引用本文： 陳云芬, 張湘燕, 劉維佳, 張程, 王中新. 瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性與西南地區漢族人群阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的關系. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(5): 474-477. doi: 10.7507/1671-6205.201608059 復制
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apneahypopnea syndrome，OSAHS）是主要表現為睡眠結構紊亂，睡眠時出現反復呼吸暫停、呼吸表淺、夜間間歇性低氧及反復微覺醒伴低通氣的臨床綜合征[1]。OSAHS 在一定程度上可能存在遺傳學因素[2]，而且瘦素（leptin，LEP）水平和體重變化有關[3]，其基因多態性與我國西南地區人群 OSAHS 的發病關系尚無文獻報道。本研究旨在探討該基因多態性在西南地區 OSAHS 中的作用，為探索本地區 OSAHS 的發病機制以及尋找新的臨床防治途徑提供依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
隨機選取 2010 年 1 月至 2015 年 6 月就診于貴州省人民醫院的西南地區（貴州省、云南省、重慶市）無親緣關系的漢族 OSAHS 患者 116 例為 OSAHS 組，均經多導睡眠圖（polysomnagraphy，PSG）監測確診，符合中華醫學會呼吸病學分會睡眠學組制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南》（2011 年修訂版）[4]診斷標準。男 80 例，女 36 例，年齡 26 ～80 歲，平均年齡（50.26±13.29）歲，BMI（27.46±2.51）kg/m2。根據呼吸暫停低通氣指數（apnea hypopnea index，AHI）及夜間最低血氧飽和度（lowest arterial oxygen saturation，LSaO 2），參照中華醫學會呼吸病學分會睡眠學組制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南》（2011 年修訂版）病情分度標準，將 OSAHS 組按病情嚴重程度分為輕度組 26 例、中度組 24 例與重度組 66 例。從貴州省人民醫院體檢中心隨機選取來自西南地區的健康人 99 例，作為對照組：男 70 例，女 29 例，年齡 24～76 歲，平均年齡（46.23±15.24）歲，BMI（23.14±2.31）kg/m2。兩組均測定頸圍（NC）、腰圍（WC），在性別、年齡上無顯著差異（P>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 血清指標測定 所有受試者經多導睡眠監測系統行 7 h 監測結束后，晨起取肘靜脈血 3 ml 裝入不含有抗凝劑的真空采血管。雙抗體酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定 LEP、真胰島素（true insulin，TI），試劑盒由大連泛幫集團科技有限公司提供。
1.2.2 瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性分析 用酚-氯仿法提取外周血基因組 DNA，以 0.2 μg DNA 為模版在反應容積為 25 μl 內進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，引物分別為：上游 5’-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG-3’，下游 5’-AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT-3’（參考 Matsuoka 等[5]所采用的引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成）。反應條件：94 ℃ 預變性 3 min→（94 ℃ 變性 30 s→55 ℃ 退火 30 s→72 ℃ 延伸 1 min 30 個循環）→72 ℃ 延伸 5 min；反應在 PCR 儀中進行（美國 Aipha 公司）。經 1% 瓊脂糖凝膠電泳確認擴增結果，PCR 產物長度為 421 bp，擴增后的產物用限制性內切酶 MspI（TaKaRa TapTM公司），在 37 ℃ 條件下酶解 4 h，用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物片段，先以 120 V、400 mA 電泳 5 min 后，改為 60 V、400 mA 電泳 45 min。紫外線凝膠成像系統觀察電泳結果：經 Msp I 酶切后為 3 條帶，421 bp、127 bp 及 294 bp 帶；其中 Gln223 純合子（AA）電泳帶為 421 bp； Gln223/Arg223 雜合子（GA）電泳帶為 127 bp、294 bp 及 421 bp；Arg223 純合子（GG）電泳帶為 127 bp 及 294 bp（圖 1）。DNA 序列驗證：將 215 個樣本的 PCR 產物，經純化后各取 100 μl 送上海生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果與酶切檢測結果一致。
圖1
瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性電泳結果
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件。基因頻率符合 Hardy-Weinberg 公式；運用基因計數法計算基因頻率及等位基因頻率。AA 基因型頻率為 0.017，無法進行統計學分析，故將基因型分組為 A 組（AA 和 GA 基因型）和 G 組（GG 基因型）。各組計量數據以均數±標準差（ ）表示；兩組間計數資料比較采用 χ2 檢驗，計量資料比較采用 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 西南地區漢族人群 Gln223Arg 多態性頻率分布
OSAHS 組中，瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性的 GG、AA、GA 的基因型頻率表達分別為 0.854、0.017、0.129，G 等位基因頻率為 0.918；A 等位基因頻率為 0.082。對照組中，瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性的 GG、AA、GA 的基因型頻率表達分別為 0.840、0.020、0.140；G 等位基因頻率為 0.900；A 等位基因頻率為 0.100；符合 Hardy-Weinberg 平衡。對照組與 OSAHS 組的 Gln223Arg 基因多態性頻率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1。
表1
對照組與 OSAHS 組 Gln223Arg 多態性基因頻率比較（
）
2.2 Gln223Arg 不同基因型與 OSAHS 組 BMI、WC、NC 的關系
GG 基因型 OSAHS 患者與（GA+AA）基因型 OSAHS 患者的 BMI、WC、NC 比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 2。
表2
Gln223Arg 不同基因型與 OSAHS 組 BMI、WC、NC 的 關系（
）
2.3 OSAHS 組血清 LEP、TI 與 Gln223Arg 不同基因型比較
OSAHS 患者中 GG 基因型與（GA+AA）基因型的 LEP、TI 比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 3。
表3
OSAHS 組血清 LEP、TI 與 Gln223Arg 不同基因型比 較（
）
2.4 OSAHS 組與對照組血清 LEP、TI 的比較
不同嚴重程度 OSAHS 組與對照組比較，血清 LEP、TI 水平均有升高；輕、中、重度 OSAHS 組上述指標逐漸升高，各組間比較差異均有統計學意義（均 P<0.05）。結果見表 4。
表4
OSAHS 不同病情分組與對照組 LEP、TI 的比較（
）
3 討論
由于 OSAHS 患者大多數伴有肥胖，肥胖患者絕大多數表現為高瘦素血癥。李建瑞等[2]用基因測序方法檢測 OSAHS 患者和正常人的瘦素受體基因 Gln223Arg 多態位點，從基因水平探討該病的遺傳學因素。此后多個研究針對瘦素及其受體基因的多態性，以及與 OSAHS 在不同人種、不同國家、不同地區、不同民族的患病率之間的關系。
本研究發現，OSAHS 組與對照組的 Gln223Arg 基因多態性頻率比較差異無統計學意義，提示 Gln223Arg 多態性對西南地區漢族人群 OSAHS 的發病可能無重要作用；與北方地區和溫州地區漢族人群中研究結果一致[3, 6]；與日本人的同類研究結果也一致[5]；但針對印第安人和白種人的同類研究卻發現 OSAHS 組與對照組之間存在差異[7]，說明該基因多態性分布具有種族差異。
本研究結果顯示：西南地區 OSAHS 組中 GG 基因型的 BMI、WC、NC 較（GA+AA）基因型均有增高，兩者存在顯著差異，說明瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性（GG 基因型）與肥胖之間存在關聯，含有 GG 基因型的患者更容易出現肥胖。本研究結果與 Thomposon 等[7]報道的在匹馬印第安人群中 Gln223Arg 變異與 BMI 有相關性，以及 Yiannakouris 等[8]的研究顯示 Gln223Arg 的 GG 基因型與 BMI 和肥胖獨立相關等的研究結果相符合；但與 Matsuoka 等[5]在日本人群中的研究結果相反，該研究結果發現瘦素受體基因 Gln223Arg 基因多態性在肥胖和非肥胖組之間沒有顯著差異。
本研究觀察到 OSAHS 患者中 Gln223Arg 多態性不同基因型的 LEP、TI 無顯著差異。但在 OSAHS 組與對照組中進行比較可以看出，血清 LEP 水平在 OSAHS 組與對照組相比明顯升高，提示 LEP 參與了 OSAHS 的發生。其具體機制可能為 OSAHS 患者存在 LEP 抵抗[9]，LEP 不能發揮正常的生理功能；過多的脂肪沉積于上氣道和內臟，促使或加重睡眠時呼吸道塌陷，甚至閉塞，引起 OSAHS 的發生[10]。我們對輕、中、重度組 OSAHS 患者血清 LEP 水平進行分析，發現血清 LEP 水平隨 OSAHS 病情嚴重程度的增加逐漸升高，提示 OSAHS 患者存在高瘦素血癥，血清 LEP 參與了 OSAHS 的發展。Eun 等[11]研究發現，OSAHS 本身是影響 LEP 水平的一個獨立因素，OSAHS 患者病情越重，血清 LEP 水平越高。
本研究的結果顯示，OSAHS 組血清 TI 水平比對照組明顯升高，隨著 OSAHS 病情程度的加重逐漸升高，提示 OSAHS 患者存在高胰島素血癥/胰島素抵抗，使胰島素受體生物反應活性下降，引起糖代謝異常，血糖升高，并發糖尿病的風險增加。
綜上所述，本研究發現瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性可能參與肥胖的發生，GG 基因型的患者發生肥胖的機率較其他基因高，但 Gln223Arg 多態性與西南地區漢族人群 OSAHS 的發病無關；OSAHS 患者 Gln223Arg 基因多態性與 LEP、TI 含量無關。OSAHS 患者存在高瘦素血癥、高胰島素血癥，并且和疾病的嚴重程度相關。
阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征（obstructive sleep apneahypopnea syndrome，OSAHS）是主要表現為睡眠結構紊亂，睡眠時出現反復呼吸暫停、呼吸表淺、夜間間歇性低氧及反復微覺醒伴低通氣的臨床綜合征[1]。OSAHS 在一定程度上可能存在遺傳學因素[2]，而且瘦素（leptin，LEP）水平和體重變化有關[3]，其基因多態性與我國西南地區人群 OSAHS 的發病關系尚無文獻報道。本研究旨在探討該基因多態性在西南地區 OSAHS 中的作用，為探索本地區 OSAHS 的發病機制以及尋找新的臨床防治途徑提供依據。
1 資料與方法
1.1 臨床資料
隨機選取 2010 年 1 月至 2015 年 6 月就診于貴州省人民醫院的西南地區（貴州省、云南省、重慶市）無親緣關系的漢族 OSAHS 患者 116 例為 OSAHS 組，均經多導睡眠圖（polysomnagraphy，PSG）監測確診，符合中華醫學會呼吸病學分會睡眠學組制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南》（2011 年修訂版）[4]診斷標準。男 80 例，女 36 例，年齡 26 ～80 歲，平均年齡（50.26±13.29）歲，BMI（27.46±2.51）kg/m2。根據呼吸暫停低通氣指數（apnea hypopnea index，AHI）及夜間最低血氧飽和度（lowest arterial oxygen saturation，LSaO 2），參照中華醫學會呼吸病學分會睡眠學組制定的《阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征診治指南》（2011 年修訂版）病情分度標準，將 OSAHS 組按病情嚴重程度分為輕度組 26 例、中度組 24 例與重度組 66 例。從貴州省人民醫院體檢中心隨機選取來自西南地區的健康人 99 例，作為對照組：男 70 例，女 29 例，年齡 24～76 歲，平均年齡（46.23±15.24）歲，BMI（23.14±2.31）kg/m2。兩組均測定頸圍（NC）、腰圍（WC），在性別、年齡上無顯著差異（P>0.05）。
1.2 方法
1.2.1 血清指標測定 所有受試者經多導睡眠監測系統行 7 h 監測結束后，晨起取肘靜脈血 3 ml 裝入不含有抗凝劑的真空采血管。雙抗體酶聯免疫吸附試驗（ELISA）法測定 LEP、真胰島素（true insulin，TI），試劑盒由大連泛幫集團科技有限公司提供。
1.2.2 瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性分析 用酚-氯仿法提取外周血基因組 DNA，以 0.2 μg DNA 為模版在反應容積為 25 μl 內進行聚合酶鏈反應（PCR）擴增，引物分別為：上游 5’-ACCCTTTAAGCTGGGTGTCCCAAATAG-3’，下游 5’-AGCTAGCAAATATTTTTGTAAGCAATT-3’（參考 Matsuoka 等[5]所采用的引物序列，由上海生工生物工程股份有限公司合成）。反應條件：94 ℃ 預變性 3 min→（94 ℃ 變性 30 s→55 ℃ 退火 30 s→72 ℃ 延伸 1 min 30 個循環）→72 ℃ 延伸 5 min；反應在 PCR 儀中進行（美國 Aipha 公司）。經 1% 瓊脂糖凝膠電泳確認擴增結果，PCR 產物長度為 421 bp，擴增后的產物用限制性內切酶 MspI（TaKaRa TapTM公司），在 37 ℃ 條件下酶解 4 h，用 1% 瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產物片段，先以 120 V、400 mA 電泳 5 min 后，改為 60 V、400 mA 電泳 45 min。紫外線凝膠成像系統觀察電泳結果：經 Msp I 酶切后為 3 條帶，421 bp、127 bp 及 294 bp 帶；其中 Gln223 純合子（AA）電泳帶為 421 bp； Gln223/Arg223 雜合子（GA）電泳帶為 127 bp、294 bp 及 421 bp；Arg223 純合子（GG）電泳帶為 127 bp 及 294 bp（圖 1）。DNA 序列驗證：將 215 個樣本的 PCR 產物，經純化后各取 100 μl 送上海生物工程技術服務有限公司進行測序，測序結果與酶切檢測結果一致。
圖1
瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性電泳結果
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 軟件。基因頻率符合 Hardy-Weinberg 公式；運用基因計數法計算基因頻率及等位基因頻率。AA 基因型頻率為 0.017，無法進行統計學分析，故將基因型分組為 A 組（AA 和 GA 基因型）和 G 組（GG 基因型）。各組計量數據以均數±標準差（ ）表示；兩組間計數資料比較采用 χ2 檢驗，計量資料比較采用 t 檢驗。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 西南地區漢族人群 Gln223Arg 多態性頻率分布
OSAHS 組中，瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性的 GG、AA、GA 的基因型頻率表達分別為 0.854、0.017、0.129，G 等位基因頻率為 0.918；A 等位基因頻率為 0.082。對照組中，瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性的 GG、AA、GA 的基因型頻率表達分別為 0.840、0.020、0.140；G 等位基因頻率為 0.900；A 等位基因頻率為 0.100；符合 Hardy-Weinberg 平衡。對照組與 OSAHS 組的 Gln223Arg 基因多態性頻率比較，差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 1。
表1
對照組與 OSAHS 組 Gln223Arg 多態性基因頻率比較（
）
2.2 Gln223Arg 不同基因型與 OSAHS 組 BMI、WC、NC 的關系
GG 基因型 OSAHS 患者與（GA+AA）基因型 OSAHS 患者的 BMI、WC、NC 比較，差異有統計學意義（P<0.05）。結果見表 2。
表2
Gln223Arg 不同基因型與 OSAHS 組 BMI、WC、NC 的 關系（
）
2.3 OSAHS 組血清 LEP、TI 與 Gln223Arg 不同基因型比較
OSAHS 患者中 GG 基因型與（GA+AA）基因型的 LEP、TI 比較差異無統計學意義（P>0.05）。結果見表 3。
表3
OSAHS 組血清 LEP、TI 與 Gln223Arg 不同基因型比 較（
）
2.4 OSAHS 組與對照組血清 LEP、TI 的比較
不同嚴重程度 OSAHS 組與對照組比較，血清 LEP、TI 水平均有升高；輕、中、重度 OSAHS 組上述指標逐漸升高，各組間比較差異均有統計學意義（均 P<0.05）。結果見表 4。
表4
OSAHS 不同病情分組與對照組 LEP、TI 的比較（
）
3 討論
由于 OSAHS 患者大多數伴有肥胖，肥胖患者絕大多數表現為高瘦素血癥。李建瑞等[2]用基因測序方法檢測 OSAHS 患者和正常人的瘦素受體基因 Gln223Arg 多態位點，從基因水平探討該病的遺傳學因素。此后多個研究針對瘦素及其受體基因的多態性，以及與 OSAHS 在不同人種、不同國家、不同地區、不同民族的患病率之間的關系。
本研究發現，OSAHS 組與對照組的 Gln223Arg 基因多態性頻率比較差異無統計學意義，提示 Gln223Arg 多態性對西南地區漢族人群 OSAHS 的發病可能無重要作用；與北方地區和溫州地區漢族人群中研究結果一致[3, 6]；與日本人的同類研究結果也一致[5]；但針對印第安人和白種人的同類研究卻發現 OSAHS 組與對照組之間存在差異[7]，說明該基因多態性分布具有種族差異。
本研究結果顯示：西南地區 OSAHS 組中 GG 基因型的 BMI、WC、NC 較（GA+AA）基因型均有增高，兩者存在顯著差異，說明瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性（GG 基因型）與肥胖之間存在關聯，含有 GG 基因型的患者更容易出現肥胖。本研究結果與 Thomposon 等[7]報道的在匹馬印第安人群中 Gln223Arg 變異與 BMI 有相關性，以及 Yiannakouris 等[8]的研究顯示 Gln223Arg 的 GG 基因型與 BMI 和肥胖獨立相關等的研究結果相符合；但與 Matsuoka 等[5]在日本人群中的研究結果相反，該研究結果發現瘦素受體基因 Gln223Arg 基因多態性在肥胖和非肥胖組之間沒有顯著差異。
本研究觀察到 OSAHS 患者中 Gln223Arg 多態性不同基因型的 LEP、TI 無顯著差異。但在 OSAHS 組與對照組中進行比較可以看出，血清 LEP 水平在 OSAHS 組與對照組相比明顯升高，提示 LEP 參與了 OSAHS 的發生。其具體機制可能為 OSAHS 患者存在 LEP 抵抗[9]，LEP 不能發揮正常的生理功能；過多的脂肪沉積于上氣道和內臟，促使或加重睡眠時呼吸道塌陷，甚至閉塞，引起 OSAHS 的發生[10]。我們對輕、中、重度組 OSAHS 患者血清 LEP 水平進行分析，發現血清 LEP 水平隨 OSAHS 病情嚴重程度的增加逐漸升高，提示 OSAHS 患者存在高瘦素血癥，血清 LEP 參與了 OSAHS 的發展。Eun 等[11]研究發現，OSAHS 本身是影響 LEP 水平的一個獨立因素，OSAHS 患者病情越重，血清 LEP 水平越高。
本研究的結果顯示，OSAHS 組血清 TI 水平比對照組明顯升高，隨著 OSAHS 病情程度的加重逐漸升高，提示 OSAHS 患者存在高胰島素血癥/胰島素抵抗，使胰島素受體生物反應活性下降，引起糖代謝異常，血糖升高，并發糖尿病的風險增加。
綜上所述，本研究發現瘦素受體基因 Gln223Arg 多態性可能參與肥胖的發生，GG 基因型的患者發生肥胖的機率較其他基因高，但 Gln223Arg 多態性與西南地區漢族人群 OSAHS 的發病無關；OSAHS 患者 Gln223Arg 基因多態性與 LEP、TI 含量無關。OSAHS 患者存在高瘦素血癥、高胰島素血癥，并且和疾病的嚴重程度相關。
