引用本文： 王萌萌, 韓鋒鋒. Parkin依賴的線粒體自噬在慢性阻塞性肺疾病中的研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(6): 628-631. doi: 10.7507/1671-6205.2016144 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種臨床常見的慢性呼吸系統疾病，以不可逆的氣流受限和肺氣腫為重要特征，病程長且遷延不愈，死亡率較高。近年來，自噬在慢阻肺的發生發展中的作用受到越來越多的關注。自噬根據其底物的不同，來區分各種不同類型的選擇性自噬，如線粒體自噬(mitophagy)、內質網自噬(reticulophagy)、過氧化物酶體自噬(pexophagy)等，其中線粒體自噬是一種選擇性清除受損線粒體的特異性自噬過程，或者說是一種選擇性清除受損或多余線粒體的自噬現象。Parkin依賴的線粒體自噬途徑是線粒體自噬最重要的分子機制。最新研究表明，Parkin依賴的線粒體自噬影響慢阻肺的發生發展。
一 Parkin依賴的線粒體自噬
1.線粒體自噬：線粒體(mitochondria)不僅是機體的供能單位，而且是一種不斷進行著融合、分裂的高活動性細胞器。線粒體融合、分裂的動態變化是線粒體呼吸供能的基礎。線粒體分裂與細胞凋亡和線粒體自噬的關系密切，線粒體融合與線粒體分裂的作用正好相反[1]。線粒體的呼吸作用可以產生大量副產物：活性氧類(reactive oxygen species，ROS)如過氧化氫，超氧和羥自由基，ROS可以啟動一系列氧化損傷反應，攻擊蛋白質、脂類和核酸[2]。氧化損傷能夠破壞線粒體膜蛋白，使線粒體DNA發生突變，突變的DNA翻譯異常蛋白質增加，異常蛋白質進一步發生錯誤折疊并聚集，同時非特異性水孔通道大量開放，水孔通道的開放致使線粒體通透性發生轉變(mitochondrion permeability transition，MPT)[2]。MPT能夠引起線粒體腫脹、功能失調，氧化磷酸化解偶聯作用增強，細胞色素c釋放增加并激活蛋白酶，從而導致細胞凋亡增加，最終也會導致細胞壞死增加[2]。
線粒體自噬是一種選擇性清除受損或著多余線粒體的自噬現象，指在ROS、營養缺乏、細胞衰老等外界刺激的作用下，細胞內線粒體發生去極化并出現損傷，受損線粒體被選擇性地包裹進入自噬體中，并與溶酶體融合，從而完成受損線粒體的降解清除，對維持細胞內環境的穩定具有至關重要的作用[3-5]。
線粒體自噬的發生與執行過程受到多種因子的精密調節。比如胞質的Parkin、哺乳動物細胞線粒體外膜蛋白PINK1、NIX和自噬相關分子(Atg32、Atg33、Uth1和Aup1等)等，都在線粒體自噬中起著關鍵作用。線粒體自噬的發生與執行除受自噬相關性因子的調控外，還依賴于線粒體自身的信號調控[6]。
2.Parkin：Parkin是一種多數位于細胞質、少數位于線粒體的E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin ligase)，是基因編碼的一個具有465個氨基酸殘基的蛋白質，其結構主要包括一個N端泛素樣(ubiquitin like，UBL)結構域和4個富含半胱氨酸并能與鋅結合的RING結構域，四個RING結構域分別是RING0、RING1、RING2和IBR (in between-RING)[7]，Parkin的這四個結構域內的突變都會影響線粒體自噬的執行。Parkin可由PINK1激酶活化，活化的Parkin使受損線粒體的陰離子電位通道蛋白VDAC1泛素化后，被信號接頭蛋白p62/SQSTM1識別，信號接頭蛋白再與吞噬體膜(phagophore)表面的Atg8家族同源蛋白(如LC3A-C、GATE-16等)連接進而啟動線粒體的降解過程。與Parkin密切聯系的PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)則是一種編碼581個氨基酸的蛋白激酶，其結構主要包括絲/蘇氨酸激酶結構域和緊鄰轉膜區的N末端線粒體目標信號(mitochondrial targeting signal，MTS)結構域[8]。
Parkin和PINK1蛋白的聯合作用能夠調控線粒體融合和分裂的動態變化，并介導受損的線粒體選擇性地被自噬降解，稱為PINK1/Parkin介導的線粒體自噬(PINK1/Parkin-mediated mitophagy)[9-12]，PINK1或Parkin突變則會抑制線粒體自噬的執行[13]。
3.Parkin依賴的線粒體自噬：最初，Parkin與PINK1在線粒體自噬中的共同作用的研究對象是果蠅，研究結果表明了Parkin和PINK1在維持線粒體內穩態方面共同發揮作用。之后的交叉補救實驗結果又說明了Parkin位于PINK1的下游，并且還印證了PINK1、Parkin在同一疾病的機制通路中發生相互作用。隨后關于果蠅的研究及人工培養哺乳動物細胞的研究證實了Parkin與PINK1的相互作用是可以促進線粒體自噬[14-18]，表明Parkin與PINK1在線粒體自噬中有著密切的聯系。2010年Narendra等[19]在研究中發現，PINK1進入正常線粒體中幾乎立即被溶解清除，造成PINK1缺乏的假象，但PINK1在藥物導致受損的線粒體中的溶解清除受到抑制。2012年Youle等[1]概述了PINK1導入到線粒體及其退化消耗的分子機制，指出PINK1降解清除與否取決于線粒體的功能狀態。在受損線粒體中，PINK1只是線粒體自噬的信號激酶，而在正常線粒體中，PINK1可立即降解消失[19]。去極化的線粒體解偶聯劑羰基氰對三氟甲氧基苯腙(carbonyl cyanide p-trifluoromethyl phenylhydrazone，FCCP)和Parkin的線粒體易位誘導劑羰基氰化間氯苯腙(carbonyl cyanide chloropheny hydrazone，CCCP)能夠促進Parkin從胞質易位到線粒體。在PINK1嚴重缺陷的細胞里Parkin很難易位到去極化的線粒體[17-20]。2015年Dorn[21]指出，在不同病理生理條件下，PINK1-Parkin途徑可能有多個觸發器，然而目前這些相關的觸發器尚未十分明確。
2010年，Geisler等[13]完整地報道了PINK1/Parkin介導的線粒體自噬在帕金森病發生中的作用及其分子機制。線粒體膜在外界刺激的作用下發生去極化，促使PINK1穩定在外膜上，PINK1通過其激酶活性募集Parkin易位到線粒體，Parkin對于接下來線粒體自噬的執行至關重要[22]。在Parkin蛋白的四個結構域中，RING0主要負責Parkin易位到受損的線粒體，RING1調控并識別線粒體底物蛋白，RING2的E3泛素酶活性，對Parkin的易位和線粒體的泛素化標記都有很重要的作用，Parkin蛋白的任一區域的突變均會影響線粒體自噬的活性。因此，這個過程并不是自然隨機發生，而是具有選擇性的。Parkin完整的結構基礎對線粒體自噬的正常執行具有重要的意義[7, 23]。
二 慢阻肺中Parkin依賴的線粒體自噬
慢阻肺是一種臨床常見的慢性呼吸系統疾病，以不可逆的氣流受限和肺氣腫為重要特征，病程長且遷延不愈，死亡率較高。而吸煙是慢阻肺最重要的病因，2015年Ahmad等[24]指出煙熏能夠誘導線粒體自噬受損，導致細胞衰老，進而影響慢阻肺的發生發展。香煙煙霧(cigarette smoke，CS)誘導的細胞衰老是慢阻肺的發病機制之一，慢阻肺患者肺氣道結構細胞的變化顯示了CS能夠誘導細胞衰老增加[25-27]。
CS可誘導細胞發生衰老的肺氣道結構細胞包括人肺成纖維細胞(HFL1細胞)、支氣管上皮細胞和小氣道上皮細胞(small airway epithelial cells，SAECs)[25, 28-30]。在SAECs中，CS能夠導致損傷的線粒體向核周聚集，也能夠誘導細胞質中p53蓄積，p53與Parkin相互作用，使得易位到線粒體的Parkin減少，線粒體自噬的執行受到影響。在肺氣腫小鼠(CS暴露6個月，總顆粒物質100 mg/m3)、慢性吸煙者和慢阻肺患者的肺中，Parkin不能夠正常易位到損傷的線粒體，細胞衰老增加。Parkin過表達則可以增加果蠅的壽命，這證實了Parkin過表達通過激活線粒體自噬來減少氧化應激。在Parkin過表達的細胞中，受損的線粒體自噬可以在一定程度上得到恢復，受損線粒體的數量減少，細胞衰老得到適當延緩[31-32]。
越來越多的研究證明了線粒體功能障礙在肺疾病中具有重要作用[3, 33-35]。CS能夠使肺氣道結構細胞中線粒體產生ROS增加，ROS啟動氧化損傷連鎖反應，進而導致細胞衰老增加[36-38]。香煙煙霧提取物(CSE)能夠誘導人類平滑肌細胞線粒體分裂，這可能會導致慢阻肺、肺氣腫患者的肺氣道結構細胞死亡[39]，長期的CSE處理也能夠使人肺上皮細胞中線粒體融合活性增加[40]。這些都表明了CSE誘導線粒體結構變化進而影響細胞正常功能。
Ahmad等[24]指出CSE可以導致線粒體持久的功能障礙，CSE能夠改變Parkin水平，影響其正常易位，導致線粒體自噬執行缺陷。利用蛋白免疫印跡試驗(Western blot)和免疫熒光方法測定CSE誘導的細胞衰老過程中線粒體自噬通路相關蛋白，結果表明線粒體中PINK1穩定增加。在分離的線粒體實驗中，雖然在CSE處理的HFL1細胞和正常HFL1細胞之間，總Parkin水平并沒有顯著性差異，但是CCCP處理的正常HFL1細胞中Parkin易位到線粒體增加，而在CCCP誘導的CSE處理的HFL1細胞中Parkin易位到線粒體減少，說明CSE能夠導致線粒體自噬受損。另一方面CSE誘導下細胞質內增加的p53與Parkin相互作用，也抑制了Parkin易位到線粒體，從而抑制線粒體自噬[41]。在CSE處理的SAECs中，Parkin過表達可以恢復正常的線粒體自噬并延遲細胞衰老，但對于CS誘導的已經存在的細胞衰老沒有顯著影響[31-32]。結果表明，線粒體自噬在慢阻肺的發生發展中起著至關重要的作用。
三 小結與展望
近年來線粒體自噬在慢阻肺中的作用受到越來越多的關注。線粒體自噬通過選擇性清除受損線粒體，維持線粒體數量和質量的穩定，進而為細胞發揮正常生理功能提供重要保證。研究表明，Parkin依賴的線粒體自噬在慢阻肺中具有一定作用，通過抑制CS導致的細胞衰老來影響慢阻肺的疾病發展。但是，現階段的研究結果只部分揭示了Parkin依賴的線粒體自噬在慢阻肺中發揮的作用，而在慢阻肺與Parkin相關聯的蛋白、分子甚至機制通路等的相關研究很少，提示我們應加強對線粒體自噬相關分子機制的基礎研究，觀察并進一步研究Parkin依賴的線粒體自噬改變與慢阻肺發生和發展的關系。更重要的是，Parkin依賴的線粒體自噬也為慢阻肺的臨床治療提供了新的思路。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是一種臨床常見的慢性呼吸系統疾病，以不可逆的氣流受限和肺氣腫為重要特征，病程長且遷延不愈，死亡率較高。近年來，自噬在慢阻肺的發生發展中的作用受到越來越多的關注。自噬根據其底物的不同，來區分各種不同類型的選擇性自噬，如線粒體自噬(mitophagy)、內質網自噬(reticulophagy)、過氧化物酶體自噬(pexophagy)等，其中線粒體自噬是一種選擇性清除受損線粒體的特異性自噬過程，或者說是一種選擇性清除受損或多余線粒體的自噬現象。Parkin依賴的線粒體自噬途徑是線粒體自噬最重要的分子機制。最新研究表明，Parkin依賴的線粒體自噬影響慢阻肺的發生發展。
一 Parkin依賴的線粒體自噬
1.線粒體自噬：線粒體(mitochondria)不僅是機體的供能單位，而且是一種不斷進行著融合、分裂的高活動性細胞器。線粒體融合、分裂的動態變化是線粒體呼吸供能的基礎。線粒體分裂與細胞凋亡和線粒體自噬的關系密切，線粒體融合與線粒體分裂的作用正好相反[1]。線粒體的呼吸作用可以產生大量副產物：活性氧類(reactive oxygen species，ROS)如過氧化氫，超氧和羥自由基，ROS可以啟動一系列氧化損傷反應，攻擊蛋白質、脂類和核酸[2]。氧化損傷能夠破壞線粒體膜蛋白，使線粒體DNA發生突變，突變的DNA翻譯異常蛋白質增加，異常蛋白質進一步發生錯誤折疊并聚集，同時非特異性水孔通道大量開放，水孔通道的開放致使線粒體通透性發生轉變(mitochondrion permeability transition，MPT)[2]。MPT能夠引起線粒體腫脹、功能失調，氧化磷酸化解偶聯作用增強，細胞色素c釋放增加并激活蛋白酶，從而導致細胞凋亡增加，最終也會導致細胞壞死增加[2]。
線粒體自噬是一種選擇性清除受損或著多余線粒體的自噬現象，指在ROS、營養缺乏、細胞衰老等外界刺激的作用下，細胞內線粒體發生去極化并出現損傷，受損線粒體被選擇性地包裹進入自噬體中，并與溶酶體融合，從而完成受損線粒體的降解清除，對維持細胞內環境的穩定具有至關重要的作用[3-5]。
線粒體自噬的發生與執行過程受到多種因子的精密調節。比如胞質的Parkin、哺乳動物細胞線粒體外膜蛋白PINK1、NIX和自噬相關分子(Atg32、Atg33、Uth1和Aup1等)等，都在線粒體自噬中起著關鍵作用。線粒體自噬的發生與執行除受自噬相關性因子的調控外，還依賴于線粒體自身的信號調控[6]。
2.Parkin：Parkin是一種多數位于細胞質、少數位于線粒體的E3泛素蛋白連接酶(E3 ubiquitin ligase)，是基因編碼的一個具有465個氨基酸殘基的蛋白質，其結構主要包括一個N端泛素樣(ubiquitin like，UBL)結構域和4個富含半胱氨酸并能與鋅結合的RING結構域，四個RING結構域分別是RING0、RING1、RING2和IBR (in between-RING)[7]，Parkin的這四個結構域內的突變都會影響線粒體自噬的執行。Parkin可由PINK1激酶活化，活化的Parkin使受損線粒體的陰離子電位通道蛋白VDAC1泛素化后，被信號接頭蛋白p62/SQSTM1識別，信號接頭蛋白再與吞噬體膜(phagophore)表面的Atg8家族同源蛋白(如LC3A-C、GATE-16等)連接進而啟動線粒體的降解過程。與Parkin密切聯系的PINK1(PTEN-induced putative kinase 1)則是一種編碼581個氨基酸的蛋白激酶，其結構主要包括絲/蘇氨酸激酶結構域和緊鄰轉膜區的N末端線粒體目標信號(mitochondrial targeting signal，MTS)結構域[8]。
Parkin和PINK1蛋白的聯合作用能夠調控線粒體融合和分裂的動態變化，并介導受損的線粒體選擇性地被自噬降解，稱為PINK1/Parkin介導的線粒體自噬(PINK1/Parkin-mediated mitophagy)[9-12]，PINK1或Parkin突變則會抑制線粒體自噬的執行[13]。
3.Parkin依賴的線粒體自噬：最初，Parkin與PINK1在線粒體自噬中的共同作用的研究對象是果蠅，研究結果表明了Parkin和PINK1在維持線粒體內穩態方面共同發揮作用。之后的交叉補救實驗結果又說明了Parkin位于PINK1的下游，并且還印證了PINK1、Parkin在同一疾病的機制通路中發生相互作用。隨后關于果蠅的研究及人工培養哺乳動物細胞的研究證實了Parkin與PINK1的相互作用是可以促進線粒體自噬[14-18]，表明Parkin與PINK1在線粒體自噬中有著密切的聯系。2010年Narendra等[19]在研究中發現，PINK1進入正常線粒體中幾乎立即被溶解清除，造成PINK1缺乏的假象，但PINK1在藥物導致受損的線粒體中的溶解清除受到抑制。2012年Youle等[1]概述了PINK1導入到線粒體及其退化消耗的分子機制，指出PINK1降解清除與否取決于線粒體的功能狀態。在受損線粒體中，PINK1只是線粒體自噬的信號激酶，而在正常線粒體中，PINK1可立即降解消失[19]。去極化的線粒體解偶聯劑羰基氰對三氟甲氧基苯腙(carbonyl cyanide p-trifluoromethyl phenylhydrazone，FCCP)和Parkin的線粒體易位誘導劑羰基氰化間氯苯腙(carbonyl cyanide chloropheny hydrazone，CCCP)能夠促進Parkin從胞質易位到線粒體。在PINK1嚴重缺陷的細胞里Parkin很難易位到去極化的線粒體[17-20]。2015年Dorn[21]指出，在不同病理生理條件下，PINK1-Parkin途徑可能有多個觸發器，然而目前這些相關的觸發器尚未十分明確。
2010年，Geisler等[13]完整地報道了PINK1/Parkin介導的線粒體自噬在帕金森病發生中的作用及其分子機制。線粒體膜在外界刺激的作用下發生去極化，促使PINK1穩定在外膜上，PINK1通過其激酶活性募集Parkin易位到線粒體，Parkin對于接下來線粒體自噬的執行至關重要[22]。在Parkin蛋白的四個結構域中，RING0主要負責Parkin易位到受損的線粒體，RING1調控并識別線粒體底物蛋白，RING2的E3泛素酶活性，對Parkin的易位和線粒體的泛素化標記都有很重要的作用，Parkin蛋白的任一區域的突變均會影響線粒體自噬的活性。因此，這個過程并不是自然隨機發生，而是具有選擇性的。Parkin完整的結構基礎對線粒體自噬的正常執行具有重要的意義[7, 23]。
二 慢阻肺中Parkin依賴的線粒體自噬
慢阻肺是一種臨床常見的慢性呼吸系統疾病，以不可逆的氣流受限和肺氣腫為重要特征，病程長且遷延不愈，死亡率較高。而吸煙是慢阻肺最重要的病因，2015年Ahmad等[24]指出煙熏能夠誘導線粒體自噬受損，導致細胞衰老，進而影響慢阻肺的發生發展。香煙煙霧(cigarette smoke，CS)誘導的細胞衰老是慢阻肺的發病機制之一，慢阻肺患者肺氣道結構細胞的變化顯示了CS能夠誘導細胞衰老增加[25-27]。
CS可誘導細胞發生衰老的肺氣道結構細胞包括人肺成纖維細胞(HFL1細胞)、支氣管上皮細胞和小氣道上皮細胞(small airway epithelial cells，SAECs)[25, 28-30]。在SAECs中，CS能夠導致損傷的線粒體向核周聚集，也能夠誘導細胞質中p53蓄積，p53與Parkin相互作用，使得易位到線粒體的Parkin減少，線粒體自噬的執行受到影響。在肺氣腫小鼠(CS暴露6個月，總顆粒物質100 mg/m3)、慢性吸煙者和慢阻肺患者的肺中，Parkin不能夠正常易位到損傷的線粒體，細胞衰老增加。Parkin過表達則可以增加果蠅的壽命，這證實了Parkin過表達通過激活線粒體自噬來減少氧化應激。在Parkin過表達的細胞中，受損的線粒體自噬可以在一定程度上得到恢復，受損線粒體的數量減少，細胞衰老得到適當延緩[31-32]。
越來越多的研究證明了線粒體功能障礙在肺疾病中具有重要作用[3, 33-35]。CS能夠使肺氣道結構細胞中線粒體產生ROS增加，ROS啟動氧化損傷連鎖反應，進而導致細胞衰老增加[36-38]。香煙煙霧提取物(CSE)能夠誘導人類平滑肌細胞線粒體分裂，這可能會導致慢阻肺、肺氣腫患者的肺氣道結構細胞死亡[39]，長期的CSE處理也能夠使人肺上皮細胞中線粒體融合活性增加[40]。這些都表明了CSE誘導線粒體結構變化進而影響細胞正常功能。
Ahmad等[24]指出CSE可以導致線粒體持久的功能障礙，CSE能夠改變Parkin水平，影響其正常易位，導致線粒體自噬執行缺陷。利用蛋白免疫印跡試驗(Western blot)和免疫熒光方法測定CSE誘導的細胞衰老過程中線粒體自噬通路相關蛋白，結果表明線粒體中PINK1穩定增加。在分離的線粒體實驗中，雖然在CSE處理的HFL1細胞和正常HFL1細胞之間，總Parkin水平并沒有顯著性差異，但是CCCP處理的正常HFL1細胞中Parkin易位到線粒體增加，而在CCCP誘導的CSE處理的HFL1細胞中Parkin易位到線粒體減少，說明CSE能夠導致線粒體自噬受損。另一方面CSE誘導下細胞質內增加的p53與Parkin相互作用，也抑制了Parkin易位到線粒體，從而抑制線粒體自噬[41]。在CSE處理的SAECs中，Parkin過表達可以恢復正常的線粒體自噬并延遲細胞衰老，但對于CS誘導的已經存在的細胞衰老沒有顯著影響[31-32]。結果表明，線粒體自噬在慢阻肺的發生發展中起著至關重要的作用。
三 小結與展望
近年來線粒體自噬在慢阻肺中的作用受到越來越多的關注。線粒體自噬通過選擇性清除受損線粒體，維持線粒體數量和質量的穩定，進而為細胞發揮正常生理功能提供重要保證。研究表明，Parkin依賴的線粒體自噬在慢阻肺中具有一定作用，通過抑制CS導致的細胞衰老來影響慢阻肺的疾病發展。但是，現階段的研究結果只部分揭示了Parkin依賴的線粒體自噬在慢阻肺中發揮的作用，而在慢阻肺與Parkin相關聯的蛋白、分子甚至機制通路等的相關研究很少，提示我們應加強對線粒體自噬相關分子機制的基礎研究，觀察并進一步研究Parkin依賴的線粒體自噬改變與慢阻肺發生和發展的關系。更重要的是，Parkin依賴的線粒體自噬也為慢阻肺的臨床治療提供了新的思路。