引用本文： 賈嫚, 閆小逸, 姜潔, 孟亞奇, 許家艷, 姚欣. 埃茲蛋白在轉化生長因子-β 誘導的支氣管上皮細胞間充質轉化中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(3): 280-286. doi: 10.7507/1671-6205.201702015 復制
在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）及肺纖維化等疾病中，存在上皮損傷，上皮下增厚和纖維化，平滑肌細胞增生肥大，以及膠原沉積等氣道重塑的重要病理特征[1]。研究表明，上皮間充質轉化（EMT），即上皮細胞在外界因素的作用下獲得某些間充質細胞特征，包括細胞極性喪失、細胞骨架蛋白的改變和成纖維細胞樣外形等[2-3]，可能通過促進上皮下纖維化，成為啟動氣道重塑發生的關鍵環節[4-6]。
埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白（ERM）是真核細胞內廣泛表達的一種細胞骨架結合蛋白，在 EMT 機制的調控中發揮作用[7]。有研究發現，抑制 ERM 蛋白表達可明顯破壞上皮細胞微絨毛結構，削弱細胞間黏附和極性，而過度表達 ERM 蛋白則可逆轉上述過程[8-10]。進一步研究發現，ERM 蛋白可能通過與肌動蛋白和膜蛋白結合參與 EMT 過程中的細胞骨架重建。埃茲蛋白（ezrin）作為 ERM 家族一員，是真核細胞內廣泛表達的一種膜-細胞骨架連接蛋白，與肌動蛋白細胞骨架重塑、細胞侵襲和轉移過程密切相關[11-15]。據此，我們在離體水平研究 ezrin 在轉化生長因子-β（TGF-β）誘導的支氣管上皮細胞 EMT 過程中的作用，旨在為深入理解慢阻肺、支氣管哮喘等疾病中氣道重塑的病理生理機制、探討新的臨床治療靶標提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
人支氣管上皮細胞系（16HBE）來源于北京腫瘤研究所。胎牛血清（FBS）購自美國 Sciencell 公司。ezrin、上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌動蛋白（α-SMA）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國 Cell Signaling Technology 公司。TGF-β 購自美國 peprotech 中國分公司。人重組 ezrin 蛋白購自北京義翹神州生物科技有限公司。帶有綠色熒光蛋白（GFP）的小發夾 RNA（shRNA）和 ezrin-shRNA 的慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。PrimeScriptTM 逆轉錄試劑盒和 SuperReal qPCR PreMix（SYBR Green）購自日本 Takara 公司。GAPDH、ezrin、E-cadherin、波形蛋白（vimentin）和 a-SMA 引物由 Invitrogen 公司合成（表 1）。
表1
GAPDH、ezrin、E-cadherin、vimentin 和 a-SMA 引物
1.2 方法
1.2.1 細胞培養 1640 培養基（含 10% FBS 和 1% 雙抗）重懸，將 16HBE 細胞放置在 37 ℃ 細胞培養箱中，2 d 左右換液，待細胞密度達到 90% 左右時進行傳代和凍存。細胞處理前需饑餓 6～12 h。根據操作手冊將帶有 GFP-shRNA 或 ezrin-shRNA 的慢病毒轉染 16HBE 細胞以構建 ezrin 表達缺失的體外模型，24 h 后換液，第 3 d 熒光顯微鏡觀察病毒轉染情況，實時熒光定量 PCR（RT-PCR）和蛋白質印跡試驗（Western blot）檢測 ezrin 敲減效果，同時用 30 ng/ml TGF-β 刺激正常 16HBE 72 h 作為陽性對照。
1.2.2 RT-PCR 用不同濃度 TGF-β（5、30、100 ng/ml）處理細胞 6 h 以及不同濃度重組蛋白 ezrin（20、100、200 ng/ml）處理細胞 12 h，以不加任何干預措施的細胞為對照組。移去培養基，預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞后，每孔加入 1 ml 的 Trizol 提取細胞總 RNA，逆轉錄后加入 SYBR Green 行 RT-PCR。反應條件為：預變性 95 ℃ 30 s→變性 95 ℃ 5 s→退火 60 ℃ 30 s→延伸 72 ℃ 10 min，共 40 個循環。最后以 GAPDH 為內參，計算 2 （–△△CT），比較目的基因的相對表達量。
1.2.3 Western blot 分別用 30 ng/ml TGF-β、外源性 ezrin（20、100、200 ng/ml）處理細胞 24 h 后，經 PBS 洗 2 次，用胰酶消化后收集細胞，用裂解液提取總蛋白，制備聚丙烯酰胺凝膠，80/120 V 恒壓電泳，300 mA 恒流轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5% 脫脂奶粉-洗滌緩沖液室溫封閉 1 h，加入 ezrin、E-cadherin、α-SMA 及 GAPDH 抗體 4 ℃ 孵育過夜，洗滌緩沖液洗滌后，羊抗兔二抗室溫 1 h。在 Molecular Imager ChemiDocTMXRS+凝膠數字成像系統下，用電化學發光液曝光成像，以 GAPDH 為內參，比較各蛋白的相對表達量。
1.2.4 細胞免疫熒光試驗 24 孔板中分別加入 200 ng/ml 重組蛋白 ezrin、30 ng/ml TGF-β 處理 16HBE 24 h，以不加干預措施的 16HBE 為對照組。先用 4% 的多聚甲醛固定細胞，0.2% Triton X-100 破膜，10% 的山羊血清封閉。接著用 10% 山羊血清稀釋 E-cadherin 一抗（1︰100），每孔加入 10 μl 后放入 4 ℃ 冰箱過夜。第 2 d 搖床孵育異硫氰酸熒光素標記的熒光二抗（1︰200），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核后于熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.3 統計學方法
結果以均值±標準差（ ）表示，使用 Graphpad 統計軟件進行分析處理，兩組間差異分析采用成組 t 檢驗，多組間差異分析選用單因素方差分析結合最小顯著差法進行。P≤0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 TGF-β 抑制 16HBE 中 ezrin 的表達
TGF-β（30、100 ng/ml）可明顯下調 16HBE 中 ezrin 的 mRNA 水平（P<0.001，圖 1）。24 h 后 ezrin 蛋白水平也開始下降，同對照組相比差異有統計學意義（P<0.01，圖 2）。
圖1
不同濃度 TGF-β 對 16HBE 中 ezrin mRNA 水平的 影響
圖2
Western blot 檢測 16HBE 中 ezrin 蛋白水平 a. Western blot 檢測像； b. ezrin 蛋白相對表達量
2.2 ezrin 表達缺失促進 16HBE 發生 EMT
敲減 ezrin 后，同 TGF-β 刺激 16HBE 引起形態改變一樣，細胞由典型的多邊鋪路石樣變為長梭形，呈間質細胞樣改變（圖 3）。其上皮細胞標志蛋白 E-cadherin 的表達下降，間質細胞標志蛋白 vimentin 和 α-SMA 的表達升高（圖 4、5）。
圖3
體外培養細胞倒置顯微鏡像（×100，×200） 16HBE 對照組和病毒轉染 16HBE 陰性對照組的培養細胞呈多邊鋪路石樣，而 30 ng/ml TGF-β 刺激組和 ezrin 敲減組的培養細胞呈長梭形（黑箭）
圖4
ezrin 敲減對 16HBE 中 vimentin 和 α-SMA mRNA 水平的影響 a. vimentin mRNA 水平； b. α-SMA mRNA 水平
圖5
Western blot 檢測 E-cadherin 和 α-SMA 蛋白水平 a. Western blot 檢測像； b. E-cadherin 蛋白相對表達量； c. α-SMA 蛋白相對表達量
2.3 外源性 ezrin 抑制 16HBE 的 EMT 進程
同 TGF-β 組相反，加入重組蛋白 ezrin 可以上調 16HBE 細胞 E-cadherin mRNA 和蛋白表達，下調 vimentin 和 α-SMA 的表達水平，并呈濃度依賴性（圖 6、7）。免疫熒光結果表明 E-cadherin 在外源性 200 ng/ml ezrin 作用下表達增加，在 30 ng/ml TGF-β 作用下表達降低（圖 8）。
圖6
外源性 ezrin 對 16HBE 的 E-cadherin、vimentin 和 α-SMA mRNA 水平的影響 a. E-cadherin mRNA 水平； b. vimentin mRNA 水平； c. α-SMA mRNA 水平
圖7
Western blot 檢測 E-cadherin 和 α-SMA 的蛋白水平 a. Western blot 檢測像； b. E-cadherin 蛋白相對表達量； c. α-SMA 蛋白相對表達量
圖8
E-cadherin 表達的細胞免疫熒光檢測像（×200）
3 討論
Ezrin 又稱細胞絨毛蛋白，1983 年由 Bretscher[16]在雞的小腸上皮細胞刷狀緣內首次純化出來并命名，在細胞膜蛋白與肌動蛋白骨架之間起到橋梁的作用。其主要分布在胃腸道、肺和腎臟[17]，多表達于絨毛、細胞皺褶等肌動蛋白比較豐富的上皮細胞表面。Ezrin 有 3 個結構域，分別是高度保守的與細胞膜連接的 N 端 FERM 區、α 螺旋區及 C 端的肌動蛋白結合區。非活化狀態的 ezrin 可以通過 C 端的蘇氨酸磷酸化和N端與磷脂酰肌醇二磷酸的結合這兩種途徑達到活化狀態[18-20]。此外，ezrin 也可被某些細胞因子激活，膜蛋白通過與其胞外結構域和配體將胞外信號傳遞到胞內信號，進而參與細胞的有絲分裂、增殖、黏附及遷移等生理病理過程[18-20]。
有報道發現在骨肉瘤細胞中 ezrin 及磷酸化 ezrin 水平增加[21]。也有研究發現 ezrin 在 8 種人乳腺癌細胞系間表達無明顯差異[22]。用 TGF-β 刺激非小細胞肺癌細胞系，結果顯示其 ezrin 總體水平無顯著性變化，但在細胞中的表達部位發生了重新分布[23]。在本實驗中，TGF-β 可以下調 16HBE 中 ezrin 的表達水平，提示 ezrin 在不同的細胞表型和刺激狀態下表達水平和激活后發揮的作用可能有所不同。
被激活后的 ezrin 蛋白由細胞膜進入細胞質，C 端可與細胞骨架的肌動蛋白相連，N 端則通過與 E-cadherin、細胞間黏附分子、透明質酸受體、鈉氫交換體等膜蛋白相互連接來調節細胞-細胞及細胞-細胞外基質之間的黏附[20]。其中，E-cadherin 是這種細胞表面復合體的重要組分。在 EMT 過程中，E-cadherin 表達下調，導致細胞間的黏附功能下降，細胞遷移能力增加[24]。實驗中我們發現，敲減 ezrin 后 E-cadherin 表達明顯下降，加入重組 ezrin 蛋白后 E-cadherin 表達上升，提示 ezrin 可能在維持支氣管上皮細胞間及支氣管上皮細胞與細胞外基質間的黏附連接中扮演重要角色。
Ezrin 也可通過與肌動蛋白和膜蛋白結合參與細胞骨架重建，在 EMT 機制的調控中發揮作用。有報道稱 EMT 伴有骨架蛋白重構，原在胞膜下主要由皮層肌動蛋白形成的厚的板樣結構消失，轉而在胞漿中形成粗大的束狀應力纖維，沿細胞長軸縱行排列，而且在某些細胞邊緣形成了片狀偽足和絲狀偽足[6, 25]。也有研究發現正常大鼠的氣道平滑肌細胞只有少量短而細的應力纖維，無絲狀偽足，而哮喘大鼠的氣道平滑肌細胞則發生伸展，應力纖維形成增多，可見偽足形成，提示存在細胞骨架重構[26]。肌動蛋白細胞骨架已經被認為是細胞因子等細胞外信號啟動和調節細胞內信號時首要的靶蛋白[27]。TGF-β 是誘導 EMT 效應最強的細胞因子，可以啟動并完成整個 EMT 過程[28-29]。當上皮細胞受 TGF-β 刺激后，上皮細胞間黏附和極性消失，細胞骨架重建，由典型的鵝卵石樣變為成纖維細胞樣，伴有多個突起[30-31]。也有實驗發現 TGF-β 刺激人肺腺癌細胞 48 h 后，ezrin 蛋白的分布發生變化，由胞膜及細胞表面的微絨毛處進入胞質，進而細胞骨架重排，形成束狀纖維樣結構，最終導致細胞表型的改變[32]。當我們將 ezrin 敲減后，出現了和 TGF-β 刺激 16HBE 后相同的細胞形態學改變：16HBE 由經典的鋪路石狀變成長梭形，提示 TGF-β 可能通過下調 ezrin 引起細胞骨架的重塑，促進 16HBE 發生 EMT。
vimentin 和 α-SMA 是細胞骨架的重要成分，也是常見的間充質細胞表型標志物。前者與細胞遷移能力相關，其表達上調通常伴隨 E-cadherin 的減少；后者則具有收縮潛能和較強的膠原合成能力，兩者在 TGF-β 誘導 EMT 過程中表達都明顯增多[24, 33]。當我們敲減 ezrin 后，vimentin 和 α-SMA 表達均明顯上升，加入外源性 ezrin 后兩者水平有所下調。據此我們推測：TGF-β 通過抑制支氣管上皮細胞中 ezrin 表達，影響骨架蛋白 vimentin 和 α-SMA 的表達，進而引起 EMT。
近年來，越來越多的研究證實 TGF-β 誘導 EMT 過程由 Smad 經典通路和多條非 Smad 經典通路共同參與，這些通路間同時還存在交互通話，使其分子機制變得異常復雜[34-35]。Rho 樣 GTP 酶信號通路（非 Smad 經典通路）在 TGF-β 導致 EMT 過程中細胞間緊密連接分解和肌動蛋白骨架重組中起重要作用。其中 RhoA 是 TGF-β 誘導 EMT 過程中的關鍵分子。RhoA 被 TGF-β 激活后能誘導上皮細胞中應力纖維的形成和間質特征的出現[35-37]。也有報道發現 ezrin 蛋白可作為 RhoGTP 的上游和下游活化因子，通過募集 Rho 家族的正負調節因子在 RhoGTP 的活化中起關鍵作用[27]。據此我們推測，TGF-β 可能不僅僅在早期利用下調總 ezrin 表達量影響膜蛋白 E-cadherin 以及骨架蛋白 vimentin 和 α-SMA 的表達促進 EMT，同時也極有可能通過激活支氣管上皮細胞中的 ezrin 使 RhoGTP（尤其是 RhoA）過度表達，通過 TGF-β-ezrin-RhoA 這一信號通路推動上皮向間充質轉化。
ezrin 作為細胞骨架結合蛋白參與 TGF-β 誘導的支氣管上皮細胞 EMT 過程，本研究結果為靶向保護支氣管上皮細胞提供了新靶點。ezrin 在氣道重塑中的具體機制以及是否可將 ezrin 作為臨床上早期預測氣道重塑的生物標志物將成為我們下一步研究的目標。
在支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病（簡稱慢阻肺）及肺纖維化等疾病中，存在上皮損傷，上皮下增厚和纖維化，平滑肌細胞增生肥大，以及膠原沉積等氣道重塑的重要病理特征[1]。研究表明，上皮間充質轉化（EMT），即上皮細胞在外界因素的作用下獲得某些間充質細胞特征，包括細胞極性喪失、細胞骨架蛋白的改變和成纖維細胞樣外形等[2-3]，可能通過促進上皮下纖維化，成為啟動氣道重塑發生的關鍵環節[4-6]。
埃茲蛋白-根蛋白-膜突蛋白（ERM）是真核細胞內廣泛表達的一種細胞骨架結合蛋白，在 EMT 機制的調控中發揮作用[7]。有研究發現，抑制 ERM 蛋白表達可明顯破壞上皮細胞微絨毛結構，削弱細胞間黏附和極性，而過度表達 ERM 蛋白則可逆轉上述過程[8-10]。進一步研究發現，ERM 蛋白可能通過與肌動蛋白和膜蛋白結合參與 EMT 過程中的細胞骨架重建。埃茲蛋白（ezrin）作為 ERM 家族一員，是真核細胞內廣泛表達的一種膜-細胞骨架連接蛋白，與肌動蛋白細胞骨架重塑、細胞侵襲和轉移過程密切相關[11-15]。據此，我們在離體水平研究 ezrin 在轉化生長因子-β（TGF-β）誘導的支氣管上皮細胞 EMT 過程中的作用，旨在為深入理解慢阻肺、支氣管哮喘等疾病中氣道重塑的病理生理機制、探討新的臨床治療靶標提供理論基礎。
1 材料與方法
1.1 材料
人支氣管上皮細胞系（16HBE）來源于北京腫瘤研究所。胎牛血清（FBS）購自美國 Sciencell 公司。ezrin、上皮鈣黏著蛋白（E-cadherin）、α-平滑肌動蛋白（α-SMA）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體均購自美國 Cell Signaling Technology 公司。TGF-β 購自美國 peprotech 中國分公司。人重組 ezrin 蛋白購自北京義翹神州生物科技有限公司。帶有綠色熒光蛋白（GFP）的小發夾 RNA（shRNA）和 ezrin-shRNA 的慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司。PrimeScriptTM 逆轉錄試劑盒和 SuperReal qPCR PreMix（SYBR Green）購自日本 Takara 公司。GAPDH、ezrin、E-cadherin、波形蛋白（vimentin）和 a-SMA 引物由 Invitrogen 公司合成（表 1）。
表1
GAPDH、ezrin、E-cadherin、vimentin 和 a-SMA 引物
1.2 方法
1.2.1 細胞培養 1640 培養基（含 10% FBS 和 1% 雙抗）重懸，將 16HBE 細胞放置在 37 ℃ 細胞培養箱中，2 d 左右換液，待細胞密度達到 90% 左右時進行傳代和凍存。細胞處理前需饑餓 6～12 h。根據操作手冊將帶有 GFP-shRNA 或 ezrin-shRNA 的慢病毒轉染 16HBE 細胞以構建 ezrin 表達缺失的體外模型，24 h 后換液，第 3 d 熒光顯微鏡觀察病毒轉染情況，實時熒光定量 PCR（RT-PCR）和蛋白質印跡試驗（Western blot）檢測 ezrin 敲減效果，同時用 30 ng/ml TGF-β 刺激正常 16HBE 72 h 作為陽性對照。
1.2.2 RT-PCR 用不同濃度 TGF-β（5、30、100 ng/ml）處理細胞 6 h 以及不同濃度重組蛋白 ezrin（20、100、200 ng/ml）處理細胞 12 h，以不加任何干預措施的細胞為對照組。移去培養基，預冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗細胞后，每孔加入 1 ml 的 Trizol 提取細胞總 RNA，逆轉錄后加入 SYBR Green 行 RT-PCR。反應條件為：預變性 95 ℃ 30 s→變性 95 ℃ 5 s→退火 60 ℃ 30 s→延伸 72 ℃ 10 min，共 40 個循環。最后以 GAPDH 為內參，計算 2 （–△△CT），比較目的基因的相對表達量。
1.2.3 Western blot 分別用 30 ng/ml TGF-β、外源性 ezrin（20、100、200 ng/ml）處理細胞 24 h 后，經 PBS 洗 2 次，用胰酶消化后收集細胞，用裂解液提取總蛋白，制備聚丙烯酰胺凝膠，80/120 V 恒壓電泳，300 mA 恒流轉移至聚偏二氟乙烯膜上，5% 脫脂奶粉-洗滌緩沖液室溫封閉 1 h，加入 ezrin、E-cadherin、α-SMA 及 GAPDH 抗體 4 ℃ 孵育過夜，洗滌緩沖液洗滌后，羊抗兔二抗室溫 1 h。在 Molecular Imager ChemiDocTMXRS+凝膠數字成像系統下，用電化學發光液曝光成像，以 GAPDH 為內參，比較各蛋白的相對表達量。
1.2.4 細胞免疫熒光試驗 24 孔板中分別加入 200 ng/ml 重組蛋白 ezrin、30 ng/ml TGF-β 處理 16HBE 24 h，以不加干預措施的 16HBE 為對照組。先用 4% 的多聚甲醛固定細胞，0.2% Triton X-100 破膜，10% 的山羊血清封閉。接著用 10% 山羊血清稀釋 E-cadherin 一抗（1︰100），每孔加入 10 μl 后放入 4 ℃ 冰箱過夜。第 2 d 搖床孵育異硫氰酸熒光素標記的熒光二抗（1︰200），4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核后于熒光顯微鏡下觀察拍照。
1.3 統計學方法
結果以均值±標準差（ ）表示，使用 Graphpad 統計軟件進行分析處理，兩組間差異分析采用成組 t 檢驗，多組間差異分析選用單因素方差分析結合最小顯著差法進行。P≤0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 TGF-β 抑制 16HBE 中 ezrin 的表達
TGF-β（30、100 ng/ml）可明顯下調 16HBE 中 ezrin 的 mRNA 水平（P<0.001，圖 1）。24 h 后 ezrin 蛋白水平也開始下降，同對照組相比差異有統計學意義（P<0.01，圖 2）。
圖1
不同濃度 TGF-β 對 16HBE 中 ezrin mRNA 水平的 影響
圖2
Western blot 檢測 16HBE 中 ezrin 蛋白水平 a. Western blot 檢測像； b. ezrin 蛋白相對表達量
2.2 ezrin 表達缺失促進 16HBE 發生 EMT
敲減 ezrin 后，同 TGF-β 刺激 16HBE 引起形態改變一樣，細胞由典型的多邊鋪路石樣變為長梭形，呈間質細胞樣改變（圖 3）。其上皮細胞標志蛋白 E-cadherin 的表達下降，間質細胞標志蛋白 vimentin 和 α-SMA 的表達升高（圖 4、5）。
圖3
體外培養細胞倒置顯微鏡像（×100，×200） 16HBE 對照組和病毒轉染 16HBE 陰性對照組的培養細胞呈多邊鋪路石樣，而 30 ng/ml TGF-β 刺激組和 ezrin 敲減組的培養細胞呈長梭形（黑箭）
圖4
ezrin 敲減對 16HBE 中 vimentin 和 α-SMA mRNA 水平的影響 a. vimentin mRNA 水平； b. α-SMA mRNA 水平
圖5
Western blot 檢測 E-cadherin 和 α-SMA 蛋白水平 a. Western blot 檢測像； b. E-cadherin 蛋白相對表達量； c. α-SMA 蛋白相對表達量
2.3 外源性 ezrin 抑制 16HBE 的 EMT 進程
同 TGF-β 組相反，加入重組蛋白 ezrin 可以上調 16HBE 細胞 E-cadherin mRNA 和蛋白表達，下調 vimentin 和 α-SMA 的表達水平，并呈濃度依賴性（圖 6、7）。免疫熒光結果表明 E-cadherin 在外源性 200 ng/ml ezrin 作用下表達增加，在 30 ng/ml TGF-β 作用下表達降低（圖 8）。
圖6
外源性 ezrin 對 16HBE 的 E-cadherin、vimentin 和 α-SMA mRNA 水平的影響 a. E-cadherin mRNA 水平； b. vimentin mRNA 水平； c. α-SMA mRNA 水平
圖7
Western blot 檢測 E-cadherin 和 α-SMA 的蛋白水平 a. Western blot 檢測像； b. E-cadherin 蛋白相對表達量； c. α-SMA 蛋白相對表達量
圖8
E-cadherin 表達的細胞免疫熒光檢測像（×200）
3 討論
Ezrin 又稱細胞絨毛蛋白，1983 年由 Bretscher[16]在雞的小腸上皮細胞刷狀緣內首次純化出來并命名，在細胞膜蛋白與肌動蛋白骨架之間起到橋梁的作用。其主要分布在胃腸道、肺和腎臟[17]，多表達于絨毛、細胞皺褶等肌動蛋白比較豐富的上皮細胞表面。Ezrin 有 3 個結構域，分別是高度保守的與細胞膜連接的 N 端 FERM 區、α 螺旋區及 C 端的肌動蛋白結合區。非活化狀態的 ezrin 可以通過 C 端的蘇氨酸磷酸化和N端與磷脂酰肌醇二磷酸的結合這兩種途徑達到活化狀態[18-20]。此外，ezrin 也可被某些細胞因子激活，膜蛋白通過與其胞外結構域和配體將胞外信號傳遞到胞內信號，進而參與細胞的有絲分裂、增殖、黏附及遷移等生理病理過程[18-20]。
有報道發現在骨肉瘤細胞中 ezrin 及磷酸化 ezrin 水平增加[21]。也有研究發現 ezrin 在 8 種人乳腺癌細胞系間表達無明顯差異[22]。用 TGF-β 刺激非小細胞肺癌細胞系，結果顯示其 ezrin 總體水平無顯著性變化，但在細胞中的表達部位發生了重新分布[23]。在本實驗中，TGF-β 可以下調 16HBE 中 ezrin 的表達水平，提示 ezrin 在不同的細胞表型和刺激狀態下表達水平和激活后發揮的作用可能有所不同。
被激活后的 ezrin 蛋白由細胞膜進入細胞質，C 端可與細胞骨架的肌動蛋白相連，N 端則通過與 E-cadherin、細胞間黏附分子、透明質酸受體、鈉氫交換體等膜蛋白相互連接來調節細胞-細胞及細胞-細胞外基質之間的黏附[20]。其中，E-cadherin 是這種細胞表面復合體的重要組分。在 EMT 過程中，E-cadherin 表達下調，導致細胞間的黏附功能下降，細胞遷移能力增加[24]。實驗中我們發現，敲減 ezrin 后 E-cadherin 表達明顯下降，加入重組 ezrin 蛋白后 E-cadherin 表達上升，提示 ezrin 可能在維持支氣管上皮細胞間及支氣管上皮細胞與細胞外基質間的黏附連接中扮演重要角色。
Ezrin 也可通過與肌動蛋白和膜蛋白結合參與細胞骨架重建，在 EMT 機制的調控中發揮作用。有報道稱 EMT 伴有骨架蛋白重構，原在胞膜下主要由皮層肌動蛋白形成的厚的板樣結構消失，轉而在胞漿中形成粗大的束狀應力纖維，沿細胞長軸縱行排列，而且在某些細胞邊緣形成了片狀偽足和絲狀偽足[6, 25]。也有研究發現正常大鼠的氣道平滑肌細胞只有少量短而細的應力纖維，無絲狀偽足，而哮喘大鼠的氣道平滑肌細胞則發生伸展，應力纖維形成增多，可見偽足形成，提示存在細胞骨架重構[26]。肌動蛋白細胞骨架已經被認為是細胞因子等細胞外信號啟動和調節細胞內信號時首要的靶蛋白[27]。TGF-β 是誘導 EMT 效應最強的細胞因子，可以啟動并完成整個 EMT 過程[28-29]。當上皮細胞受 TGF-β 刺激后，上皮細胞間黏附和極性消失，細胞骨架重建，由典型的鵝卵石樣變為成纖維細胞樣，伴有多個突起[30-31]。也有實驗發現 TGF-β 刺激人肺腺癌細胞 48 h 后，ezrin 蛋白的分布發生變化，由胞膜及細胞表面的微絨毛處進入胞質，進而細胞骨架重排，形成束狀纖維樣結構，最終導致細胞表型的改變[32]。當我們將 ezrin 敲減后，出現了和 TGF-β 刺激 16HBE 后相同的細胞形態學改變：16HBE 由經典的鋪路石狀變成長梭形，提示 TGF-β 可能通過下調 ezrin 引起細胞骨架的重塑，促進 16HBE 發生 EMT。
vimentin 和 α-SMA 是細胞骨架的重要成分，也是常見的間充質細胞表型標志物。前者與細胞遷移能力相關，其表達上調通常伴隨 E-cadherin 的減少；后者則具有收縮潛能和較強的膠原合成能力，兩者在 TGF-β 誘導 EMT 過程中表達都明顯增多[24, 33]。當我們敲減 ezrin 后，vimentin 和 α-SMA 表達均明顯上升，加入外源性 ezrin 后兩者水平有所下調。據此我們推測：TGF-β 通過抑制支氣管上皮細胞中 ezrin 表達，影響骨架蛋白 vimentin 和 α-SMA 的表達，進而引起 EMT。
近年來，越來越多的研究證實 TGF-β 誘導 EMT 過程由 Smad 經典通路和多條非 Smad 經典通路共同參與，這些通路間同時還存在交互通話，使其分子機制變得異常復雜[34-35]。Rho 樣 GTP 酶信號通路（非 Smad 經典通路）在 TGF-β 導致 EMT 過程中細胞間緊密連接分解和肌動蛋白骨架重組中起重要作用。其中 RhoA 是 TGF-β 誘導 EMT 過程中的關鍵分子。RhoA 被 TGF-β 激活后能誘導上皮細胞中應力纖維的形成和間質特征的出現[35-37]。也有報道發現 ezrin 蛋白可作為 RhoGTP 的上游和下游活化因子，通過募集 Rho 家族的正負調節因子在 RhoGTP 的活化中起關鍵作用[27]。據此我們推測，TGF-β 可能不僅僅在早期利用下調總 ezrin 表達量影響膜蛋白 E-cadherin 以及骨架蛋白 vimentin 和 α-SMA 的表達促進 EMT，同時也極有可能通過激活支氣管上皮細胞中的 ezrin 使 RhoGTP（尤其是 RhoA）過度表達，通過 TGF-β-ezrin-RhoA 這一信號通路推動上皮向間充質轉化。
ezrin 作為細胞骨架結合蛋白參與 TGF-β 誘導的支氣管上皮細胞 EMT 過程，本研究結果為靶向保護支氣管上皮細胞提供了新靶點。ezrin 在氣道重塑中的具體機制以及是否可將 ezrin 作為臨床上早期預測氣道重塑的生物標志物將成為我們下一步研究的目標。
