引用本文： 朱芳芳, 曹歡, 何光珍, 王譯民, 陳毅斐, 楊炯, 高亞東. 乙酰輔酶 A 羧化酶調控 Th17 細胞分化參與哮喘氣道炎癥. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(5): 500-504. doi: 10.7507/1671-6205.201703001 復制
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是臨床上常見的，以氣道炎癥和氣道高反應性為特征的一種異質性疾病，目前其發病率有逐年遞增的趨勢[1]。氣道炎癥是哮喘的重要特征，糖皮質激素是應用最普遍的控制氣道炎癥的藥物，但不同類型的氣道炎癥對糖皮質激素治療的反應效果不一，因此仍有許多哮喘患者對糖皮質激素治療不敏感[2-3]。多數研究者認為 Th1/Th2 細胞反應失衡、Th2 細胞優勢應答是哮喘氣道炎癥的重要機制[1]，而近年來的研究發現 Th17 細胞及其分泌的細胞因子 IL-17 亦在哮喘氣道炎癥中發揮了重要作用，且重度哮喘的氣道炎癥更傾向于 Th17 細胞介導的中性粒細胞性炎癥[4-5]。
Th17 細胞是一類可分泌 IL-17A（一般所說的 IL-17 即指 IL-17A）、IL-17F 和 IL-22 的 CD4+ T 細胞亞群，與許多炎癥反應及自身免疫性疾病的發生發展有關。IL-17 可刺激骨髓基質細胞產生粒細胞集落刺激因子，促進上皮細胞、肺成纖維細胞和其他炎癥細胞分泌促炎性細胞因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶，從而動員、募集并活化中性粒細胞，介導中性粒細胞性炎癥[6]。體外細胞實驗[6]、動物活體實驗[7]及臨床試驗[8-9]均表明 IL-17 與哮喘氣道炎癥、氣道高反應性及哮喘嚴重程度相關，調節 Treg 細胞/Th17細胞平衡可降低哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑[10-12]。
脂肪酸作為體內三大營養物質之一，其代謝狀態可影響免疫細胞的活化、增殖和分化等過程。乙酰輔酶 A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）在脂肪酸代謝過程中起著重要作用，可以催化乙酰輔酶 A 生成丙二酰輔酶 A。最新研究顯示 ACC 催化的脂肪酸代謝是 Th17 細胞分化的關鍵代謝檢驗點，ACC 特異性抑制劑 TOFA 可明顯抑制初始 CD4+ T 細胞向 Th17 細胞的分化，降低 IL-17 及其他 Th17 細胞相關基因的表達，下調 Th17 細胞終端分化相關的白細胞介素-23（IL-23）受體，并可促進 Treg 細胞分化[13]。截至目前，ACC 在哮喘發病中的作用尚不明確，本研究擬探討 ACC 對 Th17 細胞分化的調控在急性哮喘小鼠模型發病機制中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及材料
6～8 周齡（體重約為 20 g）SPF 級健康 C57BL/6 雌性小鼠 24 只，由湖北省疾病預防控制中心提供，武漢大學動物實驗中心寄養，已經過動物倫理委員會許可。主要試劑包括卵清蛋白（OVA，Grade V，Sigma-Aldrich 公司，美國），注射用氫氧化鋁凝膠（ImjectTM Alum Adjuvant，Thermo Fisher Scientific 公司，美國），特異性 ACC 抑制劑 TOFA（Sigma-Aldrich 公司，美國），小鼠血清總 IgE ELISA 試劑盒（Mouse IgE ELISA Ready-SET-Go! Affymetrix eBioscience 公司，美國），Anti-Mouse CD4 PE-Cyanine7，Anti-Mouse IL-17A PE（Affymetrix eBioscience 公司，美國），佛波酯（PMA，Tocris Bioscience 公司，英國），離子霉素（Ionomycin，Tocris Bioscience 公司，英國），Brefeldin A Solution（BFA，Biolegend 公司，美國），RPMI-1640 培養基（HyCloneTM 公司，美國），胎牛血清（HyCloneTM 公司，美國），青-鏈霉素溶液（吉諾生物醫藥技術有限公司，中國），Ⅰ型膠原酶（Biosharp 公司，美國），紅細胞裂解液（BioFlux 公司，日本），固定劑，破膜劑（Affymetrix eBioscience 公司，美國）。
1.2 方法
1.2.1 急性哮喘小鼠模型的建立和分組 將 24 只小鼠隨機分為正常對照組、哮喘組、DMSO 對照組和 ACC 抑制劑組，每組 6 只。哮喘組、DMSO 對照組及 ACC 抑制劑組小鼠均于第 0、14 d 腹腔注射 200 μl OVA-氫氧化鋁凝膠混懸液（含 20 μg OVA、50 μl 氫氧化鋁凝膠）；于第 21、22、23 d 予以 1% 戊巴比妥鈉 0.12 ml 腹腔注射麻醉后，給予 50 μl 激發液（含 OVA 100 μg）滴鼻，正常對照組致敏、激發均以等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）替代。其中 ACC 抑制劑組每周 2 次給予腹腔注射 200 μl TOFA 溶液（先以 DMSO 溶解成 50 mmol/L，后以 PBS 稀釋成 0.5 mmol/L），DMSO 對照組對應給予等濃度 DMSO 溶液處理。具體造模流程見圖 1。
圖1
急性哮喘小鼠模型制作流程
1.2.2 標本收集 末次激發 24 h 后，腹腔注射 0.12 ml 1% 戊巴比妥鈉麻醉小鼠，摘除眼球取血，4 ℃ 條件下靜置 7 h 后置于低溫離心機中，3 000 r/min，4 ℃ 離心 15 min，收集上清于 –80 ℃ 保存待測。取血后，開胸，取左肺組織于 4% 多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋切片，用于 HE 染色。取右肺組織及脾組織于 RPMI-1640 培養基中，用于流式細胞術。
1.2.3 肺組織病理學檢測 小鼠肺組織經多聚甲醛固定 24 h 后，梯度酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟包埋，將包埋好的蠟塊置于切片機上切成 5 μm 厚薄片，二甲苯脫蠟后行 HE 染色，染色后切片經純酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，于顯微鏡（Olympus，DP80）下觀察各組小鼠肺組織切片著色情況（即炎性細胞浸潤情況），每張切片選取 6 個高倍鏡視野（×200）結構比較完整的支氣管、血管進行拍照，根據支氣管周圍的炎性細胞浸潤情況對炎癥反應進行分級，從而定量分析炎癥反應[14]。
1.2.4 血清總 IgE 濃度檢測 根據 ELISA 試劑盒說明書步驟，96 孔板（Corning Costar 9018）中加入捕獲抗體 100 μl/孔，密封，4 ℃ 孵育 12 h 后，棄去孔中液體，Wash Buffer（含 0.05% Tween-20 的去離子水）洗滌 2 次。加 Blocking Buffer 250 μl/孔，室溫放置 2 h，棄去孔中液體，Wash Buffer 洗滌 2 次。設標準品孔、樣品孔及空白孔，分別加樣，密封，室溫孵育 2 h 后，棄去孔中液體，Wash Buffer 洗滌 4 次。加檢測抗體 100 μl/孔，密封，室溫孵育 1 h，棄去孔中液體，Wash Buffer 洗滌 4 次。繼而加入 Streptavidin-HRP 100 μl/孔，密封，室溫避光孵育 30 min，棄去孔中液體，Wash Buffer 洗滌 4 次。加入底物液（TMB）100 μl/孔，密封，室溫下避光顯色 15 min。最后每孔加入 100 μl 終止液，450 nm 及 570 nm 波長檢測各孔的光密度值。
1.2.5 肺組織中 Th17 細胞檢測 右肺組織經 RPMI-1640 培養基（含 5% 青-鏈霉素溶液）洗滌后，轉移至Ⅰ型膠原酶（1×）中充分剪碎、消化，經 200 目濾網過濾，室溫下 1 500 r/min，離心 7 min，棄上清，紅細胞裂解液去除紅細胞，獲得肺組織單個核細胞懸液。上述肺組織單個核細胞懸液離心后棄上清，以 1 ml 完全培養基（含 10% 胎牛血清及 1% 青-鏈霉素溶液的 RPMI-1640 溶液）重懸，取 10 μl 加于血細胞計數板上，計算單個核細胞總數，并于六孔板中調節單個核細胞懸液的細胞濃度為 2×106/ml，總體積 2 ml，繼而每孔加入 5 μl PMA（50 ng/ml），1 μl 離子霉素（Ionomycin，1 μg/μl），輕輕混勻后，37 ℃，5% CO 2 條件下刺激培養 2 h，2 h 后每孔加入 2 μl BFA（5 mg/ml），輕輕混勻，繼續于 37 ℃，5% CO 2 條件下孵育 4 h。收集刺激后細胞，PBS 洗滌 1~2 遍，加表面抗體 Anti-Mouse CD4 PE-Cyanine7，渦旋混勻，4 ℃ 冰箱內避光孵育 40～60 min，加入 2 ml PBS 洗滌、離心后（室溫，1 500 r/min，7 min），棄上清，加 150 μl 固定劑，渦旋混勻，室溫下避光靜置 30 min。固定結束后，用新配制的 1×破膜劑洗滌 2 遍，離心（室溫，1 500 r/min，7 min），棄上清，加胞內抗體 Anti-Mouse IL-17A PE，渦旋混勻，室溫下避光靜置 50 min 后，用 1×破膜劑洗滌 1 遍，離心（室溫，1 500 r/min，7 min），棄上清，最后用 300 μl 1×破膜劑重懸，上機檢測。
1.3 統計學方法
本實驗為完全隨機設計，采用 SPSS 21.0 軟件進行統計學處理，所有數據均以均數±標準差（ ）表示，先對各組數據行正態檢驗及方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊者，多組數據均數比較行單因素方差分析，并采用 LSD 法進行兩兩比較；不符合正態分布或方差不齊者，多組數據間均數比較行非參數秩和檢驗，并先對檢驗水準 P 用 Bonferroni 法進行校正后再行非參數秩和檢驗的兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織炎性細胞浸潤情況
肺組織經 HE 染色，肺組織炎性細胞浸潤定量分析統計結果顯示，哮喘組（3.50±0.14）、DMSO 對照組（3.47±0.08）、ACC 抑制劑組（2.07±0.20）小鼠肺組織炎性細胞浸潤均較正常對照組（0.50±0.17）顯著增加（均P<0.001），DMSO 對照組與哮喘組之間差異無統計學意義（P>0.05），ACC 抑制劑組較哮喘組顯著下降（P<0.001）。結果見圖 2。
圖2
小鼠肺組織病理檢查像（HE ×200） a. 正常對照組； b. 哮喘組； c. DMSO 對照組； d. ACC 抑制劑組
2.2 血清總 IgE 濃度
ELISA 結果顯示，哮喘組[（5 680.40±831.40）ng/ml]、DMSO 對照組[（5 624.79±365.50）ng/ml]、ACC 抑制劑組[（2 028.95±134.60）ng/ml]小鼠血清總 IgE 濃度均較正常對照組[（400.52±57.13 ng/ml）]顯著升高（均P<0.008），且 DMSO 對照組與哮喘組差異無統計學意義（P>0.05），ACC 抑制劑組顯著低于哮喘組（P<0.008）。結果見圖 3。
圖3
小鼠血清總 IgE 濃度
2.3 肺組織中 Th17 細胞分化情況
流式細胞術結果顯示，哮喘組[（2.01±0.12）%]、DMSO 對照組[（1.95±0.16）%]、ACC 抑制劑組[（0.82±0.04）% ]小鼠肺組織中 Th17 細胞在 CD4+ T 細胞中所占的比例均較正常對照組[（0.59±0.03）% ]明顯增高（均P<0.008），DMSO 對照組與哮喘組比較差異無統計學意義（P>0.05），ACC 抑制劑組較哮喘組顯著降低（P<0.008）。結果見圖 4。
圖4
流式細胞術檢測小鼠肺組織中 Th17 細胞分化情況 a. 正常對照組； b. 哮喘組； c. DMSO 對照組； d. ACC 抑制劑組
3 討論
ACC 作為脂肪酸代謝的限速酶，主要功能是催化乙酰輔酶 A 生成丙二酰輔酶 A，調控脂肪酸從頭合成以及脂肪酸氧化，從而對各項生理病理活動發揮調節作用。目前已有兩種 ACC 亞型被發現，ACC1和 ACC2，二者分別在兩個獨立的細胞內區域發揮作用[15]。研究發現 ACC 調控的脂肪酸代謝對中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及 T 細胞等多種免疫細胞功能的發揮具有重要的調控作用[16-19]。對于 Th17 細胞而言，無論是使用 ACC 抑制劑（TOFA 或 Soraphen A）還是利用特異性 T 細胞 ACC 基因敲除小鼠模型，均可發現 ACC 對 Th17 細胞的分化及 IL-17 的分泌具有促進作用，并且 Soraphen A 以及特異性 T 細胞 ACC 基因敲除可明顯降低 Th17 細胞介導為主的自身免疫性疾病——實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的發病率、延緩疾病進展或減輕疾病嚴重程度[13, 20]。
既往研究提示 Th17 細胞與哮喘氣道炎癥、氣道高反應性及嚴重程度相關[6, 21-22]，我們前期的研究也證實過敏性哮喘患者外周血單個核細胞中的 Th17 細胞百分率以及 IL-17、IL-22、RORγt 水平均較非哮喘患者明顯增加，Th17 細胞免疫參與了哮喘的發生發展，特別是中性粒細胞浸潤為主的難治性哮喘[23]。這些患者多存在激素抵抗問題，治療效果差，尋找新的抗炎方法或靶點具有重要意義。鑒于上述 ACC 對 Th17 細胞分化的調控以及 Th17 細胞在哮喘發病中的作用，有必要研究 ACC 對 Th17 細胞分化的調控是否參與了哮喘的發病機制。
我們利用 ACC 的一種特異性抑制劑 TOFA 對急性哮喘小鼠模型進行干預，結果發現 TOFA 可明顯降低哮喘小鼠肺組織中 Th17 細胞百分率，且對哮喘小鼠肺組織炎性細胞浸潤、血清總 IgE 濃度均具有明顯的改善作用，而 DMSO 對照組小鼠肺組織中 Th17 細胞百分率、肺組織炎性細胞浸潤、血清總 IgE 濃度與哮喘組均無顯著差異，因此可以排除 TOFA 溶液中 DMSO 對哮喘的影響，上述改善作用均由TOFA 所致，提示 ACC 對 Th17 細胞分化的促進作用可能參與了哮喘的發病機制。但該結論仍需進一步驗證，如促進 ACC 表達或增加 ACC 活性是否可以增加 Th17 細胞百分比并促進哮喘小鼠肺組織炎性細胞浸潤，以及 ACC 活性降低或增加對哮喘小鼠氣道高反應性的影響等。若有可能，可利用特異性 T 細胞 ACC 基因敲除小鼠進一步驗證上述結論。
綜上所述，ACC 活性受抑制后能明顯降低肺組織中 Th17 細胞分化，并有效減輕肺組織炎性細胞浸潤和血清總 IgE 濃度，提示 ACC 通過促進 Th17 細胞的分化參與了哮喘的發病。
支氣管哮喘（簡稱哮喘）是臨床上常見的，以氣道炎癥和氣道高反應性為特征的一種異質性疾病，目前其發病率有逐年遞增的趨勢[1]。氣道炎癥是哮喘的重要特征，糖皮質激素是應用最普遍的控制氣道炎癥的藥物，但不同類型的氣道炎癥對糖皮質激素治療的反應效果不一，因此仍有許多哮喘患者對糖皮質激素治療不敏感[2-3]。多數研究者認為 Th1/Th2 細胞反應失衡、Th2 細胞優勢應答是哮喘氣道炎癥的重要機制[1]，而近年來的研究發現 Th17 細胞及其分泌的細胞因子 IL-17 亦在哮喘氣道炎癥中發揮了重要作用，且重度哮喘的氣道炎癥更傾向于 Th17 細胞介導的中性粒細胞性炎癥[4-5]。
Th17 細胞是一類可分泌 IL-17A（一般所說的 IL-17 即指 IL-17A）、IL-17F 和 IL-22 的 CD4+ T 細胞亞群，與許多炎癥反應及自身免疫性疾病的發生發展有關。IL-17 可刺激骨髓基質細胞產生粒細胞集落刺激因子，促進上皮細胞、肺成纖維細胞和其他炎癥細胞分泌促炎性細胞因子、趨化因子及基質金屬蛋白酶，從而動員、募集并活化中性粒細胞，介導中性粒細胞性炎癥[6]。體外細胞實驗[6]、動物活體實驗[7]及臨床試驗[8-9]均表明 IL-17 與哮喘氣道炎癥、氣道高反應性及哮喘嚴重程度相關，調節 Treg 細胞/Th17細胞平衡可降低哮喘小鼠氣道炎癥及氣道重塑[10-12]。
脂肪酸作為體內三大營養物質之一，其代謝狀態可影響免疫細胞的活化、增殖和分化等過程。乙酰輔酶 A 羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）在脂肪酸代謝過程中起著重要作用，可以催化乙酰輔酶 A 生成丙二酰輔酶 A。最新研究顯示 ACC 催化的脂肪酸代謝是 Th17 細胞分化的關鍵代謝檢驗點，ACC 特異性抑制劑 TOFA 可明顯抑制初始 CD4+ T 細胞向 Th17 細胞的分化，降低 IL-17 及其他 Th17 細胞相關基因的表達，下調 Th17 細胞終端分化相關的白細胞介素-23（IL-23）受體，并可促進 Treg 細胞分化[13]。截至目前，ACC 在哮喘發病中的作用尚不明確，本研究擬探討 ACC 對 Th17 細胞分化的調控在急性哮喘小鼠模型發病機制中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及材料
6～8 周齡（體重約為 20 g）SPF 級健康 C57BL/6 雌性小鼠 24 只，由湖北省疾病預防控制中心提供，武漢大學動物實驗中心寄養，已經過動物倫理委員會許可。主要試劑包括卵清蛋白（OVA，Grade V，Sigma-Aldrich 公司，美國），注射用氫氧化鋁凝膠（ImjectTM Alum Adjuvant，Thermo Fisher Scientific 公司，美國），特異性 ACC 抑制劑 TOFA（Sigma-Aldrich 公司，美國），小鼠血清總 IgE ELISA 試劑盒（Mouse IgE ELISA Ready-SET-Go! Affymetrix eBioscience 公司，美國），Anti-Mouse CD4 PE-Cyanine7，Anti-Mouse IL-17A PE（Affymetrix eBioscience 公司，美國），佛波酯（PMA，Tocris Bioscience 公司，英國），離子霉素（Ionomycin，Tocris Bioscience 公司，英國），Brefeldin A Solution（BFA，Biolegend 公司，美國），RPMI-1640 培養基（HyCloneTM 公司，美國），胎牛血清（HyCloneTM 公司，美國），青-鏈霉素溶液（吉諾生物醫藥技術有限公司，中國），Ⅰ型膠原酶（Biosharp 公司，美國），紅細胞裂解液（BioFlux 公司，日本），固定劑，破膜劑（Affymetrix eBioscience 公司，美國）。
1.2 方法
1.2.1 急性哮喘小鼠模型的建立和分組 將 24 只小鼠隨機分為正常對照組、哮喘組、DMSO 對照組和 ACC 抑制劑組，每組 6 只。哮喘組、DMSO 對照組及 ACC 抑制劑組小鼠均于第 0、14 d 腹腔注射 200 μl OVA-氫氧化鋁凝膠混懸液（含 20 μg OVA、50 μl 氫氧化鋁凝膠）；于第 21、22、23 d 予以 1% 戊巴比妥鈉 0.12 ml 腹腔注射麻醉后，給予 50 μl 激發液（含 OVA 100 μg）滴鼻，正常對照組致敏、激發均以等體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）替代。其中 ACC 抑制劑組每周 2 次給予腹腔注射 200 μl TOFA 溶液（先以 DMSO 溶解成 50 mmol/L，后以 PBS 稀釋成 0.5 mmol/L），DMSO 對照組對應給予等濃度 DMSO 溶液處理。具體造模流程見圖 1。
圖1
急性哮喘小鼠模型制作流程
1.2.2 標本收集 末次激發 24 h 后，腹腔注射 0.12 ml 1% 戊巴比妥鈉麻醉小鼠，摘除眼球取血，4 ℃ 條件下靜置 7 h 后置于低溫離心機中，3 000 r/min，4 ℃ 離心 15 min，收集上清于 –80 ℃ 保存待測。取血后，開胸，取左肺組織于 4% 多聚甲醛中固定過夜，石蠟包埋切片，用于 HE 染色。取右肺組織及脾組織于 RPMI-1640 培養基中，用于流式細胞術。
1.2.3 肺組織病理學檢測 小鼠肺組織經多聚甲醛固定 24 h 后，梯度酒精脫水，二甲苯透明后浸蠟包埋，將包埋好的蠟塊置于切片機上切成 5 μm 厚薄片，二甲苯脫蠟后行 HE 染色，染色后切片經純酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，于顯微鏡（Olympus，DP80）下觀察各組小鼠肺組織切片著色情況（即炎性細胞浸潤情況），每張切片選取 6 個高倍鏡視野（×200）結構比較完整的支氣管、血管進行拍照，根據支氣管周圍的炎性細胞浸潤情況對炎癥反應進行分級，從而定量分析炎癥反應[14]。
1.2.4 血清總 IgE 濃度檢測 根據 ELISA 試劑盒說明書步驟，96 孔板（Corning Costar 9018）中加入捕獲抗體 100 μl/孔，密封，4 ℃ 孵育 12 h 后，棄去孔中液體，Wash Buffer（含 0.05% Tween-20 的去離子水）洗滌 2 次。加 Blocking Buffer 250 μl/孔，室溫放置 2 h，棄去孔中液體，Wash Buffer 洗滌 2 次。設標準品孔、樣品孔及空白孔，分別加樣，密封，室溫孵育 2 h 后，棄去孔中液體，Wash Buffer 洗滌 4 次。加檢測抗體 100 μl/孔，密封，室溫孵育 1 h，棄去孔中液體，Wash Buffer 洗滌 4 次。繼而加入 Streptavidin-HRP 100 μl/孔，密封，室溫避光孵育 30 min，棄去孔中液體，Wash Buffer 洗滌 4 次。加入底物液（TMB）100 μl/孔，密封，室溫下避光顯色 15 min。最后每孔加入 100 μl 終止液，450 nm 及 570 nm 波長檢測各孔的光密度值。
1.2.5 肺組織中 Th17 細胞檢測 右肺組織經 RPMI-1640 培養基（含 5% 青-鏈霉素溶液）洗滌后，轉移至Ⅰ型膠原酶（1×）中充分剪碎、消化，經 200 目濾網過濾，室溫下 1 500 r/min，離心 7 min，棄上清，紅細胞裂解液去除紅細胞，獲得肺組織單個核細胞懸液。上述肺組織單個核細胞懸液離心后棄上清，以 1 ml 完全培養基（含 10% 胎牛血清及 1% 青-鏈霉素溶液的 RPMI-1640 溶液）重懸，取 10 μl 加于血細胞計數板上，計算單個核細胞總數，并于六孔板中調節單個核細胞懸液的細胞濃度為 2×106/ml，總體積 2 ml，繼而每孔加入 5 μl PMA（50 ng/ml），1 μl 離子霉素（Ionomycin，1 μg/μl），輕輕混勻后，37 ℃，5% CO 2 條件下刺激培養 2 h，2 h 后每孔加入 2 μl BFA（5 mg/ml），輕輕混勻，繼續于 37 ℃，5% CO 2 條件下孵育 4 h。收集刺激后細胞，PBS 洗滌 1~2 遍，加表面抗體 Anti-Mouse CD4 PE-Cyanine7，渦旋混勻，4 ℃ 冰箱內避光孵育 40～60 min，加入 2 ml PBS 洗滌、離心后（室溫，1 500 r/min，7 min），棄上清，加 150 μl 固定劑，渦旋混勻，室溫下避光靜置 30 min。固定結束后，用新配制的 1×破膜劑洗滌 2 遍，離心（室溫，1 500 r/min，7 min），棄上清，加胞內抗體 Anti-Mouse IL-17A PE，渦旋混勻，室溫下避光靜置 50 min 后，用 1×破膜劑洗滌 1 遍，離心（室溫，1 500 r/min，7 min），棄上清，最后用 300 μl 1×破膜劑重懸，上機檢測。
1.3 統計學方法
本實驗為完全隨機設計，采用 SPSS 21.0 軟件進行統計學處理，所有數據均以均數±標準差（ ）表示，先對各組數據行正態檢驗及方差齊性檢驗，符合正態分布且方差齊者，多組數據均數比較行單因素方差分析，并采用 LSD 法進行兩兩比較；不符合正態分布或方差不齊者，多組數據間均數比較行非參數秩和檢驗，并先對檢驗水準 P 用 Bonferroni 法進行校正后再行非參數秩和檢驗的兩兩比較。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 肺組織炎性細胞浸潤情況
肺組織經 HE 染色，肺組織炎性細胞浸潤定量分析統計結果顯示，哮喘組（3.50±0.14）、DMSO 對照組（3.47±0.08）、ACC 抑制劑組（2.07±0.20）小鼠肺組織炎性細胞浸潤均較正常對照組（0.50±0.17）顯著增加（均P<0.001），DMSO 對照組與哮喘組之間差異無統計學意義（P>0.05），ACC 抑制劑組較哮喘組顯著下降（P<0.001）。結果見圖 2。
圖2
小鼠肺組織病理檢查像（HE ×200） a. 正常對照組； b. 哮喘組； c. DMSO 對照組； d. ACC 抑制劑組
2.2 血清總 IgE 濃度
ELISA 結果顯示，哮喘組[（5 680.40±831.40）ng/ml]、DMSO 對照組[（5 624.79±365.50）ng/ml]、ACC 抑制劑組[（2 028.95±134.60）ng/ml]小鼠血清總 IgE 濃度均較正常對照組[（400.52±57.13 ng/ml）]顯著升高（均P<0.008），且 DMSO 對照組與哮喘組差異無統計學意義（P>0.05），ACC 抑制劑組顯著低于哮喘組（P<0.008）。結果見圖 3。
圖3
小鼠血清總 IgE 濃度
2.3 肺組織中 Th17 細胞分化情況
流式細胞術結果顯示，哮喘組[（2.01±0.12）%]、DMSO 對照組[（1.95±0.16）%]、ACC 抑制劑組[（0.82±0.04）% ]小鼠肺組織中 Th17 細胞在 CD4+ T 細胞中所占的比例均較正常對照組[（0.59±0.03）% ]明顯增高（均P<0.008），DMSO 對照組與哮喘組比較差異無統計學意義（P>0.05），ACC 抑制劑組較哮喘組顯著降低（P<0.008）。結果見圖 4。
圖4
流式細胞術檢測小鼠肺組織中 Th17 細胞分化情況 a. 正常對照組； b. 哮喘組； c. DMSO 對照組； d. ACC 抑制劑組
3 討論
ACC 作為脂肪酸代謝的限速酶，主要功能是催化乙酰輔酶 A 生成丙二酰輔酶 A，調控脂肪酸從頭合成以及脂肪酸氧化，從而對各項生理病理活動發揮調節作用。目前已有兩種 ACC 亞型被發現，ACC1和 ACC2，二者分別在兩個獨立的細胞內區域發揮作用[15]。研究發現 ACC 調控的脂肪酸代謝對中性粒細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞及 T 細胞等多種免疫細胞功能的發揮具有重要的調控作用[16-19]。對于 Th17 細胞而言，無論是使用 ACC 抑制劑（TOFA 或 Soraphen A）還是利用特異性 T 細胞 ACC 基因敲除小鼠模型，均可發現 ACC 對 Th17 細胞的分化及 IL-17 的分泌具有促進作用，并且 Soraphen A 以及特異性 T 細胞 ACC 基因敲除可明顯降低 Th17 細胞介導為主的自身免疫性疾病——實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）的發病率、延緩疾病進展或減輕疾病嚴重程度[13, 20]。
既往研究提示 Th17 細胞與哮喘氣道炎癥、氣道高反應性及嚴重程度相關[6, 21-22]，我們前期的研究也證實過敏性哮喘患者外周血單個核細胞中的 Th17 細胞百分率以及 IL-17、IL-22、RORγt 水平均較非哮喘患者明顯增加，Th17 細胞免疫參與了哮喘的發生發展，特別是中性粒細胞浸潤為主的難治性哮喘[23]。這些患者多存在激素抵抗問題，治療效果差，尋找新的抗炎方法或靶點具有重要意義。鑒于上述 ACC 對 Th17 細胞分化的調控以及 Th17 細胞在哮喘發病中的作用，有必要研究 ACC 對 Th17 細胞分化的調控是否參與了哮喘的發病機制。
我們利用 ACC 的一種特異性抑制劑 TOFA 對急性哮喘小鼠模型進行干預，結果發現 TOFA 可明顯降低哮喘小鼠肺組織中 Th17 細胞百分率，且對哮喘小鼠肺組織炎性細胞浸潤、血清總 IgE 濃度均具有明顯的改善作用，而 DMSO 對照組小鼠肺組織中 Th17 細胞百分率、肺組織炎性細胞浸潤、血清總 IgE 濃度與哮喘組均無顯著差異，因此可以排除 TOFA 溶液中 DMSO 對哮喘的影響，上述改善作用均由TOFA 所致，提示 ACC 對 Th17 細胞分化的促進作用可能參與了哮喘的發病機制。但該結論仍需進一步驗證，如促進 ACC 表達或增加 ACC 活性是否可以增加 Th17 細胞百分比并促進哮喘小鼠肺組織炎性細胞浸潤，以及 ACC 活性降低或增加對哮喘小鼠氣道高反應性的影響等。若有可能，可利用特異性 T 細胞 ACC 基因敲除小鼠進一步驗證上述結論。
綜上所述，ACC 活性受抑制后能明顯降低肺組織中 Th17 細胞分化，并有效減輕肺組織炎性細胞浸潤和血清總 IgE 濃度，提示 ACC 通過促進 Th17 細胞的分化參與了哮喘的發病。
