需要進一步的臨床研究。因此，對于膿毒癥所致 ARDS 患者的診斷方面，臨床醫師迫切需要尋找便于觀察且相對敏感的可靠生物標志物。
膿毒癥并發 ARDS 的發病機制主要是機體炎癥反應失控[3]，血管內皮損傷或受到促炎癥物質（如組胺）的刺激后，導致血小板活化[4-5]。目前已有多種血小板成分或生化改變可作為血小板活化的標志物，如血小板聚集實驗、P 選擇素、溶酶體蛋白和尿 11-DTXB2 含量（血栓烷 A2 的代謝產物）等，但大多是間接的或半定量的，缺乏敏感性。血小板和白細胞分別活化后，其表面的黏附分子增加，黏附分子通過配體相互結合和（或）通過纖維蛋白原在黏附分子之間的橋接作用形成血小板白細胞聚集體（platelet leukocyte aggregates，PLA）。血小板白細胞聚合物中，活化血小板與單核細胞結合比與中性粒細胞結合更早，且血小板與單核細胞聚合物所占比率遠大于血小板與中性粒細胞聚合物[6]，因此，血小板單核細胞聚集體（platelet-monocyte aggregates，PMA）作為活化血小板的標志物正越來越受到重視。已有臨床研究表明，PLA 尤其是 PMA 可以作為評價血小板活化的指標[7]。研究表明 PMA 在評價血小板活化方面與“金標準”P 選擇素相比是一種更加敏感的指標[8]。流式細胞技術的應用為評價血小板在體內活化的程度提供了快速可靠的方法[9-10]。本研究擬從膿毒血癥合并 ARDS 患者外周血 PLA 的水平變化，為膿毒血癥并發 ARDS 的早期診斷提供生物標志物量化指標。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
經倫理委員會許可，前瞻性研究 2015 年 1 月 1 日 00：00 至 2016 年 12 月 31 日 24：00 入住綿陽市中心醫院的成人膿毒癥患者。膿毒癥診斷符合膿毒癥 2.0（sepsis 2.0）的定義與診斷標準。所有膿毒癥受檢對象檢測前不分組，整理資料時按 2012“柏林定義”診斷標準入選試驗組或對照組，其中 58 例膿毒癥合并 ARDS 患者作為試驗組，139 例膿毒血癥非 ARDS 患者作為對照組。排除妊娠、合并血液系統疾病、HIV 感染、接受放化療、近 3 個月使用免疫抑制劑、肺間質纖維化、慢性阻塞性肺疾病等可能影響檢測結果的患者；排除因各種原因放棄治療及不同意參加本研究者。本實驗采用雙盲原則，在試驗操作的全過程和判定試驗結果時，試驗操作者、數據處理者均不知實驗分組情況。
1.2 方法
1.2.1 標本收集
所有病例均在診斷膿毒血癥后立即抽取靜脈血，在肘靜脈采血 3 ml，EDTA-K2 抗凝，采血時不能用壓脈帶，且棄掉開始 2 ml 血，以免穿刺引起血小板活化而影響結果。
1.2.2 PLA 檢測
應用流式細胞術（FACS Calibur 型流式細胞儀），檢測前先用 Flow Check 熒光微球進行光路與流路校準，NCCLS 推薦的 flow-set 室內質控方法，制備好的標本在 2 h 內使用流式細胞儀完成檢測。操作中根據 CD45 陽性可將白細胞與其他血細胞及細胞碎片雜質區別開。根據各類白細胞前向散射（區別細胞大小）和側向光散射（區別細胞內顆粒數目多少）的物理特性不同，區分淋巴細胞、單核和中性粒細胞。根據 CD42 陽性區別與 PLA 以及未與血小板結合的白細胞。以 CD45 和 CD42a 雙陽性的顆粒代表 PLA，結果以 PLA 與白細胞的數量百分比表示，即 PLA（%）=［（CD45+CD42a 雙陽性顆粒）/CD45 陽性顆粒］×100%，分別記錄 PLA、血小板淋巴細胞聚集體（platelet-lymphocyte aggregates，PLyA）、PMA 和血小板中性粒細胞聚集體（platelet-neutrophil aggregates，PNA）的百分比。
1.2.3 APACHEⅡ 評分
入院 24 h 后完成急性生理學和慢性健康狀況評分系統 Ⅱ（APACHEⅡ）評分，取 24 h 內最差值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件包對數據進行統計描述和分析。計量資料以均數±標準差（
）表示，兩組資料比較采用獨立樣本 t 檢驗。相關分析采用 Pearson 相關分析，P<0.05 為差異有統計學意義。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，確定 PMA 水平診斷膿毒癥合并 ARDS 的最佳臨界值、敏感性、特異性，比較不同指標間診斷價值的差異。
2 結果
2.1 兩組一般情況比較
兩組年齡和性別差異無統計學意義，結果見表 1。
表1
試驗組與對照組患者的一般情況
2.2 兩組 PLA、PNA、PLyA 和 PMA 的比較
試驗組 PLA、PNA 和 PLyA 高于對照組，但組間差異無統計學意義（P>0.05）。試驗組 PMA 顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 2。
表2
PLA、PNA、PLyA、PMA 檢測結果（
）
2.3 兩組 APACHEⅡ 評分的比較
試驗組 APACHEⅡ 評分明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 3。
表3
兩組 APACHEⅡ 評分的比較（
）
2.4 相關性分析
試驗組 PMA 與 APACHEⅡ 評分的 Pearson 線性相關分析結果顯示呈正相關（r=0.671，P<0.001），結果見圖 1。
圖1
試驗組 PMA、APACHEⅡ 評分相關性分析
2.5 各指標對 ARDS 的診斷價值
以 PMA、APACHEⅡ 評分為檢驗變量，ARDS 為狀態變量擬合 ROC 曲線。以 PMA 為檢驗變量時，ROC 曲線下面積（AUC）為 0.945，有顯著的診斷價值（P<0.001），PMA 最佳臨界值為 8.25%，診斷敏感性為 0.806，特異性為 0.951。以 APACHEⅡ 為檢驗變量時，AUC=0.930，有顯著的診斷價值（P<0.001），APACHEⅡ 最佳臨界值為 16.500，診斷敏感性為 0.871，特異性為 0.852。結果見表 4～5 和圖 2。
表4
各指標的曲線下面積
表5
各指標對 ARDS 的診斷價值
圖2
PMA、APACHEⅡ 診斷膿毒癥并發 ARDS 的 ROC 曲線
3 討論
膿毒癥是嚴重感染、創傷、重癥急腹癥、大手術后的常見并發癥。膿毒癥患者由于嚴重感染繼發促炎癥反應、抗炎癥反應和凋亡級聯反應，導致多器官功能衰竭，其中肺臟是最易受累的靶器官之一，肺功能損害程度與患者預后相關。由于膿毒癥引起的炎癥反應和凝血反應的激活，使患者的急性肺損傷的發生率高達 10%～20%，一旦損傷的典型癥狀出現，部分患者迅速惡化，可在短時間內發展為 ARDS[11]，對患者的預后、轉歸產生極大影響[12-13]。ARDS 是一組臨床綜合征，患者一旦發生 ARDS，無特效治療方法。多個對早期應用糖皮質激素、沙丁胺醇、表面活性物質的研究均為陰性結果，目前研究的熱點轉為早期預測和預防[14-16]。 2007 年以來對 ARDS 診斷指標的探索是研究的熱點。由于血漿易于獲取，易于檢測，成為主要的生物標本。
膿毒癥時內皮細胞受損導致炎癥細胞和血小板活化[5]，活化的炎癥細胞突破了炎癥細胞產生炎癥介質的自限作用，通過自我持續放大的級聯反應，產生大量的炎性因子和細胞因子，促進內皮細胞凋亡和單核細胞趨化蛋白的釋放，內皮細胞的損傷促進血小板活化和白細胞的黏附和激活，形成 PLA。血小板與白細胞在相互黏附過程中均被極化[17]，細胞極化的頭端黏附分子高度表達，導致 PLA 與血管內皮細胞的黏附性增強，大量 PLA 滯留于組織微循環內，促進腎臟的炎癥反應，導致腫瘤壞死因子-α 等炎性因子大量釋放，進一步加劇炎癥反應引起內皮細胞腫脹、壞死、脫落，形成惡性循環，PLA 在血小板活化和炎性機制之間起到一個橋梁作用[18]。目前已有研究表明膿毒癥患者外周血 PLA 水平升高，并與膿毒癥嚴重程度有關，預后不良組明顯高于預后良好組，提示 PLA 可能在膿毒癥損傷機制中起重要作用[19-20]。血管內皮損傷也是炎癥反應、缺血再灌注等導致 ARDS 的共同病理生理特點。
目前，國內外尚無 PLA 與膿毒癥并發 ARDS 的相關性研究。本研究采用流式細胞技術檢測膿毒血癥患者 PMA[9-10]，發現膿毒血癥并 ARDS 患者 PLA、PNA、PLyA、PMA 水平均高于對照組，PMA 差異有統計學意義，PLA、PNA、PLyA 與對照組比較差異無統計學意義。該結果產生的機制尚需進一步研究。APACHEⅡ 評分系統被臨床醫師廣泛用于評估重癥監護室危重患者的病情嚴重程度及預后。已有研究發現重癥患者 APACHEⅡ 評分對感染患者并發 ARDS 有一定的預測價值[21]。本研究結果顯示膿毒癥并 ARDS 患者 APACHEⅡ 評分分值明顯高于對照組，同時與外周血 PMA 水平呈正相關，結果均有統計學意義（P<0.05）。PMA 預測 ARDS 發生的準確性較高，AUC 為 0.945，PMA 最佳臨界值為 8.25%，特異性為 0.951%，敏感性為 0.806，可見 PMA 水平對預測 ARDS 具有臨床意義。
綜上，ARDS 患者血漿 PMA 水平升高是內皮細胞損傷和血管通透性增加的標志，且與炎癥介質釋放密切相關。雖然其確切機制仍需進一步研究，但本研究表明 PMA 指標的變化對膿毒癥并發 ARDS 的早期診斷確有臨床意義，可為膿毒血癥并發 ARDS 的早期診斷提供生物標志物量化指標。
近年來，膿毒癥患者并發急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）的概率上升，并發 ARDS 后死亡率增加[1]。目前 ARDS 診斷的“柏林標準”[2]提高了臨床可操作性，但其診斷缺乏預見性，準確性仍然存在一些缺憾：首先，標準中缺乏生物標志物作為量化指標，降低了診斷的特異性；其次，盡管對胸部 X 線片的診斷依據較前有所完善，但評價標準依然不清楚，可能會出現診斷可靠性的下降；最后，柏林標準來源于一些研究的臨床數據和專家意見，能否符合臨床診斷并且廣泛推廣，可能還需要進一步的臨床研究。因此，對于膿毒癥所致 ARDS 患者的診斷方面，臨床醫師迫切需要尋找便于觀察且相對敏感的可靠生物標志物。
膿毒癥并發 ARDS 的發病機制主要是機體炎癥反應失控[3]，血管內皮損傷或受到促炎癥物質（如組胺）的刺激后，導致血小板活化[4-5]。目前已有多種血小板成分或生化改變可作為血小板活化的標志物，如血小板聚集實驗、P 選擇素、溶酶體蛋白和尿 11-DTXB2 含量（血栓烷 A2 的代謝產物）等，但大多是間接的或半定量的，缺乏敏感性。血小板和白細胞分別活化后，其表面的黏附分子增加，黏附分子通過配體相互結合和（或）通過纖維蛋白原在黏附分子之間的橋接作用形成血小板白細胞聚集體（platelet leukocyte aggregates，PLA）。血小板白細胞聚合物中，活化血小板與單核細胞結合比與中性粒細胞結合更早，且血小板與單核細胞聚合物所占比率遠大于血小板與中性粒細胞聚合物[6]，因此，血小板單核細胞聚集體（platelet-monocyte aggregates，PMA）作為活化血小板的標志物正越來越受到重視。已有臨床研究表明，PLA 尤其是 PMA 可以作為評價血小板活化的指標[7]。研究表明 PMA 在評價血小板活化方面與“金標準”P 選擇素相比是一種更加敏感的指標[8]。流式細胞技術的應用為評價血小板在體內活化的程度提供了快速可靠的方法[9-10]。本研究擬從膿毒血癥合并 ARDS 患者外周血 PLA 的水平變化，為膿毒血癥并發 ARDS 的早期診斷提供生物標志物量化指標。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
經倫理委員會許可，前瞻性研究 2015 年 1 月 1 日 00：00 至 2016 年 12 月 31 日 24：00 入住綿陽市中心醫院的成人膿毒癥患者。膿毒癥診斷符合膿毒癥 2.0（sepsis 2.0）的定義與診斷標準。所有膿毒癥受檢對象檢測前不分組，整理資料時按 2012“柏林定義”診斷標準入選試驗組或對照組，其中 58 例膿毒癥合并 ARDS 患者作為試驗組，139 例膿毒血癥非 ARDS 患者作為對照組。排除妊娠、合并血液系統疾病、HIV 感染、接受放化療、近 3 個月使用免疫抑制劑、肺間質纖維化、慢性阻塞性肺疾病等可能影響檢測結果的患者；排除因各種原因放棄治療及不同意參加本研究者。本實驗采用雙盲原則，在試驗操作的全過程和判定試驗結果時，試驗操作者、數據處理者均不知實驗分組情況。
1.2 方法
1.2.1 標本收集
所有病例均在診斷膿毒血癥后立即抽取靜脈血，在肘靜脈采血 3 ml，EDTA-K2 抗凝，采血時不能用壓脈帶，且棄掉開始 2 ml 血，以免穿刺引起血小板活化而影響結果。
1.2.2 PLA 檢測
應用流式細胞術（FACS Calibur 型流式細胞儀），檢測前先用 Flow Check 熒光微球進行光路與流路校準，NCCLS 推薦的 flow-set 室內質控方法，制備好的標本在 2 h 內使用流式細胞儀完成檢測。操作中根據 CD45 陽性可將白細胞與其他血細胞及細胞碎片雜質區別開。根據各類白細胞前向散射（區別細胞大小）和側向光散射（區別細胞內顆粒數目多少）的物理特性不同，區分淋巴細胞、單核和中性粒細胞。根據 CD42 陽性區別與 PLA 以及未與血小板結合的白細胞。以 CD45 和 CD42a 雙陽性的顆粒代表 PLA，結果以 PLA 與白細胞的數量百分比表示，即 PLA（%）=［（CD45+CD42a 雙陽性顆粒）/CD45 陽性顆粒］×100%，分別記錄 PLA、血小板淋巴細胞聚集體（platelet-lymphocyte aggregates，PLyA）、PMA 和血小板中性粒細胞聚集體（platelet-neutrophil aggregates，PNA）的百分比。
1.2.3 APACHEⅡ 評分
入院 24 h 后完成急性生理學和慢性健康狀況評分系統 Ⅱ（APACHEⅡ）評分，取 24 h 內最差值。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件包對數據進行統計描述和分析。計量資料以均數±標準差（
）表示，兩組資料比較采用獨立樣本 t 檢驗。相關分析采用 Pearson 相關分析，P<0.05 為差異有統計學意義。繪制受試者工作特征（ROC）曲線，確定 PMA 水平診斷膿毒癥合并 ARDS 的最佳臨界值、敏感性、特異性，比較不同指標間診斷價值的差異。
2 結果
2.1 兩組一般情況比較
兩組年齡和性別差異無統計學意義，結果見表 1。
表1
試驗組與對照組患者的一般情況
2.2 兩組 PLA、PNA、PLyA 和 PMA 的比較
試驗組 PLA、PNA 和 PLyA 高于對照組，但組間差異無統計學意義（P>0.05）。試驗組 PMA 顯著高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 2。
表2
PLA、PNA、PLyA、PMA 檢測結果（
）
2.3 兩組 APACHEⅡ 評分的比較
試驗組 APACHEⅡ 評分明顯高于對照組，差異有統計學意義（P<0.05），結果見表 3。
表3
兩組 APACHEⅡ 評分的比較（
）
2.4 相關性分析
試驗組 PMA 與 APACHEⅡ 評分的 Pearson 線性相關分析結果顯示呈正相關（r=0.671，P<0.001），結果見圖 1。
圖1
試驗組 PMA、APACHEⅡ 評分相關性分析
2.5 各指標對 ARDS 的診斷價值
以 PMA、APACHEⅡ 評分為檢驗變量，ARDS 為狀態變量擬合 ROC 曲線。以 PMA 為檢驗變量時，ROC 曲線下面積（AUC）為 0.945，有顯著的診斷價值（P<0.001），PMA 最佳臨界值為 8.25%，診斷敏感性為 0.806，特異性為 0.951。以 APACHEⅡ 為檢驗變量時，AUC=0.930，有顯著的診斷價值（P<0.001），APACHEⅡ 最佳臨界值為 16.500，診斷敏感性為 0.871，特異性為 0.852。結果見表 4～5 和圖 2。
表4
各指標的曲線下面積
表5
各指標對 ARDS 的診斷價值
圖2
PMA、APACHEⅡ 診斷膿毒癥并發 ARDS 的 ROC 曲線
3 討論
膿毒癥是嚴重感染、創傷、重癥急腹癥、大手術后的常見并發癥。膿毒癥患者由于嚴重感染繼發促炎癥反應、抗炎癥反應和凋亡級聯反應，導致多器官功能衰竭，其中肺臟是最易受累的靶器官之一，肺功能損害程度與患者預后相關。由于膿毒癥引起的炎癥反應和凝血反應的激活，使患者的急性肺損傷的發生率高達 10%～20%，一旦損傷的典型癥狀出現，部分患者迅速惡化，可在短時間內發展為 ARDS[11]，對患者的預后、轉歸產生極大影響[12-13]。ARDS 是一組臨床綜合征，患者一旦發生 ARDS，無特效治療方法。多個對早期應用糖皮質激素、沙丁胺醇、表面活性物質的研究均為陰性結果，目前研究的熱點轉為早期預測和預防[14-16]。 2007 年以來對 ARDS 診斷指標的探索是研究的熱點。由于血漿易于獲取，易于檢測，成為主要的生物標本。
膿毒癥時內皮細胞受損導致炎癥細胞和血小板活化[5]，活化的炎癥細胞突破了炎癥細胞產生炎癥介質的自限作用，通過自我持續放大的級聯反應，產生大量的炎性因子和細胞因子，促進內皮細胞凋亡和單核細胞趨化蛋白的釋放，內皮細胞的損傷促進血小板活化和白細胞的黏附和激活，形成 PLA。血小板與白細胞在相互黏附過程中均被極化[17]，細胞極化的頭端黏附分子高度表達，導致 PLA 與血管內皮細胞的黏附性增強，大量 PLA 滯留于組織微循環內，促進腎臟的炎癥反應，導致腫瘤壞死因子-α 等炎性因子大量釋放，進一步加劇炎癥反應引起內皮細胞腫脹、壞死、脫落，形成惡性循環，PLA 在血小板活化和炎性機制之間起到一個橋梁作用[18]。目前已有研究表明膿毒癥患者外周血 PLA 水平升高，并與膿毒癥嚴重程度有關，預后不良組明顯高于預后良好組，提示 PLA 可能在膿毒癥損傷機制中起重要作用[19-20]。血管內皮損傷也是炎癥反應、缺血再灌注等導致 ARDS 的共同病理生理特點。
目前，國內外尚無 PLA 與膿毒癥并發 ARDS 的相關性研究。本研究采用流式細胞技術檢測膿毒血癥患者 PMA[9-10]，發現膿毒血癥并 ARDS 患者 PLA、PNA、PLyA、PMA 水平均高于對照組，PMA 差異有統計學意義，PLA、PNA、PLyA 與對照組比較差異無統計學意義。該結果產生的機制尚需進一步研究。APACHEⅡ 評分系統被臨床醫師廣泛用于評估重癥監護室危重患者的病情嚴重程度及預后。已有研究發現重癥患者 APACHEⅡ 評分對感染患者并發 ARDS 有一定的預測價值[21]。本研究結果顯示膿毒癥并 ARDS 患者 APACHEⅡ 評分分值明顯高于對照組，同時與外周血 PMA 水平呈正相關，結果均有統計學意義（P<0.05）。PMA 預測 ARDS 發生的準確性較高，AUC 為 0.945，PMA 最佳臨界值為 8.25%，特異性為 0.951%，敏感性為 0.806，可見 PMA 水平對預測 ARDS 具有臨床意義。
綜上，ARDS 患者血漿 PMA 水平升高是內皮細胞損傷和血管通透性增加的標志，且與炎癥介質釋放密切相關。雖然其確切機制仍需進一步研究，但本研究表明 PMA 指標的變化對膿毒癥并發 ARDS 的早期診斷確有臨床意義，可為膿毒血癥并發 ARDS 的早期診斷提供生物標志物量化指標。
