引用本文： 劉文秀, 楊娟, 曹博, 高院. 甲磺酸伊馬替尼對放射性肺炎小鼠肺部氧化應激指標及轉化生長因子-β1 表達影響的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(5): 446-450. doi: 10.7507/1671-6205.201703027 復制
放射性肺炎是臨床最常見的胸部放療并發癥之一，不僅影響放療劑量進而降低抗腫瘤效果，還會影響患者生活質量，嚴重可導致死亡[1-2]。目前，臨床對于放射性肺炎的治療以大劑量糖皮質激素為主，盡管具有一定的效果，但仍存在不良反應較多，且極易導致腫瘤復發等問題[3-4]。有研究結果表明，轉化生長因子（TGF-β1）對多種放射性疾病的進展均具有較強的促進作用，故抑制該蛋白的產生可有效緩解放射所致機體損傷[5]。甲磺酸伊馬替尼是胃腸道間質腫瘤等多種惡性腫瘤的常用治療藥物。最新研究結果顯示，該藥物可通過抑制放射性肝損傷小鼠肝臟 TGF-β1 的合成來緩解相關癥狀，有望為放射性損傷的臨床治療提供一種新思路。然而目前針對其用于放射性肺炎的研究較少，該藥物是否具有較好的治療作用，仍需進行深入探討[6-7]。為此，本研究觀察了甲磺酸伊馬替尼對于放射性肺炎 C57BL/6 小鼠模型肺部氧化應激指標及 TGF-β1 表達的影響，期望為放射性肺炎的治療提供一定的實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗儀器 KJ-01 型遠距離放射性治療儀（中國核動力研究設計院生產）；AW-1 型石蠟切片機（德國微晶公司生產）；OL-13 型電子顯微鏡（美國奧林匹斯公司生產）；TQ-712 型組織包埋機（湖北安泰林公司生產）。
1.1.2 實驗試劑及藥品 甲磺酸伊馬替尼購自美國 SIGMA 公司，批號為 98078921；常規蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化及 TGF-β1 檢測所需試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司，批號分別為 2015012309、2015020914、2015010829 及 2015010492。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-Aoc）及超氧化物歧化酶（SOD）檢測所需試劑盒均購自美國 SIGMA 公司，批號分別為 98010112，98182019、98110231 及 98102103。
1.1.3 實驗動物 45 只清潔級 C57BL/6 雌鼠，8 周齡，平均體重（23.2±2.7）g，由西安交通大學 SPF 級實驗動物中心提供，合格證編號：SCXK（陜）2015-0236。實驗前對所有小鼠進行 7 d 的適應性飼養，飼料與飲水均無限制，自然光照，室溫。
1.2 方法
1.2.1 動物給藥劑量的計算 根據文獻[8]的計算公式：小鼠劑量（mg/kg）=成人劑量（mg/kg）×12.3，其中成人體重以 60 kg 計，甲磺酸伊馬替尼的一般人體劑量為 0.4 g/60 kg=0.006 6 g/kg，折合每只小鼠 0.006 6×12.3=0.081 g/kg。
1.2.2 放射性肺炎造模及治療方法 造模方法參考文獻[9-10]的方法。將上述 C57BL/6 小鼠隨機平均分為空白組、模型組和治療組，每組各 15 只，于相同條件下飼養。以 10% 水合氯醛麻醉小鼠，并取仰臥位將其四肢固定于治療床，充分曝露小鼠胸部，屏蔽其他部位后對模型組和治療組小鼠進行照射，照射劑量 18 Gy，放射參數 36 MV 光子，照射視野 3.0 cm×1.8 cm，每天照射 1 次，連續照射 30 d，空白組則僅給予麻醉及固定四肢處理，而不進行照射。每天照射完成 4 h 后，對治療組小鼠灌胃給予甲磺酸伊馬替尼（0.081 g/kg），空白組與模型組則僅給予等量生理鹽水。
1.2.3 小鼠肺標本處理 照射及灌胃 30 d 后，采用頸椎脫臼法將各組小鼠處死，打開胸腔后取雙側肺，將左、右兩側肺均分為 2 份，以 4% 多聚甲醛溶液固定后保存于–20 ℃ 冰箱中待檢測。
1.2.4 小鼠肺組織氧化應激指標檢測 取處理好的小鼠標本右側肺，利用玻璃勻漿器制備組織勻漿液，分別采用酶聯免疫法、化學比色法、硫代巴比妥酸比色法及黃嘌呤氧化酶法檢測其中 T-Aoc、GSH-PX、SOD 及 MDA 水平。
1.2.5 病理組織觀察方法 取部分處理好的小鼠標本左側肺，采用 HE 對其進行染色，并利用光鏡觀察各組小鼠病理組織結構。根據 HE 染色結果，并利用 Szapiel 半定量法對各組小鼠肺泡炎情況進行評價：無肺泡炎記作 1 分；輕度肺泡炎記作 2 分，即肺泡炎面積<30% 全視野面積；中度肺泡炎記作 3 分，即肺泡炎的面積為 20%～50% 全視野面積；重度肺泡炎記作 4 分，即肺泡炎的面積>50% 全視野面積[11]。
1.2.6 免疫組化方法 取部分處理好的小鼠標本左側肺，制作切片，并根據試劑盒說明書中相關方法，采用免疫組化法對其中 TGF-β1 蛋白相對表達量進行檢測，根據免疫組化結果，并利用 Szapiel 半定量法對其進行評分：0 分表示陽性細胞比例<5%；1 分表示陽性細胞率<10%；2 分表示陽性細胞率為 10%～50%；3 分表示陽性細胞率為 51%～75%；4 分表示陽性細胞率>75%[11]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件對本研究數據進行分析，以均數±標準差（ ）表示計量資料，采用 LSD-t 檢驗進行組間比較，P<0.05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組小鼠肺部氧化應激指標比較
治療后，空白組及治療組小鼠肺勻漿中 T-Aoc、GSH-PX 及 SOD 水平均明顯高于模型組，MDA 水平則均明顯低于模型組，差異均有統計學意義（均 P<0.05）。治療后，空白組與治療組上述氧化應激指標均基本一致，差異均無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1。
表1
各組小鼠肺部氧化應激指標比較（
）
2.2 各組小鼠肺組織 HE 染色比較
小鼠肺組織 HE 染色結果顯示，模型組與治療組小鼠均出現不同程度炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚及肺泡炎改變，其中模型組多為中級以上肺泡炎，治療組則多為輕度肺泡炎，空白組小鼠則均未出現肺泡炎改變。結果見圖 1。空白組及治療組 HE 染色評分分別為（1.00±0.00）分及（1.26±0.12）分，均明顯低于模型組的（3.14±0.52）分，差異均有統計學意義（與空白組比較，t=9.301，P=0.001；與治療組比較，t=8.892，P=0.001）。
圖1
各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×400） a. 空白組； b. 治療組； c. 模型組
2.3 各組小鼠免疫組化比較
小鼠肺組織免疫組化結果顯示，模型組小鼠出現大量肺泡巨噬細胞及肺泡細胞陽性表達，治療組則僅出現部分陽性表達，而空白組僅肺實質中少量肺泡巨噬細胞出現陽性表達。結果見圖 2。空白組及治療組免疫組化評分分別為（0.22±0.00）分及（0.31±0.12）分，均明顯低于模型組的（2.97±0.41）分，差異均有統計學意義（與空白組比較，t=8.872，P=0.001；與治療組比較，t=8.153，P=0.001）。
圖2
各組小鼠肺組織病理檢查像（免疫組化×400） a. 空白組； b. 治療組； c. 模型組
3 討論
放射性肺炎是一種由機體免疫系統所介導的局部放射反應，主要病理學基礎為射線直接作用于肺部細胞 DNA，造成肺部血管內皮細胞、肺泡上皮細胞等細胞出現脂質過氧化與炎癥級聯效應，導致細胞出現凋亡[12-13]。有研究結果表明，TGF-β1 是放射性肺炎發病過程中的關鍵蛋白之一，其主要作用于膠原翻譯及轉錄過程，可加速肺炎向肺纖維化的進展，具有較強的促纖維化作用[14]。此外，該蛋白還可趨化單核巨噬細胞與炎性細胞，并誘導上述細胞合成釋放白細胞介素-1 及白細胞介素-6 等細胞因子，進一步加劇肺部炎癥反應及氧化應激紊亂[15-16]。因此，降低 TGF-β1 的表達或是阻斷該蛋白的信號轉導通路可能是放射性肺炎治療的新思路[17]。甲磺酸伊馬替尼是一類重要的酪氨酸激酶抑制劑，臨床多用于慢性骨髓性白血病及胃腸道間質瘤等疾病的治療[18]。最新研究結果顯示，該藥物可抑制放射性肝損傷小鼠肝臟中 TGF-β1 的表達，從而緩解小鼠由于放射所造成的肝臟損傷[19-20]。盡管目前針對甲磺酸伊馬替尼用于治療放射性肝損傷的研究較為廣泛，但將其用于放射性肺炎小鼠的研究卻鮮有報道。為此，我們對甲磺酸伊馬替尼對放射性肺炎 C57BL/6 小鼠模型的治療作用進行了觀察，期望為該藥物的應用及放射性肺炎的治療提供一定的借鑒。
小鼠是各類醫學研究中重要動物模型之一，但不同種類的小鼠對放射線的敏感度均不相同，部分品系小鼠照射后常不出現相關放射性肺炎癥狀。C57BL/6 小鼠胸部照射后，則較易出現肺部纖連蛋白高表達，且其耐受性較好，基本不出現放射所致急性死亡，故常用于建立放射性機體損傷模型[9]。Carter 等[10]對 C57BL/6 小鼠造模方法進行了深入探討，其分別采用 9、18 及 27 Gy 等多種照射劑量對小鼠進行照射，結果顯示，以 18 Gy 的照射劑量連續照射 30 d 時，小鼠不僅成模情況較好，且生存狀態穩定，故本研究選取 18 Gy 作為照射劑量。
在本研究中，治療組小鼠 HE 染色評分及免疫組化評分均明顯低于模型組，提示甲磺酸伊馬替尼的使用不僅可明顯緩解放射所致肺泡炎，還可抑制小鼠肺部 TGF-β1 的表達，對放射性肺炎的恢復具有一定的促進作用。此外，治療組小鼠肺勻漿中 MDA 含量明顯低于模型組，且 SOD 及 GSH-PX 含量明顯高于模型組，提示甲磺酸伊馬替尼可有效緩解小鼠肺中氧化應激紊亂，對于緩解小鼠由于過氧化作用所導致的器官損傷具有重要意義。
然而本研究仍存在部分問題：首先，給藥劑量中僅根據藥物說明書采用了單一劑量進行治療，其量效關系則未進行深入探討；其次，雖然本研究對藥物部分作用機制進行了一定探討，但具體機制還需進一步研究；最后，本研究僅采用半定量法對 TGF-β1 的表達量進行了研究，但未利用免疫印跡等檢測手段進行深入驗證，后續還需要進行完善。
綜上所述，甲磺酸伊馬替尼不僅可有效緩解放射性肺炎小鼠肺部氧化應激紊亂，還能夠抑制肺部 TGF-β1 的表達，值得展開深入研究。
放射性肺炎是臨床最常見的胸部放療并發癥之一，不僅影響放療劑量進而降低抗腫瘤效果，還會影響患者生活質量，嚴重可導致死亡[1-2]。目前，臨床對于放射性肺炎的治療以大劑量糖皮質激素為主，盡管具有一定的效果，但仍存在不良反應較多，且極易導致腫瘤復發等問題[3-4]。有研究結果表明，轉化生長因子（TGF-β1）對多種放射性疾病的進展均具有較強的促進作用，故抑制該蛋白的產生可有效緩解放射所致機體損傷[5]。甲磺酸伊馬替尼是胃腸道間質腫瘤等多種惡性腫瘤的常用治療藥物。最新研究結果顯示，該藥物可通過抑制放射性肝損傷小鼠肝臟 TGF-β1 的合成來緩解相關癥狀，有望為放射性損傷的臨床治療提供一種新思路。然而目前針對其用于放射性肺炎的研究較少，該藥物是否具有較好的治療作用，仍需進行深入探討[6-7]。為此，本研究觀察了甲磺酸伊馬替尼對于放射性肺炎 C57BL/6 小鼠模型肺部氧化應激指標及 TGF-β1 表達的影響，期望為放射性肺炎的治療提供一定的實驗依據。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
1.1.1 實驗儀器 KJ-01 型遠距離放射性治療儀（中國核動力研究設計院生產）；AW-1 型石蠟切片機（德國微晶公司生產）；OL-13 型電子顯微鏡（美國奧林匹斯公司生產）；TQ-712 型組織包埋機（湖北安泰林公司生產）。
1.1.2 實驗試劑及藥品 甲磺酸伊馬替尼購自美國 SIGMA 公司，批號為 98078921；常規蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化及 TGF-β1 檢測所需試劑盒均購自武漢博士德生物科技有限公司，批號分別為 2015012309、2015020914、2015010829 及 2015010492。谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-Aoc）及超氧化物歧化酶（SOD）檢測所需試劑盒均購自美國 SIGMA 公司，批號分別為 98010112，98182019、98110231 及 98102103。
1.1.3 實驗動物 45 只清潔級 C57BL/6 雌鼠，8 周齡，平均體重（23.2±2.7）g，由西安交通大學 SPF 級實驗動物中心提供，合格證編號：SCXK（陜）2015-0236。實驗前對所有小鼠進行 7 d 的適應性飼養，飼料與飲水均無限制，自然光照，室溫。
1.2 方法
1.2.1 動物給藥劑量的計算 根據文獻[8]的計算公式：小鼠劑量（mg/kg）=成人劑量（mg/kg）×12.3，其中成人體重以 60 kg 計，甲磺酸伊馬替尼的一般人體劑量為 0.4 g/60 kg=0.006 6 g/kg，折合每只小鼠 0.006 6×12.3=0.081 g/kg。
1.2.2 放射性肺炎造模及治療方法 造模方法參考文獻[9-10]的方法。將上述 C57BL/6 小鼠隨機平均分為空白組、模型組和治療組，每組各 15 只，于相同條件下飼養。以 10% 水合氯醛麻醉小鼠，并取仰臥位將其四肢固定于治療床，充分曝露小鼠胸部，屏蔽其他部位后對模型組和治療組小鼠進行照射，照射劑量 18 Gy，放射參數 36 MV 光子，照射視野 3.0 cm×1.8 cm，每天照射 1 次，連續照射 30 d，空白組則僅給予麻醉及固定四肢處理，而不進行照射。每天照射完成 4 h 后，對治療組小鼠灌胃給予甲磺酸伊馬替尼（0.081 g/kg），空白組與模型組則僅給予等量生理鹽水。
1.2.3 小鼠肺標本處理 照射及灌胃 30 d 后，采用頸椎脫臼法將各組小鼠處死，打開胸腔后取雙側肺，將左、右兩側肺均分為 2 份，以 4% 多聚甲醛溶液固定后保存于–20 ℃ 冰箱中待檢測。
1.2.4 小鼠肺組織氧化應激指標檢測 取處理好的小鼠標本右側肺，利用玻璃勻漿器制備組織勻漿液，分別采用酶聯免疫法、化學比色法、硫代巴比妥酸比色法及黃嘌呤氧化酶法檢測其中 T-Aoc、GSH-PX、SOD 及 MDA 水平。
1.2.5 病理組織觀察方法 取部分處理好的小鼠標本左側肺，采用 HE 對其進行染色，并利用光鏡觀察各組小鼠病理組織結構。根據 HE 染色結果，并利用 Szapiel 半定量法對各組小鼠肺泡炎情況進行評價：無肺泡炎記作 1 分；輕度肺泡炎記作 2 分，即肺泡炎面積<30% 全視野面積；中度肺泡炎記作 3 分，即肺泡炎的面積為 20%～50% 全視野面積；重度肺泡炎記作 4 分，即肺泡炎的面積>50% 全視野面積[11]。
1.2.6 免疫組化方法 取部分處理好的小鼠標本左側肺，制作切片，并根據試劑盒說明書中相關方法，采用免疫組化法對其中 TGF-β1 蛋白相對表達量進行檢測，根據免疫組化結果，并利用 Szapiel 半定量法對其進行評分：0 分表示陽性細胞比例<5%；1 分表示陽性細胞率<10%；2 分表示陽性細胞率為 10%～50%；3 分表示陽性細胞率為 51%～75%；4 分表示陽性細胞率>75%[11]。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 22.0 軟件對本研究數據進行分析，以均數±標準差（ ）表示計量資料，采用 LSD-t 檢驗進行組間比較，P<0.05 表示差異有統計學意義。
2 結果
2.1 各組小鼠肺部氧化應激指標比較
治療后，空白組及治療組小鼠肺勻漿中 T-Aoc、GSH-PX 及 SOD 水平均明顯高于模型組，MDA 水平則均明顯低于模型組，差異均有統計學意義（均 P<0.05）。治療后，空白組與治療組上述氧化應激指標均基本一致，差異均無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1。
表1
各組小鼠肺部氧化應激指標比較（
）
2.2 各組小鼠肺組織 HE 染色比較
小鼠肺組織 HE 染色結果顯示，模型組與治療組小鼠均出現不同程度炎性細胞浸潤、肺泡間隔增厚及肺泡炎改變，其中模型組多為中級以上肺泡炎，治療組則多為輕度肺泡炎，空白組小鼠則均未出現肺泡炎改變。結果見圖 1。空白組及治療組 HE 染色評分分別為（1.00±0.00）分及（1.26±0.12）分，均明顯低于模型組的（3.14±0.52）分，差異均有統計學意義（與空白組比較，t=9.301，P=0.001；與治療組比較，t=8.892，P=0.001）。
圖1
各組小鼠肺組織病理檢查像（HE×400） a. 空白組； b. 治療組； c. 模型組
2.3 各組小鼠免疫組化比較
小鼠肺組織免疫組化結果顯示，模型組小鼠出現大量肺泡巨噬細胞及肺泡細胞陽性表達，治療組則僅出現部分陽性表達，而空白組僅肺實質中少量肺泡巨噬細胞出現陽性表達。結果見圖 2。空白組及治療組免疫組化評分分別為（0.22±0.00）分及（0.31±0.12）分，均明顯低于模型組的（2.97±0.41）分，差異均有統計學意義（與空白組比較，t=8.872，P=0.001；與治療組比較，t=8.153，P=0.001）。
圖2
各組小鼠肺組織病理檢查像（免疫組化×400） a. 空白組； b. 治療組； c. 模型組
3 討論
放射性肺炎是一種由機體免疫系統所介導的局部放射反應，主要病理學基礎為射線直接作用于肺部細胞 DNA，造成肺部血管內皮細胞、肺泡上皮細胞等細胞出現脂質過氧化與炎癥級聯效應，導致細胞出現凋亡[12-13]。有研究結果表明，TGF-β1 是放射性肺炎發病過程中的關鍵蛋白之一，其主要作用于膠原翻譯及轉錄過程，可加速肺炎向肺纖維化的進展，具有較強的促纖維化作用[14]。此外，該蛋白還可趨化單核巨噬細胞與炎性細胞，并誘導上述細胞合成釋放白細胞介素-1 及白細胞介素-6 等細胞因子，進一步加劇肺部炎癥反應及氧化應激紊亂[15-16]。因此，降低 TGF-β1 的表達或是阻斷該蛋白的信號轉導通路可能是放射性肺炎治療的新思路[17]。甲磺酸伊馬替尼是一類重要的酪氨酸激酶抑制劑，臨床多用于慢性骨髓性白血病及胃腸道間質瘤等疾病的治療[18]。最新研究結果顯示，該藥物可抑制放射性肝損傷小鼠肝臟中 TGF-β1 的表達，從而緩解小鼠由于放射所造成的肝臟損傷[19-20]。盡管目前針對甲磺酸伊馬替尼用于治療放射性肝損傷的研究較為廣泛，但將其用于放射性肺炎小鼠的研究卻鮮有報道。為此，我們對甲磺酸伊馬替尼對放射性肺炎 C57BL/6 小鼠模型的治療作用進行了觀察，期望為該藥物的應用及放射性肺炎的治療提供一定的借鑒。
小鼠是各類醫學研究中重要動物模型之一，但不同種類的小鼠對放射線的敏感度均不相同，部分品系小鼠照射后常不出現相關放射性肺炎癥狀。C57BL/6 小鼠胸部照射后，則較易出現肺部纖連蛋白高表達，且其耐受性較好，基本不出現放射所致急性死亡，故常用于建立放射性機體損傷模型[9]。Carter 等[10]對 C57BL/6 小鼠造模方法進行了深入探討，其分別采用 9、18 及 27 Gy 等多種照射劑量對小鼠進行照射，結果顯示，以 18 Gy 的照射劑量連續照射 30 d 時，小鼠不僅成模情況較好，且生存狀態穩定，故本研究選取 18 Gy 作為照射劑量。
在本研究中，治療組小鼠 HE 染色評分及免疫組化評分均明顯低于模型組，提示甲磺酸伊馬替尼的使用不僅可明顯緩解放射所致肺泡炎，還可抑制小鼠肺部 TGF-β1 的表達，對放射性肺炎的恢復具有一定的促進作用。此外，治療組小鼠肺勻漿中 MDA 含量明顯低于模型組，且 SOD 及 GSH-PX 含量明顯高于模型組，提示甲磺酸伊馬替尼可有效緩解小鼠肺中氧化應激紊亂，對于緩解小鼠由于過氧化作用所導致的器官損傷具有重要意義。
然而本研究仍存在部分問題：首先，給藥劑量中僅根據藥物說明書采用了單一劑量進行治療，其量效關系則未進行深入探討；其次，雖然本研究對藥物部分作用機制進行了一定探討，但具體機制還需進一步研究；最后，本研究僅采用半定量法對 TGF-β1 的表達量進行了研究，但未利用免疫印跡等檢測手段進行深入驗證，后續還需要進行完善。
綜上所述，甲磺酸伊馬替尼不僅可有效緩解放射性肺炎小鼠肺部氧化應激紊亂，還能夠抑制肺部 TGF-β1 的表達，值得展開深入研究。
