引用本文： 張秀麗, 余勤, 汪小亞, 李娟芝, 趙宏. CD73 在慢性間歇性低氧合并高脂飲食條件下大鼠心臟損傷中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(5): 478-483. doi: 10.7507/1671-6205.201702031 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndromes，OSAHS）是世界性的重大公共衛生問題，近年來其患病率逐漸升高，其中兒童患病率為 2%～3%，成年人的患病率為 2%～4%，肥胖及高脂肪飲食被認為是 OSAHS 發展的高危因素，其中肥胖兒童和青少年發病率高達 13%～59%，肥胖成人則超過了 40%[1-2]。
越來越多證據表明 OSAHS 與心血管疾病的發病率增加有關，但其確切機制尚未完全闡明。研究認為 OSAHS 患者夜間反復出現間斷缺氧與機體氧化應激水平上調、炎癥反應增加、免疫細胞活化等改變有關，其中升高的氧化應激水平與動脈粥樣硬化關系密切，炎癥介質的增加是冠心病發生的始動因素[3]。CD39 為膜外二三磷酸核苷水解酶，可將三磷酸腺苷水解為二磷酸腺苷和 5'-腺嘌呤核苷酸（5'-AMP）[4]。CD73 為胞外 5'-核苷酸酶，是一種通過糖基-磷脂酰肌醇錨定于質膜的糖蛋白，廣泛表達于肝臟、腎臟、心臟、血管平滑肌，在成纖維細胞、內皮細胞、淋巴細胞、神經膠質細胞、近端腎小管上皮細胞和腫瘤細胞等也有較高的表達[5]，可將 AMP 水解生成腺苷，從而參與調控機體多種生理和病理過程，包括抗炎、調節免疫及促進腫瘤細胞遷移等[6]。CD73 已被假設為能夠進行細胞外 AMP 水解的主要酶[7-8]。最近有研究證實，人類 CD39（hCD39）表達的上調能減少小鼠心肌缺血/再灌注（ I/R） 損傷后的梗死面積[9]。但是關于 OSAHS 患者心肌細胞 CD73 的表達情況及 CD73 在 OSAHS 相關的心肌損傷中的作用國內外幾乎沒有相關報道。本研究擬使用 Wistar 大鼠建立大鼠在間歇性低氧合并高脂飲食來模擬人類慢性間歇性低氧（CIH）模型，在周期性缺氧和復氧條件下通過免疫組化和蛋白印跡觀察 CD73 在大鼠心臟的分布和蛋白水平的表達情況，探討其在 CIH 并發心血管損害機制過程中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
24 只 SPF 級健康雄性 Wistar 大鼠，8 周齡，體重 180～220 g（甘肅中醫藥大學 SPF 級動物實驗室提供），置于溫度、濕度適中的實驗室內用同種普通干飼料喂養，實驗前飼養 1 周適應環境。然后按隨機數字表法分為 4 組，每組 6 只。分別為 A 組（常氧及普通飲食）、B 組（常氧及高脂飲食：3% 膽固醇，0.2% 丙基硫氧嘧啶，0.3% 膽酸鈉，10% 豬油，2% 蛋黃粉[2]）、C 組（間歇性低氧及普通飲食）、D 組（間歇性低氧及高脂飲食）。間歇性低氧箱裝置由密閉式大鼠飼養籠、CY-12C 型測氧儀、氮氣/氧氣儲氣瓶程控儀、電磁式空氣壓縮機和控制系統組成，控制系統包括減壓閥、流量計、電磁閥及數字顯示時間繼電器等。氮氣和氧氣由蘭州順豐氣站提供。
1.2 試劑與儀器
兔抗大鼠 CD73 抗體（Abcam，英國）；山羊抗兔二抗（中杉金橋試劑公司，中國）；ECL Western Blotting Substrate（Pierce，美國）；辣根過氧化物酶標記的二抗；細胞裂解液；高脂飼料，含豬油 10%，丙硫氧嘧啶 0.2%，白糖 7%，膽固醇 2%，膽酸鈉 0.5% 及普通飼料 80.3%。
1.3 模型建立
C 組與 D 組大鼠置于間歇低氧艙內，由進氣孔向艙內循環充入氮氣、氧氣和壓縮空氣，每循環 120 s：充入氮氣（純度 99.99%）30 s，靜息 10 s，充入氧氣 20 s，壓縮空氣 60 s。通過測氧儀監測，使每一循環艙內最低氧濃度達 6%～7%，后逐漸恢復至 21%。A 組與 B 組置于持續充入壓縮空氣的模擬艙內，氧濃度 21%。每天進行 8 h（9 時至 17 時）通氣，持續 42 d。實時監測 C 組和 D 組艙內的氧濃度并記錄。其余時間大鼠置于氧濃度 21% 的實驗室內飼養[10-12]。
1.4 取材
實驗 6 周后，禁食 12 h，于第 43 d 清晨稱重后以 10% 水合氯醛（3 ml）腹腔注射麻醉大鼠，經腹主動脈取血約 5 ml，離心檢測血液生化。在冰床上快速解剖分離大鼠左心室分成兩份，一份在多聚甲醛中固定 48 h，用于免疫組化檢測和 HE 病理檢查；另一份保存于 –80 ℃ 冰箱用于蛋白印跡測定。
1.5 檢測指標
1.5.1 體重和血脂水平測定 每日早晨 8 時對大鼠進行稱重并記錄。血清甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）由蘭州大學第一醫院使用標準的全自動生化分析儀（日立 7170A）進行測定。
1.5.2 組織病理學改變 取各組大鼠左心室，4% 中性多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，常規脫蠟，用于 HE 染色、免疫組化染色。免疫組織化學 SP 法染色，EDTA 修復，其余步驟按 SP 試劑盒說明書進行。兔抗大鼠多克隆抗體 CD73 用 PBS 1︰400 稀釋，用已知陽性片作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。DAB 顯色，常規脫水、透明、封片。在光學顯微鏡下觀察心肌細胞 CD73 的表達情況，應用 ImagePro Plus 6.0 圖像分析軟件對各組圖像陽性染色的平均吸光度值行定量分析。即隨機觀察各組切片，每組 6 張切片，每張切片 400 倍下隨機選取 10 個視野采集圖像，計算每個視野中陽性染色的平均吸光度值，以此分析和判斷各組心肌細胞 CD73 表達情況。
1.5.3 蛋白印跡 大鼠深度麻醉后，在冰盒上快速分離解剖大鼠心臟，取左心室在 –80 ℃ 冰箱保存，每組每份取相同質量組織用 RIPA 裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。用 BCA 法測定蛋白濃度，并將樣品濃度調成一致，100 ℃ 水浴 5 min 使樣品充分變性。等體積上樣進行經 15% SDS 凝膠電泳，隨后蛋白被轉移到 PVDF 膜上，用 TBST 配置的 5% 的脫脂奶粉搖床上將其封閉 2 h，TBST 洗 3 次后，于 1︰2 000 兔抗 CD73 多克隆抗體中 4 ℃ 孵育過夜。次日，TBST 洗 3 次后，用 1︰5 000 的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 二抗 37 ℃ 搖床孵育 1 h。ECL 法化學發光成像，掃描儀采集圖像后用 Image J 圖像分析軟件對各圖像灰度值進行分析測定。
1.6 統計學方法
應用 SPSS 22.0 軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差（ ）表示。組間比較用單因素方差分析（One Way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD），P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 血脂水平
四組大鼠血脂指標（TG 和 LDL-C）比較，差異均有統計學意義（F =18.786、12.672，P<0.05）。與 A 組比較，B、C、D 組的 TG 水平極顯著增加（P<0.01），B 組與 C 組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與 A 組比較，B 組的 LDL-C 水平顯著增加（P<0.05），C 組與 D 組極顯著增加（P<0.01）。結果見表 1、圖 1。
表1
四組大鼠血脂水平比較（n=6，
）
圖1
四組大鼠血脂水平比較
2.2 心肌組織 HE 染色結果
A 組心肌組織無異常（圖 2a）。B 組和 C 組心肌組織中可見部分肌纖維排列紊亂，局灶性變性壞死（圖 2b、2c）。D 組心肌細胞損傷明顯，可見肌纖維排列紊亂，縱橫紋不清，部分肌纖維溶解變性壞死（圖 2d）。
2.3 CD73 蛋白表達水平
在大鼠心肌中，CD73 主要分布于心肌細胞的胞漿和胞膜，以及血管內皮細胞和平滑肌細胞，呈棕色。A 組和 B 組與 C 組和 D 組相比，心肌細胞 CD73 染色較淺，其中 D 組染色最深（圖 2h）。與 A 組比較，B、C、D 組 CD73 蛋白表達水平均明顯升高（P<0.01）。與 B 組和 C 組相比較，D 組 CD73 蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。結果見表 2 及圖 3。
蛋白印跡檢測也顯示出一致的結果：與 A 組比較，B、C 組心肌 CD73 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。D 組 CD73 蛋白表達水平升高更為顯著（P<0.01），與 B 組和 C 組比較，D 組 CD73 蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。結果見表 2 及圖 4、5。
表2
四組大鼠心肌 CD73 蛋白表達水平比較（n=6，
）
圖3
大鼠心肌 CD73 免疫組化平均吸光度值比較
圖4
大鼠心肌 CD73 蛋白印跡蛋白表達比較
圖5
四組大鼠心肌細胞 CD73 蛋白印跡檢測像
3 討論
OSAHS 的患者常伴有肥胖和脂質代謝紊亂[13]。高脂血癥時在非脂肪組織中累積過量的游離脂肪酸可產生脂毒性，引起胸主動脈血管內皮損傷，誘導動脈粥樣硬化的形成；引起脂質毒性心肌病和非酒精性脂肪性肝炎等[2]。有研究認為 CIH 加高脂肪飲食的模型比簡單間歇性低氧模型更符合 OSAHS 的病理和生理特征[2]。本實驗通過對四組實驗動物血脂水平檢測發現，高脂組和間歇性低氧加高脂組的 TG 和 LDL-C 的水平均高于正常對照組，且間歇性低氧加高脂組血脂水平最高。同時，HE 染色發現，間歇性低氧并高脂飲食組心肌細胞損傷最為嚴重，可見肌纖維排列紊亂，縱橫紋不清，部分肌纖維明顯溶解。這與脂毒性損傷的特征一致，已有動物實驗顯示，當動物同時暴露于間歇性低氧和高脂肪飲食時，高脂血癥本身和其靶組織脂質的脂肪變性將進一步增加循環血液和靶組織的氧化應激水平[14-15]。
OSASH 和心血管疾病有密切的相關性，是心血管疾病的獨立危險因素，患者病情越嚴重，心血管疾病的發病率就越高[16]。OSASH 損傷心血管大致可以通過以下途徑。（1）心血管氧化應激：目前觀點認為夜間反復間斷缺氧-再氧合過程類似于心肌缺血再灌注過程中的缺血缺氧過程，可導致體內氧化應激水平升高，氧自由基（ROS）增多，ROS 及其過氧化產物作為第二信使啟動并激活氧化還原敏感轉錄因子核因子 κB（NF-κB），激活許多炎癥因子，大量的炎癥因子導致細胞結構和功能障礙的變化，導致全身炎癥損傷，特別是血管內皮功能障礙、動脈粥樣硬化和心血管疾病。（2）CIH 可以影響血液凝固：有研究表明，胸主動脈、心肌、毛細血管內可見大量活化的血小板，因此慢性血栓性疾病的形成可能是 OSAHS 導致心血管損傷的一種途徑[2, 17] 。其中，心血管氧化應激在 OSAHS 患者合并靶器官損害的病理生理過程中占重要地位[18-21]。有研究表明氧化應激是通過引起的線粒體功能障礙發揮主導作用[22-23]。最新研究表明，CD73 即胞外-5'-核苷酸酶，是一種通過糖基-磷脂酰肌醇錨定于質膜的糖蛋白，在缺血再灌注、抗炎、免疫調節等方面均有作用。一方面，ATP、ADP 在 CD39 的作用下轉化成 AMP 后，產生的 AMP 又在 CD73 的作用下轉化成腺苷[24-25]，腺苷通過激活腺苷受體進一步激活 PI3Kβ/Akt 通路[26]，磷酸化抑制 GSK-3，開放 ATP 敏感性鉀通道[27]，保護線粒體功能；另一方面，心肌過表達 CD39 可以和 CD73 共同作用產生腺苷，與腺苷受體結合激活 Akt，ERK1/2 等通路，進而磷酸化抑制 GSK-3 通路，減少線粒體膜通透性轉運孔（mPTP）開放最終產生心肌保護[28]。此外，有研究用阿司匹林和放射性標記的 ADP 作用人臍靜脈內皮細胞，同時阻止其前列環素（PGI2/D2）的形成及一氧化氮產生[29]。薄層色譜法發現 AMP 的累積，進一步膜外 CD73 將其代謝為腺苷。但是研究發現用阿司匹林和 ADP 作用的內皮細胞上清液不再能誘導血漿血小板在內皮細胞聚集[30]，這意味著 CD73 可抑制血小板激活[24, 31-32]。提示 CD73 可以通過抑制血小板的聚集來抵抗 OSAHS 間歇性低氧導致的血液凝固來起到保護的目的。有研究證實，在腫瘤微環境，CD73 表達受缺氧調節[33]。更重要的是，CD73 的表達主要受間歇性低氧影響，而在低氧環境下表達量變化不大[34]。本研究發現，在免疫組化和蛋白印跡檢測中，高脂組、間歇性低氧組、間歇性低氧加高脂組 CD73 在蛋白水平的表達明顯高于正常組，且間歇性低氧加高脂組明顯高于高脂組和間歇性低氧組，并且 CD73 在心肌細胞中的表達與心肌細胞的損傷成正相關，提示 CD73 在慢性間歇性低氧心肌損傷中可能受高脂飲食和慢性間歇性低氧的調節，在脂毒性損傷和氧化應激損傷心肌時 CD73 的表達增加，通過激活以上兩種途徑使腺苷的量增加，起到保護心肌線粒體的功能進而達到保護心肌的目的。因此，CD73 可能在抑制 CIH 的心血管損傷中發揮重要的生物學作用。
綜上，高脂飲食和間歇性低氧可以導致心肌細胞損傷。此外，間歇性低氧、高脂飲食可以使心肌細胞中 CD73 的表達量增加。由于 OSAHS 是一個慢性的、復雜的病理過程，CD73 又具有復雜的生物學功能，因此在疾病的不同階段 CD73 可能發揮不同的作用，其在心肌損傷中的詳細機制和功能有待進一步研究。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apnea hypopnea syndromes，OSAHS）是世界性的重大公共衛生問題，近年來其患病率逐漸升高，其中兒童患病率為 2%～3%，成年人的患病率為 2%～4%，肥胖及高脂肪飲食被認為是 OSAHS 發展的高危因素，其中肥胖兒童和青少年發病率高達 13%～59%，肥胖成人則超過了 40%[1-2]。
越來越多證據表明 OSAHS 與心血管疾病的發病率增加有關，但其確切機制尚未完全闡明。研究認為 OSAHS 患者夜間反復出現間斷缺氧與機體氧化應激水平上調、炎癥反應增加、免疫細胞活化等改變有關，其中升高的氧化應激水平與動脈粥樣硬化關系密切，炎癥介質的增加是冠心病發生的始動因素[3]。CD39 為膜外二三磷酸核苷水解酶，可將三磷酸腺苷水解為二磷酸腺苷和 5'-腺嘌呤核苷酸（5'-AMP）[4]。CD73 為胞外 5'-核苷酸酶，是一種通過糖基-磷脂酰肌醇錨定于質膜的糖蛋白，廣泛表達于肝臟、腎臟、心臟、血管平滑肌，在成纖維細胞、內皮細胞、淋巴細胞、神經膠質細胞、近端腎小管上皮細胞和腫瘤細胞等也有較高的表達[5]，可將 AMP 水解生成腺苷，從而參與調控機體多種生理和病理過程，包括抗炎、調節免疫及促進腫瘤細胞遷移等[6]。CD73 已被假設為能夠進行細胞外 AMP 水解的主要酶[7-8]。最近有研究證實，人類 CD39（hCD39）表達的上調能減少小鼠心肌缺血/再灌注（ I/R） 損傷后的梗死面積[9]。但是關于 OSAHS 患者心肌細胞 CD73 的表達情況及 CD73 在 OSAHS 相關的心肌損傷中的作用國內外幾乎沒有相關報道。本研究擬使用 Wistar 大鼠建立大鼠在間歇性低氧合并高脂飲食來模擬人類慢性間歇性低氧（CIH）模型，在周期性缺氧和復氧條件下通過免疫組化和蛋白印跡觀察 CD73 在大鼠心臟的分布和蛋白水平的表達情況，探討其在 CIH 并發心血管損害機制過程中的作用。
1 材料與方法
1.1 實驗動物及分組
24 只 SPF 級健康雄性 Wistar 大鼠，8 周齡，體重 180～220 g（甘肅中醫藥大學 SPF 級動物實驗室提供），置于溫度、濕度適中的實驗室內用同種普通干飼料喂養，實驗前飼養 1 周適應環境。然后按隨機數字表法分為 4 組，每組 6 只。分別為 A 組（常氧及普通飲食）、B 組（常氧及高脂飲食：3% 膽固醇，0.2% 丙基硫氧嘧啶，0.3% 膽酸鈉，10% 豬油，2% 蛋黃粉[2]）、C 組（間歇性低氧及普通飲食）、D 組（間歇性低氧及高脂飲食）。間歇性低氧箱裝置由密閉式大鼠飼養籠、CY-12C 型測氧儀、氮氣/氧氣儲氣瓶程控儀、電磁式空氣壓縮機和控制系統組成，控制系統包括減壓閥、流量計、電磁閥及數字顯示時間繼電器等。氮氣和氧氣由蘭州順豐氣站提供。
1.2 試劑與儀器
兔抗大鼠 CD73 抗體（Abcam，英國）；山羊抗兔二抗（中杉金橋試劑公司，中國）；ECL Western Blotting Substrate（Pierce，美國）；辣根過氧化物酶標記的二抗；細胞裂解液；高脂飼料，含豬油 10%，丙硫氧嘧啶 0.2%，白糖 7%，膽固醇 2%，膽酸鈉 0.5% 及普通飼料 80.3%。
1.3 模型建立
C 組與 D 組大鼠置于間歇低氧艙內，由進氣孔向艙內循環充入氮氣、氧氣和壓縮空氣，每循環 120 s：充入氮氣（純度 99.99%）30 s，靜息 10 s，充入氧氣 20 s，壓縮空氣 60 s。通過測氧儀監測，使每一循環艙內最低氧濃度達 6%～7%，后逐漸恢復至 21%。A 組與 B 組置于持續充入壓縮空氣的模擬艙內，氧濃度 21%。每天進行 8 h（9 時至 17 時）通氣，持續 42 d。實時監測 C 組和 D 組艙內的氧濃度并記錄。其余時間大鼠置于氧濃度 21% 的實驗室內飼養[10-12]。
1.4 取材
實驗 6 周后，禁食 12 h，于第 43 d 清晨稱重后以 10% 水合氯醛（3 ml）腹腔注射麻醉大鼠，經腹主動脈取血約 5 ml，離心檢測血液生化。在冰床上快速解剖分離大鼠左心室分成兩份，一份在多聚甲醛中固定 48 h，用于免疫組化檢測和 HE 病理檢查；另一份保存于 –80 ℃ 冰箱用于蛋白印跡測定。
1.5 檢測指標
1.5.1 體重和血脂水平測定 每日早晨 8 時對大鼠進行稱重并記錄。血清甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）由蘭州大學第一醫院使用標準的全自動生化分析儀（日立 7170A）進行測定。
1.5.2 組織病理學改變 取各組大鼠左心室，4% 中性多聚甲醛固定，常規石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，常規脫蠟，用于 HE 染色、免疫組化染色。免疫組織化學 SP 法染色，EDTA 修復，其余步驟按 SP 試劑盒說明書進行。兔抗大鼠多克隆抗體 CD73 用 PBS 1︰400 稀釋，用已知陽性片作為陽性對照，PBS 代替一抗作為陰性對照。DAB 顯色，常規脫水、透明、封片。在光學顯微鏡下觀察心肌細胞 CD73 的表達情況，應用 ImagePro Plus 6.0 圖像分析軟件對各組圖像陽性染色的平均吸光度值行定量分析。即隨機觀察各組切片，每組 6 張切片，每張切片 400 倍下隨機選取 10 個視野采集圖像，計算每個視野中陽性染色的平均吸光度值，以此分析和判斷各組心肌細胞 CD73 表達情況。
1.5.3 蛋白印跡 大鼠深度麻醉后，在冰盒上快速分離解剖大鼠心臟，取左心室在 –80 ℃ 冰箱保存，每組每份取相同質量組織用 RIPA 裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白。用 BCA 法測定蛋白濃度，并將樣品濃度調成一致，100 ℃ 水浴 5 min 使樣品充分變性。等體積上樣進行經 15% SDS 凝膠電泳，隨后蛋白被轉移到 PVDF 膜上，用 TBST 配置的 5% 的脫脂奶粉搖床上將其封閉 2 h，TBST 洗 3 次后，于 1︰2 000 兔抗 CD73 多克隆抗體中 4 ℃ 孵育過夜。次日，TBST 洗 3 次后，用 1︰5 000 的辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG 二抗 37 ℃ 搖床孵育 1 h。ECL 法化學發光成像，掃描儀采集圖像后用 Image J 圖像分析軟件對各圖像灰度值進行分析測定。
1.6 統計學方法
應用 SPSS 22.0 軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差（ ）表示。組間比較用單因素方差分析（One Way ANOVA）和最小顯著差異法（LSD），P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 血脂水平
四組大鼠血脂指標（TG 和 LDL-C）比較，差異均有統計學意義（F =18.786、12.672，P<0.05）。與 A 組比較，B、C、D 組的 TG 水平極顯著增加（P<0.01），B 組與 C 組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。與 A 組比較，B 組的 LDL-C 水平顯著增加（P<0.05），C 組與 D 組極顯著增加（P<0.01）。結果見表 1、圖 1。
表1
四組大鼠血脂水平比較（n=6，
）
圖1
四組大鼠血脂水平比較
2.2 心肌組織 HE 染色結果
A 組心肌組織無異常（圖 2a）。B 組和 C 組心肌組織中可見部分肌纖維排列紊亂，局灶性變性壞死（圖 2b、2c）。D 組心肌細胞損傷明顯，可見肌纖維排列紊亂，縱橫紋不清，部分肌纖維溶解變性壞死（圖 2d）。
2.3 CD73 蛋白表達水平
在大鼠心肌中，CD73 主要分布于心肌細胞的胞漿和胞膜，以及血管內皮細胞和平滑肌細胞，呈棕色。A 組和 B 組與 C 組和 D 組相比，心肌細胞 CD73 染色較淺，其中 D 組染色最深（圖 2h）。與 A 組比較，B、C、D 組 CD73 蛋白表達水平均明顯升高（P<0.01）。與 B 組和 C 組相比較，D 組 CD73 蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。結果見表 2 及圖 3。
蛋白印跡檢測也顯示出一致的結果：與 A 組比較，B、C 組心肌 CD73 蛋白表達水平均顯著升高（P<0.05）。D 組 CD73 蛋白表達水平升高更為顯著（P<0.01），與 B 組和 C 組比較，D 組 CD73 蛋白表達水平明顯升高（P<0.01）。結果見表 2 及圖 4、5。
表2
四組大鼠心肌 CD73 蛋白表達水平比較（n=6，
）
圖3
大鼠心肌 CD73 免疫組化平均吸光度值比較
圖4
大鼠心肌 CD73 蛋白印跡蛋白表達比較
圖5
四組大鼠心肌細胞 CD73 蛋白印跡檢測像
3 討論
OSAHS 的患者常伴有肥胖和脂質代謝紊亂[13]。高脂血癥時在非脂肪組織中累積過量的游離脂肪酸可產生脂毒性，引起胸主動脈血管內皮損傷，誘導動脈粥樣硬化的形成；引起脂質毒性心肌病和非酒精性脂肪性肝炎等[2]。有研究認為 CIH 加高脂肪飲食的模型比簡單間歇性低氧模型更符合 OSAHS 的病理和生理特征[2]。本實驗通過對四組實驗動物血脂水平檢測發現，高脂組和間歇性低氧加高脂組的 TG 和 LDL-C 的水平均高于正常對照組，且間歇性低氧加高脂組血脂水平最高。同時，HE 染色發現，間歇性低氧并高脂飲食組心肌細胞損傷最為嚴重，可見肌纖維排列紊亂，縱橫紋不清，部分肌纖維明顯溶解。這與脂毒性損傷的特征一致，已有動物實驗顯示，當動物同時暴露于間歇性低氧和高脂肪飲食時，高脂血癥本身和其靶組織脂質的脂肪變性將進一步增加循環血液和靶組織的氧化應激水平[14-15]。
OSASH 和心血管疾病有密切的相關性，是心血管疾病的獨立危險因素，患者病情越嚴重，心血管疾病的發病率就越高[16]。OSASH 損傷心血管大致可以通過以下途徑。（1）心血管氧化應激：目前觀點認為夜間反復間斷缺氧-再氧合過程類似于心肌缺血再灌注過程中的缺血缺氧過程，可導致體內氧化應激水平升高，氧自由基（ROS）增多，ROS 及其過氧化產物作為第二信使啟動并激活氧化還原敏感轉錄因子核因子 κB（NF-κB），激活許多炎癥因子，大量的炎癥因子導致細胞結構和功能障礙的變化，導致全身炎癥損傷，特別是血管內皮功能障礙、動脈粥樣硬化和心血管疾病。（2）CIH 可以影響血液凝固：有研究表明，胸主動脈、心肌、毛細血管內可見大量活化的血小板，因此慢性血栓性疾病的形成可能是 OSAHS 導致心血管損傷的一種途徑[2, 17] 。其中，心血管氧化應激在 OSAHS 患者合并靶器官損害的病理生理過程中占重要地位[18-21]。有研究表明氧化應激是通過引起的線粒體功能障礙發揮主導作用[22-23]。最新研究表明，CD73 即胞外-5'-核苷酸酶，是一種通過糖基-磷脂酰肌醇錨定于質膜的糖蛋白，在缺血再灌注、抗炎、免疫調節等方面均有作用。一方面，ATP、ADP 在 CD39 的作用下轉化成 AMP 后，產生的 AMP 又在 CD73 的作用下轉化成腺苷[24-25]，腺苷通過激活腺苷受體進一步激活 PI3Kβ/Akt 通路[26]，磷酸化抑制 GSK-3，開放 ATP 敏感性鉀通道[27]，保護線粒體功能；另一方面，心肌過表達 CD39 可以和 CD73 共同作用產生腺苷，與腺苷受體結合激活 Akt，ERK1/2 等通路，進而磷酸化抑制 GSK-3 通路，減少線粒體膜通透性轉運孔（mPTP）開放最終產生心肌保護[28]。此外，有研究用阿司匹林和放射性標記的 ADP 作用人臍靜脈內皮細胞，同時阻止其前列環素（PGI2/D2）的形成及一氧化氮產生[29]。薄層色譜法發現 AMP 的累積，進一步膜外 CD73 將其代謝為腺苷。但是研究發現用阿司匹林和 ADP 作用的內皮細胞上清液不再能誘導血漿血小板在內皮細胞聚集[30]，這意味著 CD73 可抑制血小板激活[24, 31-32]。提示 CD73 可以通過抑制血小板的聚集來抵抗 OSAHS 間歇性低氧導致的血液凝固來起到保護的目的。有研究證實，在腫瘤微環境，CD73 表達受缺氧調節[33]。更重要的是，CD73 的表達主要受間歇性低氧影響，而在低氧環境下表達量變化不大[34]。本研究發現，在免疫組化和蛋白印跡檢測中，高脂組、間歇性低氧組、間歇性低氧加高脂組 CD73 在蛋白水平的表達明顯高于正常組，且間歇性低氧加高脂組明顯高于高脂組和間歇性低氧組，并且 CD73 在心肌細胞中的表達與心肌細胞的損傷成正相關，提示 CD73 在慢性間歇性低氧心肌損傷中可能受高脂飲食和慢性間歇性低氧的調節，在脂毒性損傷和氧化應激損傷心肌時 CD73 的表達增加，通過激活以上兩種途徑使腺苷的量增加，起到保護心肌線粒體的功能進而達到保護心肌的目的。因此，CD73 可能在抑制 CIH 的心血管損傷中發揮重要的生物學作用。
綜上，高脂飲食和間歇性低氧可以導致心肌細胞損傷。此外，間歇性低氧、高脂飲食可以使心肌細胞中 CD73 的表達量增加。由于 OSAHS 是一個慢性的、復雜的病理過程，CD73 又具有復雜的生物學功能，因此在疾病的不同階段 CD73 可能發揮不同的作用，其在心肌損傷中的詳細機制和功能有待進一步研究。
