引用本文： 曾燕婷, 李理, 袁偉鋒, 郭振輝, 黃文杰. 腫瘤壞死因子-α 可誘導 GSTM5 核轉位. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(5): 451-456. doi: 10.7507/1671-6205.201611031 復制
急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）是一個具有復雜病理和發病機制的危重癥臨床綜合征，其本質是肺部過度失控的炎癥反應[1]。過度炎癥反應引發氧化應激狀態，誘導細胞內源性活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成量劇增，超過機體抗氧化系統的清除能力，使機體處于進行性加重的氧化應激狀態，導致肺結構細胞損傷[2]。谷胱甘肽 S 轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）與谷胱甘肽結合，是具有多種功能的催化氧化還原反應的酶超家族，與其他抗氧化酶在細胞內共同起到清除活性氧，保護細胞免受氧化損傷的作用[3]。谷胱甘肽 S 轉移酶 mu 5（GSTM5）是 GST 家族的成員。本研究小組前期對炎癥誘發的氧化應激調控的研究發現，腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可誘導人氣道上皮細胞 16HBE 細胞 NOX1 轉錄及表達明顯上調[4]。GSTM5 這種酶活性以外的生理功能激起了我們的興趣。本研究擬構建人 GSTM5 基因的慢病毒表達載體及穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株，并觀察 TNF-α 刺激模擬的細胞炎癥狀態下 GSTM5 核轉位情況，為后續研究 GSTM5 的轉錄調控功能奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
16HBE、293T 細胞、Stbl3 菌種由廣州軍區總醫院醫學實驗科細胞庫提供；北美胎牛血清、DMEM 高糖培養基、胰酶、谷氨酰胺（Gln）購于 Gibico 公司；重組人 TNF-α 購自美國 Pepro Tech 公司；BCA 法蛋白濃度測定試劑盒、逆轉錄試劑、PCR、Real-time qPCR 相關試劑購自 TaKaRa 公司；引物由上海英濰捷基公司合成。慢病毒系統（含表達載體 plvx-puro-3*flag-SBP、plvx-puro-MCS-SBP-3*flag 和 2 種包裝質粒 psPAX2、Pmd2.G、慢病毒包裝專用促轉染試劑 FItran 購于輝駿生物；限制性內切酶 BamHI 與 XbaI、EcoRI、NotI、T4 DNA 連接酶購自 Thermo Scientific 公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit 連接酶購自諾唯贊公司；質粒提取和凝膠回收試劑盒為 Qiagen 公司產品。Trizol 試劑、轉染試劑 Lipofectamine 2000 和嘌呤霉素購自 Invitrogen 公司；ECL 熒光底物試劑盒購自美國 Pierce 公司。抗 3*flag-FITC 熒光抗體（ab106221）、抗 GSTM5 抗體（ab112918）購自 Abcam。
重組慢病毒載體分組：c：PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、d：PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C。穩定轉染細胞株（穩轉株）分組：A：16HBE；B：16HBE-SBP-3*flag；C：16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N；D：16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C。
1.2 方法
1.2.1 重組慢病毒表達質粒 PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C 及慢病毒制備：根據 GSTM5（NM_000851）基因序列設計引物，序列見表 1，以 16HBE 總 RNA 為模板，使用 PrimeSTAR 高保真酶擴增 GSTM5 基因片段。使用微量瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收 PCR 產物。空載體 PLVX-puro-MCS-SBP-3*flag 與引物 GSTM5-F2、R2 的 PCR 中的目的基因片段條帶和酶切后的載體條帶，回收純化，用 T4 DNA 連接酶連接載體和目的基因片段，以得到重組慢病毒載體 c：PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N。
空載體 PLVX-puro-3*flag-SBP 與引物 GSTM5-F、R 的 PCR 產物進行雙酶切（BamHI 與 XbaI）后使用 ClonExpress II One Step Cloning Kit 無縫連接以得到重組慢病毒載體 d：PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C。將 10 μl 連接產物加入至 100 μl Stbl3 感受態細胞（氯化鈣法制備）中完成連接產物的轉化。將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素（100 μg/ml）的 LB 平板上，24 h 后，挑取數個菌落，PCR 檢測目的基因表達。取 10 μl PCR 產物點樣到 1% 凝膠電泳，對照 Marker 大小，選取正確的菌落搖菌，測序。并以雙酶切（XhoII、SpeI、EcoRI、BamHI）鑒定所構建的 2 個載體。
表1
引物序列
1.2.2 慢病毒包裝 293T 細胞在含 10% 滅活胎牛血清的 DMEM 培養基中，置于培養箱 37 ℃，5% CO 2 培養。待細胞生長成均勻單層細胞并達 90% 以上聚集度時傳代接種于 10 cm 細胞培養皿，5×106/皿（總共 10 ml 完全培養基）。24 h 后待細胞密度達 70%～80% 時即可用于分盤到 150 mm 細胞培養盤。包裝當天，即分皿 24 h 后，給 293T 細胞換上 20 ml 無抗培養基 DMEM+10% FBS+4 mmol/L Gln，37 ℃、5% CO 2 培養箱培養 2 h。27 μg 的慢病毒質粒和 2 個輔助質粒加入 1 ml 的生理鹽水中輕柔顛倒混合，靜止 5 min 后并加入質粒 2.5～3 倍轉染試劑 Polyethylenimine，室溫靜置孵育 20 min 后緩慢均勻滴入 150 mm 培養皿中，適當搖勻；此時記為轉染開始時間。轉染 4～6 h 后換液，吸取適量 PBS 輕輕漂洗細胞 1～2 次，換上培養基 DMEM+10% FBS+4 mmol/L Gln+1% 青鏈霉素。
1.2.3 病毒收集 轉染后 48 h 和 72 h 分別收集上清，1 000 r/min 離心 5 min，取上清用 0.45 μm 微孔濾器過濾。4 ℃，25 000 g 超高速冷凍離心機高速離心 2 h，棄上清，病毒沉淀用 1 ml PBS 充分溶解，分裝為 100 μl/管。滴度測定后 –80 ℃ 冰箱保存。切勿反復凍融，每次凍融大約有 10% 的損失。48 h 收集的上清可先置于 4 ℃ 冰箱保存。
1.2.4 16HBE-GSTM5 穩轉株感染、篩選 16HBE 細胞傳代，取 5×106 /孔的密度接種至 6 孔板，接種 4 個孔待 16HBE 細胞貼壁匯合度為 40%～50% 后進行感染；感染前，每孔細胞換成無雙抗 1 000 μl 新鮮的 DMEM 完全培養基（含10 μg/ml polybrene），提高逆轉錄病毒感染細胞的效率，放置于培養箱孵育 1 h。取 2 孔細胞分別加入上述制備的 2 種 GSTM5 慢病毒上清液 1 000 μl，第 3 孔細胞加 1 000 μl 的空載慢病毒上清液，第 4 孔做空白細胞對照，充分的搖勻后放入 37 ℃、5% CO 2、95% 相對濕度的培養箱中培養。感染 6 h 后換成新鮮的 DMEM 完全培養基+1% 青鏈霉素，待細胞生長至 80% 融合度時，加入 1 μl 的 Puromycin（終濃度 4 μg/ml）進行藥篩。每天更換含 Puromycin（2 μg/ml）完全培養基，直至空白細胞全部凋亡。每次更換細胞培養基均需要加入原藥物濃度的一半來維持細胞生長，即 Puromycin 的終濃度為 2 μg/ml。擴增培養后液氮凍存。至此，篩選得到穩轉株 B：16HBE-SBP-3*flag，C：16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，D：16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 。
1.2.5 RT-qPCR 檢測 GSTM5 基因表達水平 取上述 3 株細胞及正常 16HBE 細胞鋪板后按 life technology 公司提供的 Triozol 使用說明抽提 RNA，紫外分光光度計測定 RNA 濃度后去基因組 DNA，逆轉錄合成 cDNA。采用 RT-qPCR 兩步法定量分析各組細胞 GSTM5 基因 mRNA 表達水平，引物序列見表 2。反應條件：反應條件：預變性 95 ℃ 3 min；變性 95 ℃ 10 s、退火 60 ℃ 34 s、延伸 72 ℃ 30 s，共進行 45 個循環。循環結束后從 60 ℃ 升高到 98 ℃ 獲取熔解曲線。結果采用公式：–?CT=–[Mean（檢測基因 CT 值）–Mean（內參基因 CT 值）]，–??CT=–（GSTM5 組 ?CT–對照組 ?CT），相對表達量 RQ=2–??CT。
表2
RT-qPCR 引物
1.2.6 Western blot 驗證 3 株穩轉株及正常 16HBE 分別提蛋白后用 BCA 法測定蛋白濃度，根據定量結果，每個樣本取 20 μg 上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜后分次孵育抗 3*flag 抗體、GSTM5 抗體。
1.2.7 細胞爬片制作、共聚焦顯微鏡檢測 3 株穩轉株及正常 16HBE 分別傳代后制作細胞爬片，傳代后 24 h 更換含 TNF-α（10 ng/mL）不含血清 DMEM 培養基，0.5 h 后固定細胞，孵育抗 3*flag-FITC 熒光抗體（ab106221），萊卡共聚焦顯微鏡觀察 GSTM5 核轉位。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（ ） 表示。數據均進行方差齊性檢驗，組間均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊時多重比較采用 LSD 檢驗法，方差不齊時多重比較采用 Dunnett′s T3 檢驗法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般情況
成功構建表達 GSTM5 慢病毒表達載體。結果見圖 1。以核酸內切酶雙酶切載體 PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C ，凝膠電泳后均呈現 2 條條帶。結果見圖 2。
圖1
GSTM5 慢病毒表達載體結構圖
圖2
經核酸內切酶雙酶切 GSTM5 慢病毒表達載體凝膠電泳圖
2.2 RT-qPCR 檢測
A、B、C、D 組細胞株中 GSTM5 基因表達水平檢測結果顯示，與 16HBE-SBP-3*flag、16HBE 相比較，16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 細胞中，GSTM5-mRNA 表達水平顯著上升（P<0.01），而 GSTM5 表達水平在 16HBE-SBP-3*flag 和 16HBE 細胞中的差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 3。
圖3
RT-qPCR 檢測 GSTM5-mRNA 表達變化
2.3 16HBE-GSTM5 穩轉株中 GSTM5 蛋白表達水平分析
Western blot 檢測結果顯示，經灰度值分析，四組細胞的 GSTM5 相對表達量分別為 0.056 9、0.049、0.483 7、0.601。穩轉株 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 細胞中，GSTM5 蛋白表達水平顯著高于 16HBE、16HBE-SBP-3*flag。而后兩者之間 GSTM5 表達無明顯差異。結果見圖 4。
圖4
16HBE-GSTM5 穩轉株 GSTM5 蛋白表達水平分析
2.4 共聚焦顯微鏡檢測
GSTM5 的人支氣管上皮細胞株 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C，及空載體細胞株 16HBE-SBP-3*flag 的細胞爬片，經共聚焦顯微鏡觀察，所有細胞呈現綠色熒光，表明慢病毒介導的 GSTM5-3*flag 基因都已整合于全部 16HBE 細胞中。16HBE-SBP-3*flag 細胞株核內外均較強綠色熒光表達，而另外兩組核內無綠色熒光。經 TNF-α 刺激后，相比 16HBE-3*flag-SBP-GSTM5，16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N 細胞株核內綠色熒光表達較強，GSTM5 核轉位較多，其中箭頭所指細胞為典型的核內有綠色熒光細胞，代表 GSTM5-3*flag/3*flag 核轉位。結果見圖 5。
圖5
GSTM5 表達及核轉位熒光共聚焦顯微鏡檢測像
3 討論
急性肺損傷（ALI）的病理生理過程是炎癥反應與氧化應激過度激活的過程，而且炎癥反應與氧化應激密切相關[5]。炎癥失衡誘發了氧化相關基因的過度表達及活性氧過量生成，繼發氧化應激損傷，加重了肺結構細胞凋亡[2, 6]。在探討 TNF-α 誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 1 （NADPH oxidase 1，Nox1）基因轉錄調控過程中，發現 TNF-α 刺激后，肺泡Ⅱ型上皮細胞內 Nox 家族及 ROS 表達明顯上調[4]，同時 GSTM5 表達上調，并從胞漿轉移入胞核，與 Nox1 啟動子結合[7]。GSTM5 屬于 GST 家族，具有催化氧化還原反應的活性[3]，我們前期研究也證實 GSTM5 能影響 P38、NF-κB 等激酶活化，參與細胞炎癥反應、凋亡等生理過程的調節[8]。我們推測，在 ALI 的發生、發展過程中，GSTM5 對炎癥反應及其繼發的氧化應激過程有具有調控作用，其機制與 Nox 基因表達密切相關。GSTM5 對氧化應激的調控需要其發生核轉位，但 GSTM5 沒有經典的核定位信號（nuclear localization signal，NLS），第一種解釋是 GSTM5 可能與其他有 NLS 的分子發生相互作用后核轉位，第二種是 GSTM5 含有非經典的 NLS。其是否能在炎癥刺激誘導下入核（核轉位），是研究其非酶學（轉錄）活性的關鍵。
為了使 GSTM5 基因能夠在 16HBE 細胞核中穩定表達，本實驗構建慢病毒介導的穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株。相比其他方法，慢病毒感染因具有隨機整合到細胞基因組的特性，細胞株的建立更容易，熒光素酶基因的表達更穩定[9]，還能確保攜帶的外源基因不發生改變。慢病毒另一優點是可以同時感染有分裂能力細胞和無分裂能力細胞，是基因治療載體的理想方案[10]，保證了其在多種細胞中的應用。本研究所構建的穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株，經酶切、RT-qPCR、Western bolt 驗證，從基因、蛋白方面均證明穩轉株構建成功，可用于下一步研究 GSTM5 結構、功能、相互作用蛋白等實驗。另外，所構建的載體中有 SBP、3*flag 標簽，可用于后續的串聯親和純化-質譜 TAP-MS，以便分析 GSTM5 的相互作用蛋白，為探究其功能提供基礎。
本實驗構建慢病毒介導的穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株，經 TNF-α 刺激誘導后，熒光共聚焦顯微鏡顯示 C、D 兩組細胞株所表達的 GSTM5 都有不同程度的入核。當標簽位于 GSTM5 的 C 端（N 端游離）時（C 組 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N），其核內熒光強度較另一個穩轉株（D 組 16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C）大，提示 GSTM5 的核轉位與 N 端結構域密切相關。當標簽位于 GSTM5 的 N 端時入核減少，可能與 GSTM5 的 N 端序列被標簽封閉相關。Kawakatsu 等[11]發現 GSTπ 的線粒體定位序列與其 N 端相關，其 195～208aa 則對其核定位有重要作用，并證實其為一種非經典 NLS。經搜索 expasy 等數據庫表明，GSTM5 分 N 端和 C 端結構域，分別是 1～88aa 和 90～207aa。我們推測，GSTM5 的 N 端結構域含有非經典 NLS，對其核轉位有重要作用。在后續研究中，本課題組將分別構建 GV230-GSTM5 1～88aa-GFP 及 GV230-GSTM5 90～207aa-GFP 載體，進一步研究這兩個結構域對 GSTM5 的核轉位影響。此外，免疫熒光實驗顯示，在 TNF-α 刺激誘導前后對照組細胞株（B 組 16HBE-SBP-3*flag）核內外均有較強綠色熒光表達，可能與 SBP、3*flag 標簽分子量小，可自由彌散進入細胞核相關。
綜上所述，本研究成功建立了慢病毒介導的穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株，同時證實在 TNF-α 誘導的炎癥過程中 GSTM5 存在核轉位，并與其 N 端含有非經典 NLS 密切相關。本研究為后續 ALI 炎癥氧化失衡導致的肺結構細胞損傷調控機制的研究奠定基礎。
急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome， ARDS）是一個具有復雜病理和發病機制的危重癥臨床綜合征，其本質是肺部過度失控的炎癥反應[1]。過度炎癥反應引發氧化應激狀態，誘導細胞內源性活性氧（reactive oxygen species，ROS）的生成量劇增，超過機體抗氧化系統的清除能力，使機體處于進行性加重的氧化應激狀態，導致肺結構細胞損傷[2]。谷胱甘肽 S 轉移酶（glutathione-S-transferase，GST）與谷胱甘肽結合，是具有多種功能的催化氧化還原反應的酶超家族，與其他抗氧化酶在細胞內共同起到清除活性氧，保護細胞免受氧化損傷的作用[3]。谷胱甘肽 S 轉移酶 mu 5（GSTM5）是 GST 家族的成員。本研究小組前期對炎癥誘發的氧化應激調控的研究發現，腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）可誘導人氣道上皮細胞 16HBE 細胞 NOX1 轉錄及表達明顯上調[4]。GSTM5 這種酶活性以外的生理功能激起了我們的興趣。本研究擬構建人 GSTM5 基因的慢病毒表達載體及穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株，并觀察 TNF-α 刺激模擬的細胞炎癥狀態下 GSTM5 核轉位情況，為后續研究 GSTM5 的轉錄調控功能奠定基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
16HBE、293T 細胞、Stbl3 菌種由廣州軍區總醫院醫學實驗科細胞庫提供；北美胎牛血清、DMEM 高糖培養基、胰酶、谷氨酰胺（Gln）購于 Gibico 公司；重組人 TNF-α 購自美國 Pepro Tech 公司；BCA 法蛋白濃度測定試劑盒、逆轉錄試劑、PCR、Real-time qPCR 相關試劑購自 TaKaRa 公司；引物由上海英濰捷基公司合成。慢病毒系統（含表達載體 plvx-puro-3*flag-SBP、plvx-puro-MCS-SBP-3*flag 和 2 種包裝質粒 psPAX2、Pmd2.G、慢病毒包裝專用促轉染試劑 FItran 購于輝駿生物；限制性內切酶 BamHI 與 XbaI、EcoRI、NotI、T4 DNA 連接酶購自 Thermo Scientific 公司；ClonExpress II One Step Cloning Kit 連接酶購自諾唯贊公司；質粒提取和凝膠回收試劑盒為 Qiagen 公司產品。Trizol 試劑、轉染試劑 Lipofectamine 2000 和嘌呤霉素購自 Invitrogen 公司；ECL 熒光底物試劑盒購自美國 Pierce 公司。抗 3*flag-FITC 熒光抗體（ab106221）、抗 GSTM5 抗體（ab112918）購自 Abcam。
重組慢病毒載體分組：c：PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、d：PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C。穩定轉染細胞株（穩轉株）分組：A：16HBE；B：16HBE-SBP-3*flag；C：16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N；D：16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C。
1.2 方法
1.2.1 重組慢病毒表達質粒 PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C 及慢病毒制備：根據 GSTM5（NM_000851）基因序列設計引物，序列見表 1，以 16HBE 總 RNA 為模板，使用 PrimeSTAR 高保真酶擴增 GSTM5 基因片段。使用微量瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收 PCR 產物。空載體 PLVX-puro-MCS-SBP-3*flag 與引物 GSTM5-F2、R2 的 PCR 中的目的基因片段條帶和酶切后的載體條帶，回收純化，用 T4 DNA 連接酶連接載體和目的基因片段，以得到重組慢病毒載體 c：PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N。
空載體 PLVX-puro-3*flag-SBP 與引物 GSTM5-F、R 的 PCR 產物進行雙酶切（BamHI 與 XbaI）后使用 ClonExpress II One Step Cloning Kit 無縫連接以得到重組慢病毒載體 d：PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C。將 10 μl 連接產物加入至 100 μl Stbl3 感受態細胞（氯化鈣法制備）中完成連接產物的轉化。將菌液均勻涂布于含氨芐青霉素（100 μg/ml）的 LB 平板上，24 h 后，挑取數個菌落，PCR 檢測目的基因表達。取 10 μl PCR 產物點樣到 1% 凝膠電泳，對照 Marker 大小，選取正確的菌落搖菌，測序。并以雙酶切（XhoII、SpeI、EcoRI、BamHI）鑒定所構建的 2 個載體。
表1
引物序列
1.2.2 慢病毒包裝 293T 細胞在含 10% 滅活胎牛血清的 DMEM 培養基中，置于培養箱 37 ℃，5% CO 2 培養。待細胞生長成均勻單層細胞并達 90% 以上聚集度時傳代接種于 10 cm 細胞培養皿，5×106/皿（總共 10 ml 完全培養基）。24 h 后待細胞密度達 70%～80% 時即可用于分盤到 150 mm 細胞培養盤。包裝當天，即分皿 24 h 后，給 293T 細胞換上 20 ml 無抗培養基 DMEM+10% FBS+4 mmol/L Gln，37 ℃、5% CO 2 培養箱培養 2 h。27 μg 的慢病毒質粒和 2 個輔助質粒加入 1 ml 的生理鹽水中輕柔顛倒混合，靜止 5 min 后并加入質粒 2.5～3 倍轉染試劑 Polyethylenimine，室溫靜置孵育 20 min 后緩慢均勻滴入 150 mm 培養皿中，適當搖勻；此時記為轉染開始時間。轉染 4～6 h 后換液，吸取適量 PBS 輕輕漂洗細胞 1～2 次，換上培養基 DMEM+10% FBS+4 mmol/L Gln+1% 青鏈霉素。
1.2.3 病毒收集 轉染后 48 h 和 72 h 分別收集上清，1 000 r/min 離心 5 min，取上清用 0.45 μm 微孔濾器過濾。4 ℃，25 000 g 超高速冷凍離心機高速離心 2 h，棄上清，病毒沉淀用 1 ml PBS 充分溶解，分裝為 100 μl/管。滴度測定后 –80 ℃ 冰箱保存。切勿反復凍融，每次凍融大約有 10% 的損失。48 h 收集的上清可先置于 4 ℃ 冰箱保存。
1.2.4 16HBE-GSTM5 穩轉株感染、篩選 16HBE 細胞傳代，取 5×106 /孔的密度接種至 6 孔板，接種 4 個孔待 16HBE 細胞貼壁匯合度為 40%～50% 后進行感染；感染前，每孔細胞換成無雙抗 1 000 μl 新鮮的 DMEM 完全培養基（含10 μg/ml polybrene），提高逆轉錄病毒感染細胞的效率，放置于培養箱孵育 1 h。取 2 孔細胞分別加入上述制備的 2 種 GSTM5 慢病毒上清液 1 000 μl，第 3 孔細胞加 1 000 μl 的空載慢病毒上清液，第 4 孔做空白細胞對照，充分的搖勻后放入 37 ℃、5% CO 2、95% 相對濕度的培養箱中培養。感染 6 h 后換成新鮮的 DMEM 完全培養基+1% 青鏈霉素，待細胞生長至 80% 融合度時，加入 1 μl 的 Puromycin（終濃度 4 μg/ml）進行藥篩。每天更換含 Puromycin（2 μg/ml）完全培養基，直至空白細胞全部凋亡。每次更換細胞培養基均需要加入原藥物濃度的一半來維持細胞生長，即 Puromycin 的終濃度為 2 μg/ml。擴增培養后液氮凍存。至此，篩選得到穩轉株 B：16HBE-SBP-3*flag，C：16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，D：16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 。
1.2.5 RT-qPCR 檢測 GSTM5 基因表達水平 取上述 3 株細胞及正常 16HBE 細胞鋪板后按 life technology 公司提供的 Triozol 使用說明抽提 RNA，紫外分光光度計測定 RNA 濃度后去基因組 DNA，逆轉錄合成 cDNA。采用 RT-qPCR 兩步法定量分析各組細胞 GSTM5 基因 mRNA 表達水平，引物序列見表 2。反應條件：反應條件：預變性 95 ℃ 3 min；變性 95 ℃ 10 s、退火 60 ℃ 34 s、延伸 72 ℃ 30 s，共進行 45 個循環。循環結束后從 60 ℃ 升高到 98 ℃ 獲取熔解曲線。結果采用公式：–?CT=–[Mean（檢測基因 CT 值）–Mean（內參基因 CT 值）]，–??CT=–（GSTM5 組 ?CT–對照組 ?CT），相對表達量 RQ=2–??CT。
表2
RT-qPCR 引物
1.2.6 Western blot 驗證 3 株穩轉株及正常 16HBE 分別提蛋白后用 BCA 法測定蛋白濃度，根據定量結果，每個樣本取 20 μg 上樣，SDS-PAGE 凝膠電泳，轉膜后分次孵育抗 3*flag 抗體、GSTM5 抗體。
1.2.7 細胞爬片制作、共聚焦顯微鏡檢測 3 株穩轉株及正常 16HBE 分別傳代后制作細胞爬片，傳代后 24 h 更換含 TNF-α（10 ng/mL）不含血清 DMEM 培養基，0.5 h 后固定細胞，孵育抗 3*flag-FITC 熒光抗體（ab106221），萊卡共聚焦顯微鏡觀察 GSTM5 核轉位。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 20.0 軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差（ ） 表示。數據均進行方差齊性檢驗，組間均數比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。方差齊時多重比較采用 LSD 檢驗法，方差不齊時多重比較采用 Dunnett′s T3 檢驗法。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 一般情況
成功構建表達 GSTM5 慢病毒表達載體。結果見圖 1。以核酸內切酶雙酶切載體 PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C ，凝膠電泳后均呈現 2 條條帶。結果見圖 2。
圖1
GSTM5 慢病毒表達載體結構圖
圖2
經核酸內切酶雙酶切 GSTM5 慢病毒表達載體凝膠電泳圖
2.2 RT-qPCR 檢測
A、B、C、D 組細胞株中 GSTM5 基因表達水平檢測結果顯示，與 16HBE-SBP-3*flag、16HBE 相比較，16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 細胞中，GSTM5-mRNA 表達水平顯著上升（P<0.01），而 GSTM5 表達水平在 16HBE-SBP-3*flag 和 16HBE 細胞中的差異無統計學意義（P>0.05）。結果見圖 3。
圖3
RT-qPCR 檢測 GSTM5-mRNA 表達變化
2.3 16HBE-GSTM5 穩轉株中 GSTM5 蛋白表達水平分析
Western blot 檢測結果顯示，經灰度值分析，四組細胞的 GSTM5 相對表達量分別為 0.056 9、0.049、0.483 7、0.601。穩轉株 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C 細胞中，GSTM5 蛋白表達水平顯著高于 16HBE、16HBE-SBP-3*flag。而后兩者之間 GSTM5 表達無明顯差異。結果見圖 4。
圖4
16HBE-GSTM5 穩轉株 GSTM5 蛋白表達水平分析
2.4 共聚焦顯微鏡檢測
GSTM5 的人支氣管上皮細胞株 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N，16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C，及空載體細胞株 16HBE-SBP-3*flag 的細胞爬片，經共聚焦顯微鏡觀察，所有細胞呈現綠色熒光，表明慢病毒介導的 GSTM5-3*flag 基因都已整合于全部 16HBE 細胞中。16HBE-SBP-3*flag 細胞株核內外均較強綠色熒光表達，而另外兩組核內無綠色熒光。經 TNF-α 刺激后，相比 16HBE-3*flag-SBP-GSTM5，16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N 細胞株核內綠色熒光表達較強，GSTM5 核轉位較多，其中箭頭所指細胞為典型的核內有綠色熒光細胞，代表 GSTM5-3*flag/3*flag 核轉位。結果見圖 5。
圖5
GSTM5 表達及核轉位熒光共聚焦顯微鏡檢測像
3 討論
急性肺損傷（ALI）的病理生理過程是炎癥反應與氧化應激過度激活的過程，而且炎癥反應與氧化應激密切相關[5]。炎癥失衡誘發了氧化相關基因的過度表達及活性氧過量生成，繼發氧化應激損傷，加重了肺結構細胞凋亡[2, 6]。在探討 TNF-α 誘導肺泡Ⅱ型上皮細胞的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 1 （NADPH oxidase 1，Nox1）基因轉錄調控過程中，發現 TNF-α 刺激后，肺泡Ⅱ型上皮細胞內 Nox 家族及 ROS 表達明顯上調[4]，同時 GSTM5 表達上調，并從胞漿轉移入胞核，與 Nox1 啟動子結合[7]。GSTM5 屬于 GST 家族，具有催化氧化還原反應的活性[3]，我們前期研究也證實 GSTM5 能影響 P38、NF-κB 等激酶活化，參與細胞炎癥反應、凋亡等生理過程的調節[8]。我們推測，在 ALI 的發生、發展過程中，GSTM5 對炎癥反應及其繼發的氧化應激過程有具有調控作用，其機制與 Nox 基因表達密切相關。GSTM5 對氧化應激的調控需要其發生核轉位，但 GSTM5 沒有經典的核定位信號（nuclear localization signal，NLS），第一種解釋是 GSTM5 可能與其他有 NLS 的分子發生相互作用后核轉位，第二種是 GSTM5 含有非經典的 NLS。其是否能在炎癥刺激誘導下入核（核轉位），是研究其非酶學（轉錄）活性的關鍵。
為了使 GSTM5 基因能夠在 16HBE 細胞核中穩定表達，本實驗構建慢病毒介導的穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株。相比其他方法，慢病毒感染因具有隨機整合到細胞基因組的特性，細胞株的建立更容易，熒光素酶基因的表達更穩定[9]，還能確保攜帶的外源基因不發生改變。慢病毒另一優點是可以同時感染有分裂能力細胞和無分裂能力細胞，是基因治療載體的理想方案[10]，保證了其在多種細胞中的應用。本研究所構建的穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株，經酶切、RT-qPCR、Western bolt 驗證，從基因、蛋白方面均證明穩轉株構建成功，可用于下一步研究 GSTM5 結構、功能、相互作用蛋白等實驗。另外，所構建的載體中有 SBP、3*flag 標簽，可用于后續的串聯親和純化-質譜 TAP-MS，以便分析 GSTM5 的相互作用蛋白，為探究其功能提供基礎。
本實驗構建慢病毒介導的穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株，經 TNF-α 刺激誘導后，熒光共聚焦顯微鏡顯示 C、D 兩組細胞株所表達的 GSTM5 都有不同程度的入核。當標簽位于 GSTM5 的 C 端（N 端游離）時（C 組 16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N），其核內熒光強度較另一個穩轉株（D 組 16HBE-3*flag-SBP-GSTM5-C）大，提示 GSTM5 的核轉位與 N 端結構域密切相關。當標簽位于 GSTM5 的 N 端時入核減少，可能與 GSTM5 的 N 端序列被標簽封閉相關。Kawakatsu 等[11]發現 GSTπ 的線粒體定位序列與其 N 端相關，其 195～208aa 則對其核定位有重要作用，并證實其為一種非經典 NLS。經搜索 expasy 等數據庫表明，GSTM5 分 N 端和 C 端結構域，分別是 1～88aa 和 90～207aa。我們推測，GSTM5 的 N 端結構域含有非經典 NLS，對其核轉位有重要作用。在后續研究中，本課題組將分別構建 GV230-GSTM5 1～88aa-GFP 及 GV230-GSTM5 90～207aa-GFP 載體，進一步研究這兩個結構域對 GSTM5 的核轉位影響。此外，免疫熒光實驗顯示，在 TNF-α 刺激誘導前后對照組細胞株（B 組 16HBE-SBP-3*flag）核內外均有較強綠色熒光表達，可能與 SBP、3*flag 標簽分子量小，可自由彌散進入細胞核相關。
綜上所述，本研究成功建立了慢病毒介導的穩定表達 GSTM5 的人支氣管上皮細胞株，同時證實在 TNF-α 誘導的炎癥過程中 GSTM5 存在核轉位，并與其 N 端含有非經典 NLS 密切相關。本研究為后續 ALI 炎癥氧化失衡導致的肺結構細胞損傷調控機制的研究奠定基礎。
