引用本文： 彭丹, 劉東利, 賀小龍. 慢性黏液分泌過多與痰中腫瘤抑制基因啟動子甲基化水平的相關性分析. 中國呼吸與危重監護雜志, 2018, 17(1): 27-32. doi: 10.7507/1671-6205.201704007 復制
預計到 2020 年慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）將成為全球第三大死亡原因[1-2]。慢阻肺存在不可逆的氣流阻塞，其重要表型是慢性黏液分泌過多（chronic mucus hypersecretion，CMH），特征在于上皮層和呼吸道黏膜下腺中的持續黏液細胞化。CMH 可導致更多的呼吸道癥狀，患者對呼吸道感染的易感性增加，更頻繁的慢阻肺急性加重，死亡的風險增加[3-4]，且有研究已證實 CMH 顯著增加后期肺癌的風險[5-7]。雖然吸煙可明顯導致 CMH 和肺癌這兩種疾病，但控制吸煙的研究分析表明，肺癌和先前 CMH 之間的關系至少部分與吸煙無關[5-7]。既往評估腫瘤抑制基因的肺癌病例對照研究表明這些基因的啟動子甲基化與肺癌風險相關[8-10]。本研究的目的在于確定吸煙者的痰 DNA 肺癌預測基因中，CMH 與啟動子甲基化之間是否存在關聯。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選擇 2013 年 6 月至 2016 年 5 月在延安大學附屬醫院呼吸內科診治的患者；研究對象納入標準為年齡 40～75 歲，無性別限制，現在或以前吸煙（至少 1 年 10 包煙），沒有服用治療 CMH 的藥物（如羧甲司坦）。所有受試者通過自我報告與痰液樣本進行基線評估，曾經吸煙者至少在自我報告 2 年前停止吸煙。所有研究對象均需簽訂知情同意書。本研究經醫院道德倫理委員會審核通過。根據上述納入標準共納入研究對象 1 080 例，并根據患者長期居住地進行分組，其中城市 700 例為城市組，農村 380 例為農村組。兩組吸煙者的基本特征見表 1。
表1
兩組吸煙者的基本特征［例（%）］
1.2 方法
1.2.1 痰樣本的收集和處理
囑咐研究對象晨起用清水漱口清潔，然后用力咳出氣管深處的痰液，盛于蠟紙盒或廣口瓶內，瓶內放 10% 甲醛溶液或 95% 酒精溶液固定后送檢。
1.2.2 腫瘤抑制基因啟動子甲基化狀態檢測
采用甲基化特異性 PCR（methylmion specific PCR，MSP）檢測痰樣品回收 DNA 胞嘧啶磷酸-鳥嘌呤位點上的胞嘧啶甲基化。總共檢測 11 個腫瘤抑制基因啟動子甲基化狀態，這些基因包括原鈣粘蛋白 20（protocadherin 20，PCDH20），硫酸酯酶 2（6-O-endosulfatase 2，SULF2），轉錄因子 GATA 結合蛋白 4（GATA binding protein-4，GATA4）和 GATA5，配對盒蛋白轉錄因子 5α（PAX5α）和 PAX5β，p16 基因（multiple tumor suppressor 1），O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（MGMT），死亡相關蛋白激酶（DAPK），腫瘤差異表達基因（DAL1），以及膜連接蛋白 3（JPH3）。
1.3 統計學方法
采用χ2 檢驗和 Fisher 精確檢驗用于分類變量的單變量分析，采用配對樣本 t 檢驗和 Kruskal-Wallis 檢驗用于分析連續變量。對 CMH 進行多變量分析，并進行邏輯回歸。預測因子包括基因特異性甲基化流行率，以及總甲基化（代表個體內甲基化的基因之和的連續變量）。其他預測因子包括年齡、教育、性別、慢阻肺狀態、吸煙史和當前吸煙狀態等。用 R 進行模型擬合迭代，使用小樣本矯正來確定最佳擬合模型。采用受試者工作特征（ROC）曲線評估區分 CMH 的邏輯回歸模型的敏感性和特異性。在生成 ROC 曲線之前進行建模以評估所有預測因子，包括所有 11 種基因和協變量。AICc 用于選擇在準確性和復雜性之間具有最佳權衡的模型[11]。所有統計分析用 R2.12.0 版本或 SAS 9.2 版進行。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CMH 與吸煙者基因啟動子甲基化的高發病率相關
研究最初是在城市組 700 例吸煙者中進行。在痰液收集時，有 241 例存在 CMH 的吸煙者，另外 459 例沒有 CMH。在未經調整的分析中，SULF2 甲基化的患病率在 CMH 吸煙者中顯著高于不存在 CMH 的吸煙者（36.9% 比 29.0%，P<0.01），結果見表 2。用同樣的方法對農村組吸煙者進行分析，包括 108 例存在 CMH 吸煙者和 272 例沒有 CMH 的吸煙者，SULF2 甲基化的患病率在 CMH 吸煙者中明顯高于無 CMH 吸煙者（39.0% 比 24.0%，P<0.01），結果見表 3。
表2
城市組吸煙者甲基化和抑制基因特征［例（%）］
表3
農村組吸煙者甲基化和抑制基因特征［例（%）］
在調整分析中，總甲基化與 SULF2、JPH3 和 PCDH20 的甲基化率在城市組 CMH 吸煙者中顯著更高（均 P<0.05）。同樣的在調整分析中，總甲基化與SULF2、p16 和 PCDH20 的甲基化率在農村組 CMH 吸煙者中顯著更高（均 P<0.05）。此外，對城市組和農村組進行了組合分析，在組合群組的未調整和調整分析中，總甲基化與SULF2、JPH3、p16 和 PCDH20 甲基化率一樣，在 CMH 吸煙者中顯著更高（P<0.01）。結果見表 4。
表4
調整分析中的 CMH 的優勢比
與 CMH 相關的其他因素是年齡較小、教育程度較低，患有慢阻肺、吸煙史和當前吸煙（P<0.01）。用這些因素進行建模，包括基線慢阻肺、吸煙史和甲基化的雙向相互作用，這些相互作用項對于總甲基化以及SULF2 或 PCDH20 甲基化不顯著，但是與城市組、農村組和組合群組中的 CMH 顯著相關。這些發現表明甲基化是 CMH 的獨立風險。
2.2 男性 CMH 與基因啟動子甲基化的關聯更強
單變量分析揭示了甲基化高患病率的相關因素，其中包括性別，由于觀察到甲基化患病率的性別差異，所以在男性和女性中進行性別分層分析。在兩個群組（P<0.01）對組合群組進行分析時發現總甲基化與男性 CMH 顯著相關（P<0.001，表 5）。當在男性中分析個體基因時，SULF2、p16 和 JPH3 在城市組中顯著相關（P<0.05），而SULF2 和 PCDH20 在城市組中顯著相關（P<0.05）。在組合群組中，SULF2、JPH3、PCDH20 和 p16 甲基化的患病率在具有 CMH 的男性中比在沒有 CMH 的男性中顯著更高（P<0.05）。盡管在城市組和農村組中女性更多，在組合群組的分析中與SULF2 甲基化患病率顯著相關（P<0.05），但是總甲基化與女性沒有顯著相關關系。
表5
性別分層調整分析中的 CMH 的優勢比
2.3 曾經吸煙者 CMH 與基因啟動子甲基化的相關性更強
在調整分析中控制了當前吸煙狀態和吸煙史（表 4、表 5），考慮到當前吸煙會嚴重影響 CMH，所以殘余混雜仍然是可能的（表 2、表 3）。因此，對現在吸煙者和曾經吸煙者進行了分層分析。調整分層分析顯示，城市組和農村組中 CMH 曾經吸煙者的總甲基化顯著更高（P<0.05，表 6）。雖然當前吸煙者在兩組中數量更多，但是當前吸煙者的總甲基化與 CMH 沒有顯著相關。甲基化和 CMH 之間的關聯不太顯著，并且在當前吸煙者中的表現更弱（表 6）。對組合群體的性別和吸煙的分層分析（組合以確保足夠的樣本大小用于分析，表 7）顯示，在男性曾經吸煙者中觀察到總甲基化與 CMH 的最強關聯，單個基因的優勢比為 2.57～4.35。盡管城市組和農村組中女性參與者的數量增加了 2～3 倍，但是在組合群體的女性中只有 SULF2 甲基化與 CMH 相關。
表6
當前和曾經吸煙者調整分析中的 CMH 的優勢比
表7
當前和曾經吸煙者的性別分層調整分析中的 CMH 的優勢比
2.4 痰中腫瘤抑制基因甲基化是男性曾經吸煙者 CMH 的一種敏感和特異的預測指標
在城市組和農村組中，最佳擬合模型是一個 3-基因模型，包括 SULF2、JPH3 和 p16，以及年齡、吸煙史、教育和慢阻肺（數據未顯示）。因此，采用來自城市組和農村組的組合樣本，3-基因模型、完全 11-基因模型和曾經男性吸煙者的僅協變量模型產生了 ROC 曲線（圖 1）。似然比證實 3-基因和 11-基因模型與協變量模型（P=0.000 2 和 P=0.002）有顯著區別，3-基因和 11-基因模型彼此沒有顯著差異（P=0.26）。3-基因和 11-基因模型的 ROC 曲線下面積（AUC）分別為 0.67 和 0.78，而協變量模型的 AUC 僅為 0.52。雖然群體分層分析的男性曾經吸煙者的樣本規模很小，但這些分析仍證明 3-基因模型的預測能力較強。
圖1
3-基因和 11-基因甲基化組對 CMH 分類敏感性和特異 性的 ROC 曲線
3 討論
本研究表明 CMH 與痰中啟動子甲基化率顯著相關。這種相關性在男性和曾經吸煙者中特別強，SULF2 是最一致的相關基因。重要的是，在城市組和農村組兩組群體中均獨立觀察到 CMH 與甲基化之間的整體關聯，以及性別和吸煙狀況的具體影響，組合組群加強了這些關聯的統計學意義。本研究發現存在 CMH 并且未治療過的男性曾經吸煙者患癌的風險可能會增加。鑒于 50% 診斷患有肺癌的人是曾經吸煙者，需要對患有 CMH 的曾經吸煙者的痰液腫瘤抑制基因甲基化與隨后發展成肺癌的相關性進行前瞻性研究[12]。基于先前證據表明腫瘤抑制基因與患癌風險相關[8]，本研究選擇驗證了 11 個相關基因，這些基因啟動子在腫瘤中已經顯示甲基化，并被認為是吸煙者的呼吸消化道中癌前表觀遺傳改變的擴展領域[11]。
本研究發現男性痰中基因啟動子甲基化率和 CMH 之間的關聯顯著強于女性。對兩個群組中男性和女性的單變量分析表明，患有 CMH 的女性年齡顯著小于城市組中的女性，但是這在農村組中不顯著。此外，年齡是調整分析中的協變量，因此不太可能說明女性痰中基因啟動子甲基化率和 CMH 之間缺乏關聯。這種明顯的女性保護機制值得進一步研究。
另外，本研究發現曾經吸煙者痰中基因啟動子甲基化率和 CMH 之間的關聯比現在吸煙者更強。曾經吸煙的影響程度增加可能是基于以下幾個原因：（1）曾經吸煙者的 CMH 表現可能不會被當前吸煙刺激引起的咳嗽和痰混淆。（2）在易感吸煙者中，戒煙后仍存在的 CMH 可以代表患者具有更獨特的分子病理學原型。（3）CMH 和基因啟動子甲基化之間的關聯可能隨著年齡增加。在城市組和農村組群體中，曾經吸煙者的年齡顯著大于當前吸煙者。曾經吸煙者與現在吸煙者之間的年齡差異可能解釋了現在吸煙者與曾經吸煙者相比總體甲基化水平較低的令人困惑的觀察結果：當前吸煙者更年輕，并且更年輕的年齡與肺癌風險基因中的總甲基化相關。
研究證明以前的 CMH 顯著增加了后來肺癌的風險[13]。診斷 CMH 和肺癌之間潛伏期的評估表明，這種風險隨著 CMH 確診時間增加而增加，延遲大于 15 年與延遲 1～5 年相比，優勢比幾乎翻了 4 倍[14]。重要的是，這表明 CMH 可以作為肺癌發生的前兆[14]。我們假設肺癌風險基因甲基化率的增加有助于解釋 CMH 和肺癌流行病學之間的聯系。需要進一步研究以建立基因甲基化與肺癌之間的直接聯系。盡管現在研究證明 SULF2、p16 和 PCDH20 與 CMH 相關，但是先前的研究表明 GATA4 啟動子甲基化與氣道阻塞有關。這些研究結果表明存在于異常啟動子甲基化影響的基因的主要差異與慢阻肺亞表型基因的不同有關。這與肺氣腫和 CMH 的主要病理生理學差異一致，并且表明基底細胞增生可能在肺癌的發展中起重要作用[15]。
針對 11 個基因的分析證實了 SULF2 與 CMH 的相關性最強。SULF2 是催化來自硫酸肝素多糖的 6-O-磺基水解的細胞外酶[16]。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）廣泛分布在細胞膜和細胞外基質上，是許多生長因子和細胞因子的共受體，6-O 硫酸鹽的位置對于配體結合特別重要。通過 siRNA 處理或啟動子甲基化的 SULF2 的表觀遺傳滅活激活許多Ⅰ型干擾素誘導基因[17]。Chand 等[18]提出 SULF2 的沉默阻止從干擾素結合位點去除硫酸基團，可保持干擾素的結合親和力或生物利用度，導致多個干擾素誘導基因的轉錄增加。由干擾素信號傳導失調而引起的代謝型黏液細胞的死亡，進而 CMH 持續性的增加，促使 SULF2 甲基化，而由 SULF2 的甲基化誘導的Ⅰ型干擾素應答可以有助于使與 CMH 相關的炎癥永久化。
綜上所述，本研究是一份關于 CMH 個體氣道表觀遺傳變化的報告，具有持續性 CMH 的男性吸煙者痰液腫瘤抑制基因的啟動子甲基化率顯著增加，這些吸煙者可能處于患癌的風險中。本研究的結果表明這些基因甲基化檢測對 CMH 具有預測穩健性，它們可用于從計算機斷層掃描篩選肺癌。事實上，低成本的基因特異性甲基化篩選測定可以并入臨床實踐中對疑似患癌風險患者進行篩選。
預計到 2020 年慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）將成為全球第三大死亡原因[1-2]。慢阻肺存在不可逆的氣流阻塞，其重要表型是慢性黏液分泌過多（chronic mucus hypersecretion，CMH），特征在于上皮層和呼吸道黏膜下腺中的持續黏液細胞化。CMH 可導致更多的呼吸道癥狀，患者對呼吸道感染的易感性增加，更頻繁的慢阻肺急性加重，死亡的風險增加[3-4]，且有研究已證實 CMH 顯著增加后期肺癌的風險[5-7]。雖然吸煙可明顯導致 CMH 和肺癌這兩種疾病，但控制吸煙的研究分析表明，肺癌和先前 CMH 之間的關系至少部分與吸煙無關[5-7]。既往評估腫瘤抑制基因的肺癌病例對照研究表明這些基因的啟動子甲基化與肺癌風險相關[8-10]。本研究的目的在于確定吸煙者的痰 DNA 肺癌預測基因中，CMH 與啟動子甲基化之間是否存在關聯。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
選擇 2013 年 6 月至 2016 年 5 月在延安大學附屬醫院呼吸內科診治的患者；研究對象納入標準為年齡 40～75 歲，無性別限制，現在或以前吸煙（至少 1 年 10 包煙），沒有服用治療 CMH 的藥物（如羧甲司坦）。所有受試者通過自我報告與痰液樣本進行基線評估，曾經吸煙者至少在自我報告 2 年前停止吸煙。所有研究對象均需簽訂知情同意書。本研究經醫院道德倫理委員會審核通過。根據上述納入標準共納入研究對象 1 080 例，并根據患者長期居住地進行分組，其中城市 700 例為城市組，農村 380 例為農村組。兩組吸煙者的基本特征見表 1。
表1
兩組吸煙者的基本特征［例（%）］
1.2 方法
1.2.1 痰樣本的收集和處理
囑咐研究對象晨起用清水漱口清潔，然后用力咳出氣管深處的痰液，盛于蠟紙盒或廣口瓶內，瓶內放 10% 甲醛溶液或 95% 酒精溶液固定后送檢。
1.2.2 腫瘤抑制基因啟動子甲基化狀態檢測
采用甲基化特異性 PCR（methylmion specific PCR，MSP）檢測痰樣品回收 DNA 胞嘧啶磷酸-鳥嘌呤位點上的胞嘧啶甲基化。總共檢測 11 個腫瘤抑制基因啟動子甲基化狀態，這些基因包括原鈣粘蛋白 20（protocadherin 20，PCDH20），硫酸酯酶 2（6-O-endosulfatase 2，SULF2），轉錄因子 GATA 結合蛋白 4（GATA binding protein-4，GATA4）和 GATA5，配對盒蛋白轉錄因子 5α（PAX5α）和 PAX5β，p16 基因（multiple tumor suppressor 1），O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（MGMT），死亡相關蛋白激酶（DAPK），腫瘤差異表達基因（DAL1），以及膜連接蛋白 3（JPH3）。
1.3 統計學方法
采用χ2 檢驗和 Fisher 精確檢驗用于分類變量的單變量分析，采用配對樣本 t 檢驗和 Kruskal-Wallis 檢驗用于分析連續變量。對 CMH 進行多變量分析，并進行邏輯回歸。預測因子包括基因特異性甲基化流行率，以及總甲基化（代表個體內甲基化的基因之和的連續變量）。其他預測因子包括年齡、教育、性別、慢阻肺狀態、吸煙史和當前吸煙狀態等。用 R 進行模型擬合迭代，使用小樣本矯正來確定最佳擬合模型。采用受試者工作特征（ROC）曲線評估區分 CMH 的邏輯回歸模型的敏感性和特異性。在生成 ROC 曲線之前進行建模以評估所有預測因子，包括所有 11 種基因和協變量。AICc 用于選擇在準確性和復雜性之間具有最佳權衡的模型[11]。所有統計分析用 R2.12.0 版本或 SAS 9.2 版進行。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 CMH 與吸煙者基因啟動子甲基化的高發病率相關
研究最初是在城市組 700 例吸煙者中進行。在痰液收集時，有 241 例存在 CMH 的吸煙者，另外 459 例沒有 CMH。在未經調整的分析中，SULF2 甲基化的患病率在 CMH 吸煙者中顯著高于不存在 CMH 的吸煙者（36.9% 比 29.0%，P<0.01），結果見表 2。用同樣的方法對農村組吸煙者進行分析，包括 108 例存在 CMH 吸煙者和 272 例沒有 CMH 的吸煙者，SULF2 甲基化的患病率在 CMH 吸煙者中明顯高于無 CMH 吸煙者（39.0% 比 24.0%，P<0.01），結果見表 3。
表2
城市組吸煙者甲基化和抑制基因特征［例（%）］
表3
農村組吸煙者甲基化和抑制基因特征［例（%）］
在調整分析中，總甲基化與 SULF2、JPH3 和 PCDH20 的甲基化率在城市組 CMH 吸煙者中顯著更高（均 P<0.05）。同樣的在調整分析中，總甲基化與SULF2、p16 和 PCDH20 的甲基化率在農村組 CMH 吸煙者中顯著更高（均 P<0.05）。此外，對城市組和農村組進行了組合分析，在組合群組的未調整和調整分析中，總甲基化與SULF2、JPH3、p16 和 PCDH20 甲基化率一樣，在 CMH 吸煙者中顯著更高（P<0.01）。結果見表 4。
表4
調整分析中的 CMH 的優勢比
與 CMH 相關的其他因素是年齡較小、教育程度較低，患有慢阻肺、吸煙史和當前吸煙（P<0.01）。用這些因素進行建模，包括基線慢阻肺、吸煙史和甲基化的雙向相互作用，這些相互作用項對于總甲基化以及SULF2 或 PCDH20 甲基化不顯著，但是與城市組、農村組和組合群組中的 CMH 顯著相關。這些發現表明甲基化是 CMH 的獨立風險。
2.2 男性 CMH 與基因啟動子甲基化的關聯更強
單變量分析揭示了甲基化高患病率的相關因素，其中包括性別，由于觀察到甲基化患病率的性別差異，所以在男性和女性中進行性別分層分析。在兩個群組（P<0.01）對組合群組進行分析時發現總甲基化與男性 CMH 顯著相關（P<0.001，表 5）。當在男性中分析個體基因時，SULF2、p16 和 JPH3 在城市組中顯著相關（P<0.05），而SULF2 和 PCDH20 在城市組中顯著相關（P<0.05）。在組合群組中，SULF2、JPH3、PCDH20 和 p16 甲基化的患病率在具有 CMH 的男性中比在沒有 CMH 的男性中顯著更高（P<0.05）。盡管在城市組和農村組中女性更多，在組合群組的分析中與SULF2 甲基化患病率顯著相關（P<0.05），但是總甲基化與女性沒有顯著相關關系。
表5
性別分層調整分析中的 CMH 的優勢比
2.3 曾經吸煙者 CMH 與基因啟動子甲基化的相關性更強
在調整分析中控制了當前吸煙狀態和吸煙史（表 4、表 5），考慮到當前吸煙會嚴重影響 CMH，所以殘余混雜仍然是可能的（表 2、表 3）。因此，對現在吸煙者和曾經吸煙者進行了分層分析。調整分層分析顯示，城市組和農村組中 CMH 曾經吸煙者的總甲基化顯著更高（P<0.05，表 6）。雖然當前吸煙者在兩組中數量更多，但是當前吸煙者的總甲基化與 CMH 沒有顯著相關。甲基化和 CMH 之間的關聯不太顯著，并且在當前吸煙者中的表現更弱（表 6）。對組合群體的性別和吸煙的分層分析（組合以確保足夠的樣本大小用于分析，表 7）顯示，在男性曾經吸煙者中觀察到總甲基化與 CMH 的最強關聯，單個基因的優勢比為 2.57～4.35。盡管城市組和農村組中女性參與者的數量增加了 2～3 倍，但是在組合群體的女性中只有 SULF2 甲基化與 CMH 相關。
表6
當前和曾經吸煙者調整分析中的 CMH 的優勢比
表7
當前和曾經吸煙者的性別分層調整分析中的 CMH 的優勢比
2.4 痰中腫瘤抑制基因甲基化是男性曾經吸煙者 CMH 的一種敏感和特異的預測指標
在城市組和農村組中，最佳擬合模型是一個 3-基因模型，包括 SULF2、JPH3 和 p16，以及年齡、吸煙史、教育和慢阻肺（數據未顯示）。因此，采用來自城市組和農村組的組合樣本，3-基因模型、完全 11-基因模型和曾經男性吸煙者的僅協變量模型產生了 ROC 曲線（圖 1）。似然比證實 3-基因和 11-基因模型與協變量模型（P=0.000 2 和 P=0.002）有顯著區別，3-基因和 11-基因模型彼此沒有顯著差異（P=0.26）。3-基因和 11-基因模型的 ROC 曲線下面積（AUC）分別為 0.67 和 0.78，而協變量模型的 AUC 僅為 0.52。雖然群體分層分析的男性曾經吸煙者的樣本規模很小，但這些分析仍證明 3-基因模型的預測能力較強。
圖1
3-基因和 11-基因甲基化組對 CMH 分類敏感性和特異 性的 ROC 曲線
3 討論
本研究表明 CMH 與痰中啟動子甲基化率顯著相關。這種相關性在男性和曾經吸煙者中特別強，SULF2 是最一致的相關基因。重要的是，在城市組和農村組兩組群體中均獨立觀察到 CMH 與甲基化之間的整體關聯，以及性別和吸煙狀況的具體影響，組合組群加強了這些關聯的統計學意義。本研究發現存在 CMH 并且未治療過的男性曾經吸煙者患癌的風險可能會增加。鑒于 50% 診斷患有肺癌的人是曾經吸煙者，需要對患有 CMH 的曾經吸煙者的痰液腫瘤抑制基因甲基化與隨后發展成肺癌的相關性進行前瞻性研究[12]。基于先前證據表明腫瘤抑制基因與患癌風險相關[8]，本研究選擇驗證了 11 個相關基因，這些基因啟動子在腫瘤中已經顯示甲基化，并被認為是吸煙者的呼吸消化道中癌前表觀遺傳改變的擴展領域[11]。
本研究發現男性痰中基因啟動子甲基化率和 CMH 之間的關聯顯著強于女性。對兩個群組中男性和女性的單變量分析表明，患有 CMH 的女性年齡顯著小于城市組中的女性，但是這在農村組中不顯著。此外，年齡是調整分析中的協變量，因此不太可能說明女性痰中基因啟動子甲基化率和 CMH 之間缺乏關聯。這種明顯的女性保護機制值得進一步研究。
另外，本研究發現曾經吸煙者痰中基因啟動子甲基化率和 CMH 之間的關聯比現在吸煙者更強。曾經吸煙的影響程度增加可能是基于以下幾個原因：（1）曾經吸煙者的 CMH 表現可能不會被當前吸煙刺激引起的咳嗽和痰混淆。（2）在易感吸煙者中，戒煙后仍存在的 CMH 可以代表患者具有更獨特的分子病理學原型。（3）CMH 和基因啟動子甲基化之間的關聯可能隨著年齡增加。在城市組和農村組群體中，曾經吸煙者的年齡顯著大于當前吸煙者。曾經吸煙者與現在吸煙者之間的年齡差異可能解釋了現在吸煙者與曾經吸煙者相比總體甲基化水平較低的令人困惑的觀察結果：當前吸煙者更年輕，并且更年輕的年齡與肺癌風險基因中的總甲基化相關。
研究證明以前的 CMH 顯著增加了后來肺癌的風險[13]。診斷 CMH 和肺癌之間潛伏期的評估表明，這種風險隨著 CMH 確診時間增加而增加，延遲大于 15 年與延遲 1～5 年相比，優勢比幾乎翻了 4 倍[14]。重要的是，這表明 CMH 可以作為肺癌發生的前兆[14]。我們假設肺癌風險基因甲基化率的增加有助于解釋 CMH 和肺癌流行病學之間的聯系。需要進一步研究以建立基因甲基化與肺癌之間的直接聯系。盡管現在研究證明 SULF2、p16 和 PCDH20 與 CMH 相關，但是先前的研究表明 GATA4 啟動子甲基化與氣道阻塞有關。這些研究結果表明存在于異常啟動子甲基化影響的基因的主要差異與慢阻肺亞表型基因的不同有關。這與肺氣腫和 CMH 的主要病理生理學差異一致，并且表明基底細胞增生可能在肺癌的發展中起重要作用[15]。
針對 11 個基因的分析證實了 SULF2 與 CMH 的相關性最強。SULF2 是催化來自硫酸肝素多糖的 6-O-磺基水解的細胞外酶[16]。硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）廣泛分布在細胞膜和細胞外基質上，是許多生長因子和細胞因子的共受體，6-O 硫酸鹽的位置對于配體結合特別重要。通過 siRNA 處理或啟動子甲基化的 SULF2 的表觀遺傳滅活激活許多Ⅰ型干擾素誘導基因[17]。Chand 等[18]提出 SULF2 的沉默阻止從干擾素結合位點去除硫酸基團，可保持干擾素的結合親和力或生物利用度，導致多個干擾素誘導基因的轉錄增加。由干擾素信號傳導失調而引起的代謝型黏液細胞的死亡，進而 CMH 持續性的增加，促使 SULF2 甲基化，而由 SULF2 的甲基化誘導的Ⅰ型干擾素應答可以有助于使與 CMH 相關的炎癥永久化。
綜上所述，本研究是一份關于 CMH 個體氣道表觀遺傳變化的報告，具有持續性 CMH 的男性吸煙者痰液腫瘤抑制基因的啟動子甲基化率顯著增加，這些吸煙者可能處于患癌的風險中。本研究的結果表明這些基因甲基化檢測對 CMH 具有預測穩健性，它們可用于從計算機斷層掃描篩選肺癌。事實上，低成本的基因特異性甲基化篩選測定可以并入臨床實踐中對疑似患癌風險患者進行篩選。
