引用本文： 宋麗娟, 朱煜, 金鳴. 羥基紅花黃色素A抑制脂多糖誘導的急性肺損傷小鼠炎癥因子表達的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(6): 577-582. doi: 10.7507/1671-6205.2016132 復制
急性肺損傷(ALI)指機體受到嚴重感染、創傷、休克等打擊后，出現彌漫性肺泡毛細血管膜損傷，導致肺水腫、微肺不張，毛細血管通透性增加，并同時引發肺部炎癥反應。ALI是現代危重醫學的一大難題，重癥ALI即為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。各種致病因子作用于靶細胞受體，激活細胞內有關的信號轉導，啟動炎癥介質的大量表達和釋放，損傷肺泡上皮細胞及血管內皮細胞而導致呼吸膜彌散功能下降，這是ALI的重要病理機制[1-3]。革蘭陰性細菌感染是引起ALI的常見及主要原因之一，脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌外膜的主要組成部分[3]。
關于ALI的藥物治療，目前國內外多采用傳統抗炎藥物以及多種免疫調節療法等[4]，但在臨床上均未獲得滿意效果[5]，目前臨床治療仍以支持治療為主。近年來，由于多靶點協同及不良反應較輕的優勢，中藥的臨床應用逐漸受到重視。紅花，別名草紅花，為植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，為活血通經、去瘀止痛之良藥。研究表明，紅花黃色素(safflor yellow，SY)是紅花的主要有效部位，羥基紅花黃色素A (hydroxysaffloryellow A，HSYA)是紅花黃色素中含量最高的有效單體成分(約占其含量70%)。日本學者Meselhy等1993年首次確定其結構式，其相對分子質量為612。HSYA具有多種心血管藥理作用，據報道HSYA可以緩解小鼠ALI的病理過程[6]，但HSYA對炎癥信號通路環節的作用還需進一步探討。本研究擬從基因和蛋白水平觀察HSYA對LPS誘導小鼠肺組織Toll樣受體4(TLR4)水平的影響，以及對腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)及IL-6水平的影響，觀察HSYA對ALI小鼠炎癥損傷的緩解作用，從而在動物實驗水平探索HSYA抑制肺部炎癥反應的機制。
材料與方法
一 材料
1.實驗動物：雄性昆明小鼠(Ⅱ級)84只，購自中國醫學科學院 & 北京協和醫科大學實驗動物中心，合格證號0140140，體重18~22 g，動物購回后飼養在北京心肺血管疾病研究所SPF級動物房，適應性喂養1周，實驗期間自由飲水和飲食。
2.試劑：LPS由Sigma公司生產(貨號L2880，批號050M4014)。HSYA采用大孔樹脂-凝膠色譜法制備，純度95.3%。地塞米松(dexamethasone，DXM)磷酸鈉注射液(5 mg/mL)為天津藥業焦作有限公司產品。TLR4引物由北京三博遠志公司合成。Trizol試劑由Invitrogen公司生產。實時定量PCR (RT-PCR)試劑盒由Takara公司生產。Western blot試劑盒由江蘇碧云天生物技術有限公司生產。ELISA試劑盒均購自上海依科賽生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。
二 方法
1.實驗分組和處理：將動物按體重分層隨機分為7組(每組12只)，分別為空白組、LPS組、DXM組(LPS+DXM)、HSYA低劑量組(LPS+HSYA 6 mg/kg)、HSYA中劑量組(LPS+HSYA 15 mg/kg)、HSYA高劑量組(LPS+HSYA 37.5 mg/kg)，以及HSYA對照組(生理鹽水+HSYA 37.5 mg/kg)。除空白組和HSYA對照組外，其余各給藥組小鼠按照15 mg/kg劑量腹腔注射LPS (1 g/L)建立ALI模型。HSYA各劑量給藥組于腹腔注射LPS前30 min經尾靜脈注射HSYA，HSYA劑量分別為6 mg/kg (低劑量)、15 mg/kg (中劑量)和37.5 mg/kg (高劑量)，HSYA低、中、高劑量組分別使用0.6、1.5和3.75 g/L HSYA，從而保證各組注射容量的一致性。HSYA對照組于腹腔注射生理鹽水前30 min經尾靜脈注射高劑量37.5 mg/kg HSYA；DXM組于腹腔注射LPS前30 min經尾靜脈注射陽性對照藥DXM (3 mg/kg)。與各給藥組比較，LPS組以相同體積生理鹽水代替HSYA或DXM經尾靜脈注射，而空白組分別以相同體積生理鹽水替代HSYA或DXM經尾靜脈注射，并以相同體積生理鹽水替代LPS腹腔注射，其他處理均同給藥組。
2.血液及組織標本的采取：腹腔注射LPS或生理鹽水4 h后，戊巴比妥鈉(1%，60 mg/kg)腹腔注射麻醉動物，眶周取血500 μL，37 ℃放置1 h后4 ℃過夜制取血清，3 000 r/min離心5~10 min，收集血清，按一次使用量分裝，保存于-80 ℃。取右肺上中葉放置凍存管中迅速投入液氮，留待RT-qPCR及Western blot檢測。
3.RT-PCR檢測肺組織TLR4的表達：采用Trizol法提取組織RNA，加入Trizol冰浴勻漿。加入氯仿，劇烈振蕩離心，取上清水相。加異丙醇室溫放置10 min，離心棄上清，加入70%乙醇，顛倒混勻，4 ℃離心。小心棄上清，室溫干燥5~10 min。將RNA溶于DEPC水中。取組織RNA 10 μL，加入Oligo (dT)18(0.5 g/ L)1 μL，5×RT buffer 5 μL，dNTP (10 mmol/L)1 μL，M-MLV (200 U/ L)1 μL，用DEPC水補足至25 μL，42 ℃反應1 h，得到cDNA，-20 ℃保存。引物由北京三博遠志公司合成。TLR4引物序列：F：GGCTATCTGTGAGCGTGT；R：GGTTTCTTACTTTCCCTT；產物252 bp。GAPDH引物序列：F：TGCGACTTCAACAGCAACTC；R：ATGTAGGCC ATGAGGTCCAC；產物143 bp。從上述反轉錄產物中取cDNA 1 μL，加入SYBR GREEN熒光染料10 μL，DEPC水8.6 μL，上下游引物10 μmol/L各0.4 μL。PCR擴增條件為：預變性，95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，61 ℃ 34 s，40個循環；融解曲線進行分析。
4.Western blot檢測肺組織TLR4蛋白水平表達：按照試劑盒說明書分別提取組織蛋白，蛋白定量按試劑盒操作(Bradford法)。分別配制12%濃縮膠與5%分離膠。吸取待測蛋白樣品、蛋白Marker加入上樣槽。電泳直至結束。之后電轉1 h，切斷電源。取出NC膜，加入封閉液，室溫封閉1 h。用PBST洗3次，每次5 min，加入特異性一抗，室溫下振搖1.5 h。加入特異性二抗，室溫孵育1 h，之后曝光、顯影、定影。將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統分析目標條帶的光密度(OD)值。
5.ELISA法檢測小鼠外周血中TNF-α、IL-1β及IL-6的水平表達：將標準品以及1 :50 000稀釋的血清樣本加入包被板孔中，24 ℃反應20 min后棄反應液，洗板3次，加入Biotin anti mice IL-6工作液，混勻30 s，24 ℃溫育20 min后洗板3次，每孔加1×HRP工作液，混勻30 s，24 ℃溫育10 min，洗板3次，加入TMB顯色液，輕輕混勻10 s，24 ℃溫育20 min，每孔加入TMB終止液，混勻30 s，15 min內在450 nm處讀OD值。用CurveExpert 1.3軟件繪制標準曲線，根據樣本的OD值在標準曲線上查出對應濃度。IL-1β及TNF-α檢測所用抗體為Biotin anti mice IL-1β和Biotin anti mice TNF-α，其余操作同上。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。實驗結果計量資料以x±s表示，采用方差分析及SNK檢驗法進行統計處理。P < 0.05為差異有統計學意義。
結果
一 HSYA抑制ALI小鼠TLR4 mRNA水平的升高
采用SYBR Green熒光標記物，對ALI小鼠TLR4進行實時定量檢測，結果見圖 1。注射LPS后，LPS組小鼠肺組織的TLR4 mRNA水平較空白組顯著升高(P < 0.01)。與LPS組比較，中、高劑量的HSYA給藥組和DXM組TLR4 mRNA水平明顯下降(P < 0.05)，其中HSYA高劑量組和DXM組TLR4 mRNA指標接近空白組。結果見圖 2。
圖1
GAPDH融解曲線??a.TLR4融解曲線；b.合成曲線；c.標準曲線；d.羧基熒光素標記GAPDH，SYBR2標記TLR4
圖2
HSYA對ALI小鼠肺組織中TLR4 mRNA表達水平的影響
與空白組比較, △△
二 HSYA抑制ALI小鼠TLR4蛋白水平的升高
注射LPS后，LPS組小鼠肺組織的TLR4蛋白水平較空白組顯著升高(P < 0.01)。與LPS組比較，中、高劑量HSYA給藥組TLR4蛋白水平均顯著降低(P < 0.05，P < 0.01)，DXM組TLR4蛋白水平明顯降低(P < 0.01)。結果見圖 3。
圖3
HSYA對ALI小鼠肺組織中TLR4蛋白表達水平的影響
與空白組比較, △△
三 HSYA抑制ALI小鼠外周血炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高
注射LPS后，LPS組小鼠外周血的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平較空白組明顯升高(P < 0.01)，說明LPS刺激了炎癥因子的表達增強。與LPS組比較，HSYA給藥能夠明顯抑制炎癥因子TNF-α(高劑量組)、IL-1β(中、高劑量組)和IL-6(中、高劑量組)的表達(P < 0.05)，且隨著HSYA劑量的增加這一趨勢更加明顯。DXM能顯著抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(P < 0.01)。
討論
ALI是現代危重醫學的一大難題，表現為各種原因引起的急性呼吸困難和頑固性低氧血癥。ALI最主要的特征是過度的炎癥反應，引起彌漫性肺泡毛細血管膜損傷，導致肺水腫、肺不張、毛細血管通透性增加以及肺部氣體交換障礙[3]。膿毒癥是臨床上ALI最常見的病因之一，約占ALI發病原因的35%~45%[3]，因此本研究采用常用的腹腔注射LPS的方法建立內毒素血癥導致ALI的小鼠模型，模擬臨床ALI的發生，并同時觀察HSYA對ALI的治療作用。由于糖皮質激素是臨床上常用的治療ALI的藥物，因此我們選用DXM作為陽性對照藥物，對評價HSYA對ALI的療效有較好的參考意義。
LPS所致ALI動物模型具有與臨床ALI患者相似的幾個重要特征--肺水腫、呼吸功能障礙、肺部大量炎癥細胞浸潤以及早期炎癥介質的過度釋放等。在前期研究中，腹腔注射LPS 4 d后，LPS組動物出現呼吸急促；血氣分析結果提示代謝性酸中毒合并呼吸性酸中毒并且存在低氧血癥；HE染色病理結果顯示肺組織呈現急性炎癥反應過程。這些表現與臨床ALI患者肺部損害及臨床表現相一致，表明我們的ALI動物模型是成功的[6]。
圖4
HSYA對LPS所致ALI小鼠外周血中炎癥因子表達水平的影響
與空白組比較, △△
我們前期研究表明，HSYA能夠減輕ALI小鼠病理損傷，改善動脈血氣，減輕其肺組織水腫以及炎癥細胞浸潤情況[6]。其作用機制可能與HSYA抑制核因子κB (NF-κB)及p38 MAPK信號轉導通路的活化有關。NF-κB與p38 MAPK信號轉導通路的活化被抑制后，相應的炎癥介質、粘附分子等的過高表達也受到抑制，炎性細胞浸潤減少，組織滲出與水腫程度減輕，呼吸功能從而得到明顯改善。本實驗主要是在上述實驗基礎上進一步探索HSYA對該信號通路其他環節的影響，即對LPS的細胞膜靶點TLR4 mRNA和蛋白水平的影響，以及對外周血中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的作用[6]。
Toll樣受體是近年來發現的一類天然免疫受體[7]，屬于模式識別受體[8]，即存在于固有免疫細胞表面能夠直接識別結合病原微生物表面某些共有的特定分子結構的受體[9]，可以識別結合病原微生物表面的配體-病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，如G-菌的LPS，引發一系列的信號轉導，導致炎癥介質的釋放，在天然免疫防御中起著重要的作用[10]。TLR4是目前研究的最多的Toll樣受體[11]，它是靶細胞上LPS進行致炎反應的主要敏感配體，在內毒素性ALI的發生發展中發揮重要作用。本研究發現，LPS所致的小鼠ALI肺部TLR4受體的mRNA及蛋白水平表達較空白組明顯升高，而中高劑量的HSYA能緩解ALI小鼠TLR4水平的升高。TLR4受體經LPS激活后，經早期MyD88依賴性信號轉導通路和遲發性MyD88非依賴性信號轉導通路激活核轉錄因子NF-κB及MAPK通路[12-14]。我們前期研究發現HSYA三個劑量給藥組(6、15、37.5 mg/kg)可以不同程度抑制NF-κB的激活程度、NF-κB p65的核轉位以及p38蛋白的磷酸化。ALI中NF-κB及p38 MAPK的活化均可導致早期炎癥相關因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)的大量釋放，而且這些炎癥因子持續升高是ALI預后不良的一個重要標志[15-16]。
本研究發現HSYA對LPS所致的小鼠ALI炎癥信號通路的初始環節TLR4的mRNA及蛋白水平的升高均有緩解作用，對ALI小鼠外周血中相關炎癥介質的蛋白水平的升高也有抑制作用。HSYA是一種水溶性黃酮類物質[17-18]，它不易通過細胞膜進入細胞，也不太可能在細胞膜存在其特異性載體，故細胞膜很可能是HSYA阻斷病理信號向細胞內轉導、使細胞狀態恢復正常進而緩解肺部損傷作用的重要靶位，但是具體的機制還需要進一步研究[19-20]。
我們前期研究的動物實驗結果表明HSYA能緩解LPS所致的ALI小鼠所見的形態學變化、呼吸功能下降，能抑制NF-κB及p38 MAPK信號轉導通路的活化從而抑制相應炎癥介質的mRNA過高表達，最終緩解小鼠的急性肺損傷。而本研究是在此基礎上進行信號通路環節的完善，發現HSYA對炎癥信號通路的初始環節TLR4的mRNA及蛋白水平的升高均有緩解作用，對ALI小鼠外周血中相關炎癥介質的蛋白水平的升高也有抑制作用。本研究在前期整體水平基礎上進一步揭示了HSYA的治療機制，HSYA很可能是通過作用于肺組織靶細胞膜上，緩解LPS所致的TLR4受體水平的升高，抑制其下游的炎癥信號轉導，緩解相關炎癥因子水平的升高。與傳統抗炎藥DXM比較，HSYA雖然抗炎效果不及DXM，但其多靶點協同控制炎癥的級聯反應以及可能較少的不良反應均使HSYA有潛能作為一種新的治療ALI的藥物應用于臨床，具有較好的應用前景。本研究的不足之處在于沒有對照使用TLR4阻斷劑，從而進一步驗證HSYA可能的作用靶點，這也將是今后我們進一步的研究方向。
急性肺損傷(ALI)指機體受到嚴重感染、創傷、休克等打擊后，出現彌漫性肺泡毛細血管膜損傷，導致肺水腫、微肺不張，毛細血管通透性增加，并同時引發肺部炎癥反應。ALI是現代危重醫學的一大難題，重癥ALI即為急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)。各種致病因子作用于靶細胞受體，激活細胞內有關的信號轉導，啟動炎癥介質的大量表達和釋放，損傷肺泡上皮細胞及血管內皮細胞而導致呼吸膜彌散功能下降，這是ALI的重要病理機制[1-3]。革蘭陰性細菌感染是引起ALI的常見及主要原因之一，脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌外膜的主要組成部分[3]。
關于ALI的藥物治療，目前國內外多采用傳統抗炎藥物以及多種免疫調節療法等[4]，但在臨床上均未獲得滿意效果[5]，目前臨床治療仍以支持治療為主。近年來，由于多靶點協同及不良反應較輕的優勢，中藥的臨床應用逐漸受到重視。紅花，別名草紅花，為植物紅花Carthamus tinctorius L.的干燥花，為活血通經、去瘀止痛之良藥。研究表明，紅花黃色素(safflor yellow，SY)是紅花的主要有效部位，羥基紅花黃色素A (hydroxysaffloryellow A，HSYA)是紅花黃色素中含量最高的有效單體成分(約占其含量70%)。日本學者Meselhy等1993年首次確定其結構式，其相對分子質量為612。HSYA具有多種心血管藥理作用，據報道HSYA可以緩解小鼠ALI的病理過程[6]，但HSYA對炎癥信號通路環節的作用還需進一步探討。本研究擬從基因和蛋白水平觀察HSYA對LPS誘導小鼠肺組織Toll樣受體4(TLR4)水平的影響，以及對腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素1β(IL-1β)及IL-6水平的影響，觀察HSYA對ALI小鼠炎癥損傷的緩解作用，從而在動物實驗水平探索HSYA抑制肺部炎癥反應的機制。
材料與方法
一 材料
1.實驗動物：雄性昆明小鼠(Ⅱ級)84只，購自中國醫學科學院 & 北京協和醫科大學實驗動物中心，合格證號0140140，體重18~22 g，動物購回后飼養在北京心肺血管疾病研究所SPF級動物房，適應性喂養1周，實驗期間自由飲水和飲食。
2.試劑：LPS由Sigma公司生產(貨號L2880，批號050M4014)。HSYA采用大孔樹脂-凝膠色譜法制備，純度95.3%。地塞米松(dexamethasone，DXM)磷酸鈉注射液(5 mg/mL)為天津藥業焦作有限公司產品。TLR4引物由北京三博遠志公司合成。Trizol試劑由Invitrogen公司生產。實時定量PCR (RT-PCR)試劑盒由Takara公司生產。Western blot試劑盒由江蘇碧云天生物技術有限公司生產。ELISA試劑盒均購自上海依科賽生物技術有限公司。其他試劑均為國產分析純。
二 方法
1.實驗分組和處理：將動物按體重分層隨機分為7組(每組12只)，分別為空白組、LPS組、DXM組(LPS+DXM)、HSYA低劑量組(LPS+HSYA 6 mg/kg)、HSYA中劑量組(LPS+HSYA 15 mg/kg)、HSYA高劑量組(LPS+HSYA 37.5 mg/kg)，以及HSYA對照組(生理鹽水+HSYA 37.5 mg/kg)。除空白組和HSYA對照組外，其余各給藥組小鼠按照15 mg/kg劑量腹腔注射LPS (1 g/L)建立ALI模型。HSYA各劑量給藥組于腹腔注射LPS前30 min經尾靜脈注射HSYA，HSYA劑量分別為6 mg/kg (低劑量)、15 mg/kg (中劑量)和37.5 mg/kg (高劑量)，HSYA低、中、高劑量組分別使用0.6、1.5和3.75 g/L HSYA，從而保證各組注射容量的一致性。HSYA對照組于腹腔注射生理鹽水前30 min經尾靜脈注射高劑量37.5 mg/kg HSYA；DXM組于腹腔注射LPS前30 min經尾靜脈注射陽性對照藥DXM (3 mg/kg)。與各給藥組比較，LPS組以相同體積生理鹽水代替HSYA或DXM經尾靜脈注射，而空白組分別以相同體積生理鹽水替代HSYA或DXM經尾靜脈注射，并以相同體積生理鹽水替代LPS腹腔注射，其他處理均同給藥組。
2.血液及組織標本的采取：腹腔注射LPS或生理鹽水4 h后，戊巴比妥鈉(1%，60 mg/kg)腹腔注射麻醉動物，眶周取血500 μL，37 ℃放置1 h后4 ℃過夜制取血清，3 000 r/min離心5~10 min，收集血清，按一次使用量分裝，保存于-80 ℃。取右肺上中葉放置凍存管中迅速投入液氮，留待RT-qPCR及Western blot檢測。
3.RT-PCR檢測肺組織TLR4的表達：采用Trizol法提取組織RNA，加入Trizol冰浴勻漿。加入氯仿，劇烈振蕩離心，取上清水相。加異丙醇室溫放置10 min，離心棄上清，加入70%乙醇，顛倒混勻，4 ℃離心。小心棄上清，室溫干燥5~10 min。將RNA溶于DEPC水中。取組織RNA 10 μL，加入Oligo (dT)18(0.5 g/ L)1 μL，5×RT buffer 5 μL，dNTP (10 mmol/L)1 μL，M-MLV (200 U/ L)1 μL，用DEPC水補足至25 μL，42 ℃反應1 h，得到cDNA，-20 ℃保存。引物由北京三博遠志公司合成。TLR4引物序列：F：GGCTATCTGTGAGCGTGT；R：GGTTTCTTACTTTCCCTT；產物252 bp。GAPDH引物序列：F：TGCGACTTCAACAGCAACTC；R：ATGTAGGCC ATGAGGTCCAC；產物143 bp。從上述反轉錄產物中取cDNA 1 μL，加入SYBR GREEN熒光染料10 μL，DEPC水8.6 μL，上下游引物10 μmol/L各0.4 μL。PCR擴增條件為：預變性，95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，61 ℃ 34 s，40個循環；融解曲線進行分析。
4.Western blot檢測肺組織TLR4蛋白水平表達：按照試劑盒說明書分別提取組織蛋白，蛋白定量按試劑盒操作(Bradford法)。分別配制12%濃縮膠與5%分離膠。吸取待測蛋白樣品、蛋白Marker加入上樣槽。電泳直至結束。之后電轉1 h，切斷電源。取出NC膜，加入封閉液，室溫封閉1 h。用PBST洗3次，每次5 min，加入特異性一抗，室溫下振搖1.5 h。加入特異性二抗，室溫孵育1 h，之后曝光、顯影、定影。將膠片進行掃描，用凝膠圖象處理系統分析目標條帶的光密度(OD)值。
5.ELISA法檢測小鼠外周血中TNF-α、IL-1β及IL-6的水平表達：將標準品以及1 :50 000稀釋的血清樣本加入包被板孔中，24 ℃反應20 min后棄反應液，洗板3次，加入Biotin anti mice IL-6工作液，混勻30 s，24 ℃溫育20 min后洗板3次，每孔加1×HRP工作液，混勻30 s，24 ℃溫育10 min，洗板3次，加入TMB顯色液，輕輕混勻10 s，24 ℃溫育20 min，每孔加入TMB終止液，混勻30 s，15 min內在450 nm處讀OD值。用CurveExpert 1.3軟件繪制標準曲線，根據樣本的OD值在標準曲線上查出對應濃度。IL-1β及TNF-α檢測所用抗體為Biotin anti mice IL-1β和Biotin anti mice TNF-α，其余操作同上。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析。實驗結果計量資料以x±s表示，采用方差分析及SNK檢驗法進行統計處理。P < 0.05為差異有統計學意義。
結果
一 HSYA抑制ALI小鼠TLR4 mRNA水平的升高
采用SYBR Green熒光標記物，對ALI小鼠TLR4進行實時定量檢測，結果見圖 1。注射LPS后，LPS組小鼠肺組織的TLR4 mRNA水平較空白組顯著升高(P < 0.01)。與LPS組比較，中、高劑量的HSYA給藥組和DXM組TLR4 mRNA水平明顯下降(P < 0.05)，其中HSYA高劑量組和DXM組TLR4 mRNA指標接近空白組。結果見圖 2。
圖1
GAPDH融解曲線??a.TLR4融解曲線；b.合成曲線；c.標準曲線；d.羧基熒光素標記GAPDH，SYBR2標記TLR4
圖2
HSYA對ALI小鼠肺組織中TLR4 mRNA表達水平的影響
與空白組比較, △△
二 HSYA抑制ALI小鼠TLR4蛋白水平的升高
注射LPS后，LPS組小鼠肺組織的TLR4蛋白水平較空白組顯著升高(P < 0.01)。與LPS組比較，中、高劑量HSYA給藥組TLR4蛋白水平均顯著降低(P < 0.05，P < 0.01)，DXM組TLR4蛋白水平明顯降低(P < 0.01)。結果見圖 3。
圖3
HSYA對ALI小鼠肺組織中TLR4蛋白表達水平的影響
與空白組比較, △△
三 HSYA抑制ALI小鼠外周血炎性因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平的升高
注射LPS后，LPS組小鼠外周血的炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平較空白組明顯升高(P < 0.01)，說明LPS刺激了炎癥因子的表達增強。與LPS組比較，HSYA給藥能夠明顯抑制炎癥因子TNF-α(高劑量組)、IL-1β(中、高劑量組)和IL-6(中、高劑量組)的表達(P < 0.05)，且隨著HSYA劑量的增加這一趨勢更加明顯。DXM能顯著抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表達(P < 0.01)。
討論
ALI是現代危重醫學的一大難題，表現為各種原因引起的急性呼吸困難和頑固性低氧血癥。ALI最主要的特征是過度的炎癥反應，引起彌漫性肺泡毛細血管膜損傷，導致肺水腫、肺不張、毛細血管通透性增加以及肺部氣體交換障礙[3]。膿毒癥是臨床上ALI最常見的病因之一，約占ALI發病原因的35%~45%[3]，因此本研究采用常用的腹腔注射LPS的方法建立內毒素血癥導致ALI的小鼠模型，模擬臨床ALI的發生，并同時觀察HSYA對ALI的治療作用。由于糖皮質激素是臨床上常用的治療ALI的藥物，因此我們選用DXM作為陽性對照藥物，對評價HSYA對ALI的療效有較好的參考意義。
LPS所致ALI動物模型具有與臨床ALI患者相似的幾個重要特征--肺水腫、呼吸功能障礙、肺部大量炎癥細胞浸潤以及早期炎癥介質的過度釋放等。在前期研究中，腹腔注射LPS 4 d后，LPS組動物出現呼吸急促；血氣分析結果提示代謝性酸中毒合并呼吸性酸中毒并且存在低氧血癥；HE染色病理結果顯示肺組織呈現急性炎癥反應過程。這些表現與臨床ALI患者肺部損害及臨床表現相一致，表明我們的ALI動物模型是成功的[6]。
圖4
HSYA對LPS所致ALI小鼠外周血中炎癥因子表達水平的影響
與空白組比較, △△
我們前期研究表明，HSYA能夠減輕ALI小鼠病理損傷，改善動脈血氣，減輕其肺組織水腫以及炎癥細胞浸潤情況[6]。其作用機制可能與HSYA抑制核因子κB (NF-κB)及p38 MAPK信號轉導通路的活化有關。NF-κB與p38 MAPK信號轉導通路的活化被抑制后，相應的炎癥介質、粘附分子等的過高表達也受到抑制，炎性細胞浸潤減少，組織滲出與水腫程度減輕，呼吸功能從而得到明顯改善。本實驗主要是在上述實驗基礎上進一步探索HSYA對該信號通路其他環節的影響，即對LPS的細胞膜靶點TLR4 mRNA和蛋白水平的影響，以及對外周血中的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6的作用[6]。
Toll樣受體是近年來發現的一類天然免疫受體[7]，屬于模式識別受體[8]，即存在于固有免疫細胞表面能夠直接識別結合病原微生物表面某些共有的特定分子結構的受體[9]，可以識別結合病原微生物表面的配體-病原體相關分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMP)，如G-菌的LPS，引發一系列的信號轉導，導致炎癥介質的釋放，在天然免疫防御中起著重要的作用[10]。TLR4是目前研究的最多的Toll樣受體[11]，它是靶細胞上LPS進行致炎反應的主要敏感配體，在內毒素性ALI的發生發展中發揮重要作用。本研究發現，LPS所致的小鼠ALI肺部TLR4受體的mRNA及蛋白水平表達較空白組明顯升高，而中高劑量的HSYA能緩解ALI小鼠TLR4水平的升高。TLR4受體經LPS激活后，經早期MyD88依賴性信號轉導通路和遲發性MyD88非依賴性信號轉導通路激活核轉錄因子NF-κB及MAPK通路[12-14]。我們前期研究發現HSYA三個劑量給藥組(6、15、37.5 mg/kg)可以不同程度抑制NF-κB的激活程度、NF-κB p65的核轉位以及p38蛋白的磷酸化。ALI中NF-κB及p38 MAPK的活化均可導致早期炎癥相關因子(如TNF-α、IL-1β和IL-6等)的大量釋放，而且這些炎癥因子持續升高是ALI預后不良的一個重要標志[15-16]。
本研究發現HSYA對LPS所致的小鼠ALI炎癥信號通路的初始環節TLR4的mRNA及蛋白水平的升高均有緩解作用，對ALI小鼠外周血中相關炎癥介質的蛋白水平的升高也有抑制作用。HSYA是一種水溶性黃酮類物質[17-18]，它不易通過細胞膜進入細胞，也不太可能在細胞膜存在其特異性載體，故細胞膜很可能是HSYA阻斷病理信號向細胞內轉導、使細胞狀態恢復正常進而緩解肺部損傷作用的重要靶位，但是具體的機制還需要進一步研究[19-20]。
我們前期研究的動物實驗結果表明HSYA能緩解LPS所致的ALI小鼠所見的形態學變化、呼吸功能下降，能抑制NF-κB及p38 MAPK信號轉導通路的活化從而抑制相應炎癥介質的mRNA過高表達，最終緩解小鼠的急性肺損傷。而本研究是在此基礎上進行信號通路環節的完善，發現HSYA對炎癥信號通路的初始環節TLR4的mRNA及蛋白水平的升高均有緩解作用，對ALI小鼠外周血中相關炎癥介質的蛋白水平的升高也有抑制作用。本研究在前期整體水平基礎上進一步揭示了HSYA的治療機制，HSYA很可能是通過作用于肺組織靶細胞膜上，緩解LPS所致的TLR4受體水平的升高，抑制其下游的炎癥信號轉導，緩解相關炎癥因子水平的升高。與傳統抗炎藥DXM比較，HSYA雖然抗炎效果不及DXM，但其多靶點協同控制炎癥的級聯反應以及可能較少的不良反應均使HSYA有潛能作為一種新的治療ALI的藥物應用于臨床，具有較好的應用前景。本研究的不足之處在于沒有對照使用TLR4阻斷劑，從而進一步驗證HSYA可能的作用靶點，這也將是今后我們進一步的研究方向。
