引用本文： 蔣雪蓮, 鐘萍, 黃成亮, 孟原竹, 何芳, 范賢明. 氧化應激反應標志物在慢性阻塞性肺疾病穩定期患者血清中的表達及意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(6): 542-547. doi: 10.7507/1671-6205.2016125 復制
氧化應激是導致慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)發病率和死亡率升高的一個重要因素[1]。在所有反映氧化應激的指標中，由于自由基不穩定不易測定，各個酶促和非酶促抗氧化劑往往所反映的抗氧化能力又較單一。而氧化應激對機體的損傷主要表現為活性氧自由基(ROS)對脂質、蛋白質、DNA的氧化損傷，以及與ROS相對應的機體內清除氧化物的能力。因此，脂質、蛋白質、DNA氧化損傷的終產物和總抗氧化能力含量成為反映氧化與抗氧化失衡相對直接而可靠的指標。機體內丙二醛(MDA)的含量與氧自由基的生成平行，測定MDA的濃度可反映脂質過氧化水平，并間接反映細胞受損壞的程度[2]。蛋白質羰基(PC)是ROS對機體蛋白質氨基酸側鏈損傷的產物，隨著氧化應激的程度加重，蛋白質羰基化程度也隨之加重，從而使蛋白質不易折疊且容易發生交聯，故PC被認為是評價蛋白氧化損傷程度的有效指標[3-4]。國外有研究發現PC是慢阻肺的獨立危險因素[5]。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是DNA氧化損傷的終產物，被公認為是DNA氧化損傷的標志物[6]。研究者們對慢阻肺患者尿液中的8-OHdG研究較多，但對慢阻肺患者血清中的8-OHdG研究卻很少。總抗氧化能力(TAC)代表機體抗氧化防御體系的整體狀態[7]，由酶促和非酶促兩大部分組成, 比測定單個抗氧化物能夠更好地反映機體的抗氧化狀態。本研究通過測定慢阻肺患者血清中氧化應激反應標志物MDA、PC、8-OHdG、TAC的含量，以及對受試者進行肺功能的檢測和一般資料的收集，分析氧化應激反應標志物與慢阻肺患者吸煙、肺功能的關系，旨在探討氧化應激在慢阻肺發病過程中的可能作用，增加臨床醫師對慢阻肺氧化應激機制的認識，希望能為慢阻肺的個體化治療提供新思路，降低致殘率和病死率。
對象與方法
一 對象
選擇2014年6月至2014年8月在西南醫科大學附屬醫院、瀘州市江南醫院和瀘州市龍馬潭區紅十字醫院體檢的慢阻肺穩定期患者200例(慢阻肺組)，體檢健康者100例(對照組)。本研究經過瀘州醫學院附屬醫院倫理委員會批準(申請受理號：KY2012021)，在中國臨床試驗注冊中心注冊(注冊號：ChiCTR-IPC-14005425)，并征得所有研究對象的知情同意并簽字。
納入標準：年齡40~90歲；神志清楚，言語溝通無障礙，行為配合；所有慢阻肺穩定期患者的診斷均符合我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2013年修訂版)的診斷標準；所有體檢健康者FEV1/FVC＞70%，無呼吸系統及其他疾病。慢阻肺組及對照組由吸煙者和未吸煙者組成。納入標準[8]：吸煙者：吸煙史≥10包年，連續吸煙(大于10年)未進行過戒斷；未吸煙者：從未吸煙，無被動吸煙。排除標準[9]：患支氣管擴張癥、活動性肺結核、支氣管哮喘、肺癌等可造成氣喘或呼吸困難的其他疾病；有阻塞性睡眠呼吸暫停、糖尿病、肝腎功能障礙；近期有手術、外傷；有關節炎、結締組織疾病等全身其他系統性炎癥疾病；患有精神疾病、認知功能障礙、不能交流的患者；身體超重或肥胖(體重指數≥30 kg/m2)。
二 方法
1.肺功能測試：受試者安靜休息30 min，測試前連續3次測量受試者的身高和體重并取平均值。采用日本捷斯特公司的肺功能檢測儀，對無禁忌且能配合完成者進行肺功能檢測。按照使用說明書，并結合肺功能檢測專業技術人員的指導，測試者輸入受試者的身高、體重等生理參數，并由計算機自動獲取各預計參數。主要觀察指標為FEV1/FVC、FEV1%pred。
2.血清標本采集：抽取受試者清晨空腹靜脈血3~5 mL，3 500 r/min離心10 min，分離血清，置于-70 ℃冰箱待測。
3.血清各氧化應激指標的測定：MDA的測定采用硫代巴比妥酸比色法，應用酶標儀于532 nm測定各樣本吸光度(OD)值，MDA (nmol/mL)=[(OD測定管-OD標準空白管)/(OD標準管-OD標準空白管)]×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數；采用ELISA試劑盒檢測血清中PC的OD值，根據標準品OD繪制的標準曲線查出相應的濃度(ng/mL)；8-OHdG的測定采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清中8-OHdG的OD值，根據標準品OD值繪制的標準曲線查出相應的含量，再乘以稀釋倍數得到血清8-OHdG的濃度(pg/mL)；TAC的測定采用菲羅啉比色法，應用分光光度計于520 nm處依序測量各樣本OD值，TAC (U/mL)=[(OD測定管-OD對照管)/0.01]/30×N×n(其中N表示反應體系稀釋倍數：樣品總體積/取樣量，n表示樣本測試前稀釋倍數)。具體操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。
三 統計學處理
所有數據采用SPSS 17.0軟件進行分析，符合正態分布的定量資料采用x±s表示，不符合正態分布的定量資料采用中位數(四分位數間距)(M[P25，P75])表示，定性資料采用百分位數表示。符合正態分布的定量資料的組間差異性比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的定量資料組間比較采用秩和檢驗；定性資料組間差異性比較采用χ2檢驗。多元線性回歸用于探索相關因素與氣流受限程度(FEV1%pred)的關聯程度。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 慢阻肺組與對照組一般資料比較
將受試者按是否患慢阻肺分為慢阻肺組(n=200)和對照組(n=100)；再將慢阻肺患者按是否吸煙分為吸煙亞組(n=93)和未吸煙亞組(n=107)；將慢阻肺患者按照氣流受限程度分為輕-中度亞組(n=107，FEV1pred≥50%)，重-極重度亞組(n=93, FEV1pred＜50%)。慢阻肺組：男119例，女81例；年齡42~87歲，平均年齡(68.2±8.1)歲；吸煙指數28[14,25]包年。對照組：男49例，女51例；年齡51~87歲，平均年齡(67.6±7.6)歲；吸煙指數31[20,41]包年。慢阻肺組與對照組性別構成比、吸煙情況經χ2檢驗，年齡經獨立樣本t檢驗，差異均無統計學意義(P＞0.05)。
二 慢阻肺組與對照組相關氧化應激反應標志物的比較
與對照組比較，慢阻肺組血清MDA、PC、8-OHdG的濃度均升高(P＜0.05)，而血清TAC水平顯著降低(P＜0.001)，結果見表 1。
表1
慢阻肺組與對照組氧化應激反應標志物的比較(M[P25，P75])
三 慢阻肺患者吸煙亞組與未吸煙亞組相關氧化應激指標的差異
與未吸煙亞組比較，吸煙亞組的慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的濃度均明顯升高(P＜0.05)；雖然慢阻肺吸煙亞組血清MDA的濃度升高、TAC的濃度降低，但兩組間差異均無統計學意義(P＞0.05)，結果見表 2。
表2
吸煙對慢阻肺患者各氧化應激指標的影響(M[P25，P75])
四 慢阻肺患者不同程度氣流受限亞組間相關氧化應激指標的差異
重度-極重度亞組的慢阻肺患者血清PC濃度明顯高于輕-中度亞組慢阻肺患者血清PC的濃度(P＜0.01)；而血清MDA、8-OHdG、TAC的水平在這兩亞組間差異均無統計學意義(P＞0.05)，結果見表 3。
表3
慢阻肺患者不同氣流受限亞組間相關氧化應激指標比較(M[P25，P75])
五 氣流受限程度FEV1%pred影響因素的探究
經過多元線性回歸分析可見，自變量PC和8-OHdG與慢阻肺患者FEV1%pred關聯有統計學意義(β=-0.230，-0.219，P＜0.01)，血清PC的水平對FEV1%pred的影響比8-OHdG大。其標準化回歸系數均為負值，說明這兩個變量與FEV1%pred呈負相關，其測定值越小，FEV1%pred越大；這兩個變量測定值越大，FEV1%pred越小，結果見表 4。
表4
各指標對FEV1%pred的多元線性回歸
討論
關于慢阻肺的發病機制，雖然既往研究多集中在炎性機制和彈性蛋白酶/抗彈性蛋白酶失衡兩大重要機制上，但是近年來氧化應激作為一個新的切入點，對慢阻肺發生發展的影響逐漸被人們所認識[10]。有研究證實慢阻肺患者血清、肺組織、呼出氣冷凝液、誘導痰的MDA水平較對照組明顯升高；急性加重期患者痰中MDA的濃度更是顯著高于慢阻肺穩定期組和對照組，經治療后痰中MDA明顯減少[5, 11-15]。本研究也發現慢阻肺組血清MDA濃度明顯高于對照組。可見，慢阻肺穩定期患者體內存在明顯氧化應激，ROS與多不飽和脂肪酸反應產生脂質過氧化物，進而分解出大量MDA。PC是ROS對機體蛋白質氨基酸側鏈氧化損傷的產物，并被認為是評價蛋白質氧化損傷程度的有效指標。Ahmad等[16]研究證實慢阻肺組血清PC濃度明顯高于對照組。也有研究發現慢阻肺組骨骼肌中PC水平明顯高于正常組，在慢阻肺組中血清中的PC含量明顯與骨骼肌中的水平呈正相關[17]。Barreiro等[3]還發現慢阻肺組股四頭肌肌酸激酶羰基化明顯強于對照組，并且肌酸激酶的羰基化強度與FEV1%pred呈負相關。通過研究，我們發現慢阻肺組血清PC濃度明顯高于對照組。這說明我國慢阻肺穩定期患者體內也存在蛋白質的氧化損傷。蛋白質的氧化損傷可使一些酶類、呼吸肌和外周骨骼肌蛋白質羰基化，導致蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫反應、呼吸肌和外周骨骼肌功能障礙，促進慢阻肺的發生、發展[18-19]。ROS可直接攻擊DNA，使DNA上的鳥嘌呤被氧化為8-OHdG。過去，許多學者發現慢阻肺患者尿、肺組織、淋巴細胞和痰液中8-OHdG均明顯高于健康人群；尿中8-OHdG的濃度與FVC%、FEV1%pred、動脈血中的氧含量呈負相關；并且發現高水平的8-OHdG與吸煙導致的慢阻肺密切相關[20-22]。我們的研究發現慢阻肺穩定期患者血清8-OHdG的濃度明顯高于對照組。這說明慢阻肺患者體內氧化應激失衡導致了DNA的氧化損傷。
TAC代表機體抗氧化防御體系的整體狀態。有研究者發現慢阻肺組血清TAC濃度較對照組顯著降低[5, 23]；慢阻肺急性加重期患者經治療緩解后，痰上清液中TAC水平增高[24]。Ekin等[25]發現血清TAC濃度在慢阻肺組與對照組間差異無統計學意義，這可能是由于該研究對照組樣本量較少，影響了檢驗效能。我們的研究也發現慢阻肺組血清TAC水平顯著低于對照組，再次驗證了慢阻肺患者體內TAC下降，這與慢阻肺患者機體氧化應激負荷過重，過度消耗了體內的抗氧化物有關。有研究表明長期使用抗氧化劑可以提高慢阻肺患者肺功能，延緩其下降，改善生活質量，減少慢阻肺急性加重的次數[26-27]。但抗氧化劑在臨床上的使用較少，更多療效較好的抗氧化劑有待進一步發掘，這更需要臨床醫生及研究者們引起重視。
香煙煙霧中含有大量自由基，它們進入機體后不能被有效清除而產生聚集。這些聚集的自由基通過對生物大分子的損傷引起氣道、肺組織，甚至全身細胞、組織的氧化損傷，從而導致慢阻肺的發生和發展。Ceylan等[28]發現血清PC濃度在吸煙慢阻肺組明顯高于對照組。Barreiro等[29]研究發現健康吸煙者及暴露于吸煙環境的小鼠、豚鼠呼吸肌和外周骨骼肌肌肉PC水平升高。Portao de Carlos等[30]也證實香煙煙霧暴露的小鼠肺組織和膈肌發生蛋白質羰基化。但以上研究均不是針對慢阻肺患者吸煙與未吸煙者的比較。在我們的研究中，與未吸煙亞組比較，吸煙亞組的慢阻肺患者血清PC、8-OHdG的濃度明顯增高。這說明吸煙可能大大加重了人體呼吸肌和外周骨骼肌肌肉蛋白質的羰基化。而呼吸肌和外周骨骼肌的氧化損傷可以直接導致肺功能和人體運動耐力的下降，這可能與慢阻肺患者的發病機制密切相關。Yang等[31]的研究表明在吸煙的慢阻肺患者外周血單核細胞DNA中的8-OHDG水平與吸煙量呈正相關，并且與FEV1%pred呈負相關。Ceylan等[28]還發現吸煙相關的慢阻肺患者外周血單核細胞中DNA氧化損傷程度比生物燃料相關的慢阻肺患者更高，吸煙是比生物燃料導致DNA氧化損傷的更顯著危險因素。有研究發現在環境煙草煙霧和砷誘導的肺氣腫小鼠模型中，8-OHdG作為早期生物標志物水平升高[32]。因此，慢阻肺患者血清中8-OHdG濃度的增高，可能與吸煙導致的機體DNA的氧化損傷關系密切。對于吸煙的人群，或許我們可以通過結合監測機體8-OHdG的水平來早期發現慢阻肺。也有研究者發現吸煙會導致慢阻肺患者體內MDA濃度升高[12]，而各種抗氧化物的水平降低[33-34]。在我們的研究中，雖然慢阻肺吸煙亞組較未吸煙亞組血清MDA的濃度升高、TAC的濃度降低，但兩組間差異均無統計學意義。這可能與我們的數據不符合正態分布，使用的是秩和檢驗，檢驗效能相對t檢驗要低，而沒有檢測出這兩組間MDA和TAC水平差異的統計學意義有關。
我們的研究分析得出，與輕-中度亞組相比，重度-極重度亞組慢阻肺患者血清PC濃度明顯升高。Torres-Ramos等[35]也發現慢阻肺患者不同氣流受限程度分級血清PC水平明顯高于正常組，極重度組PC濃度最高，并且比中度組高73%，表明高水平的PC與慢阻肺的嚴重程度密切相關。還有研究證實慢阻肺患者PC水平與FEV1%pred呈負相關[36]。在本研究中，多元線性回歸分析顯示慢阻肺患者血清PC的濃度與FEV1%pred呈顯著負相關。在慢阻肺發病進程中，由于氧化應激導致蛋白質羰基化，使機體產生蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫反應、呼吸肌的損害，促使慢阻肺患者肺功能的下降[18-19]。由此，我們推測PC可作為監測慢阻肺進展和氧化應激損傷的生物標志物。我們的研究未發現慢阻肺患者輕-中度、重-極重度亞組間血清MDA、8-OHdG和TAC的水平有顯著差異。但是多元線性回歸分析顯示慢阻肺患者血清8-OHdG的表達也是FEV1%pred的影響因素，血清中8-OHdG的表達也與FEV1%pred呈負相關，并發現慢阻肺患者血清PC的表達對FEV1%pred的影響較8-OHdG大。這可能與FEV1%pred受多種因素的影響有關；也可能是由于根據我們的數據特點使用了秩和檢驗，檢驗效能低于t檢驗，而沒有檢測出慢阻肺患者輕-中度、重-極重度亞組間這三個指標水平差異的統計學意義。通過多元線性回歸分析，我們的研究未發現慢阻肺患者血清MDA、TAC的水平與FEV1%pred有明顯相關性。雖然也有研究發現慢阻肺患者機體的氧化和抗氧化狀態與肺功能無相關性[25, 37]。但Arja等[8]的研究表明血清MDA的濃度與慢阻肺患者FEV1%pred呈負相關，認為血清MDA的增多與慢阻肺的發病進程有關，高水平的MDA增加疾病進展的風險。Ahmad等[16]發現慢阻肺患者血清TAC的水平與FEV1%pred呈顯著正相關，認為較低的抗氧化能力導致更嚴重的氣流受限。我們推測，研究結果的不一致可能是由于慢阻肺的發病機制較復雜，因而對于“易感基因”和慢阻肺分型的研究可能是未來研究的熱點。
雖然血清標本容易獲得，且血清標本中氧化應激反應標記物的檢測方法較成熟，但無法直接反映氣道和肺部局部的氧化應激情況，將來我們可以同時檢測呼出氣冷凝液、痰中的氧化應激反應標志物，與血清中同類標志物進行比較，以進一步探究慢阻肺的氧化應激機制。另外，本研究的局限在于飲食習慣、體育活動、糖皮質激素等藥物的使用可能影響人體內氧化物和抗氧化物的水平，但這些因素難以實現一致，導致我們的許多數據呈偏態分布，可能影響檢驗效能。但通過我們的研究初步發現慢阻肺患者血清MDA、PC、8-OHdG的濃度明顯升高，血清TAC的水平明顯降低；吸煙可使慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的濃度異常升高；氧化應激導致的蛋白質羰基化和DNA氧化損傷是肺功能的影響因素，慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的濃度越高，氣流受限程度越重。由此可見，慢阻肺穩定期患者體內存在明顯的氧化和抗氧化失衡；吸煙引起慢阻肺患者血清PC、8-OHdG的水平異常升高，吸煙可能會加重慢阻肺患者體內蛋白質和DNA的氧化損傷；血清PC、8-OHdG的水平均與FEV1%pred呈負相關，表明氧化應激在慢阻肺的發病過程中起了重要作用。我們可以通過避免接觸使機體氧化應激增強的危險因素(如吸煙)和抗氧化治療來預防慢阻肺的發生和發展。
氧化應激是導致慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)發病率和死亡率升高的一個重要因素[1]。在所有反映氧化應激的指標中，由于自由基不穩定不易測定，各個酶促和非酶促抗氧化劑往往所反映的抗氧化能力又較單一。而氧化應激對機體的損傷主要表現為活性氧自由基(ROS)對脂質、蛋白質、DNA的氧化損傷，以及與ROS相對應的機體內清除氧化物的能力。因此，脂質、蛋白質、DNA氧化損傷的終產物和總抗氧化能力含量成為反映氧化與抗氧化失衡相對直接而可靠的指標。機體內丙二醛(MDA)的含量與氧自由基的生成平行，測定MDA的濃度可反映脂質過氧化水平，并間接反映細胞受損壞的程度[2]。蛋白質羰基(PC)是ROS對機體蛋白質氨基酸側鏈損傷的產物，隨著氧化應激的程度加重，蛋白質羰基化程度也隨之加重，從而使蛋白質不易折疊且容易發生交聯，故PC被認為是評價蛋白氧化損傷程度的有效指標[3-4]。國外有研究發現PC是慢阻肺的獨立危險因素[5]。8-羥基脫氧鳥苷(8-OHdG)是DNA氧化損傷的終產物，被公認為是DNA氧化損傷的標志物[6]。研究者們對慢阻肺患者尿液中的8-OHdG研究較多，但對慢阻肺患者血清中的8-OHdG研究卻很少。總抗氧化能力(TAC)代表機體抗氧化防御體系的整體狀態[7]，由酶促和非酶促兩大部分組成, 比測定單個抗氧化物能夠更好地反映機體的抗氧化狀態。本研究通過測定慢阻肺患者血清中氧化應激反應標志物MDA、PC、8-OHdG、TAC的含量，以及對受試者進行肺功能的檢測和一般資料的收集，分析氧化應激反應標志物與慢阻肺患者吸煙、肺功能的關系，旨在探討氧化應激在慢阻肺發病過程中的可能作用，增加臨床醫師對慢阻肺氧化應激機制的認識，希望能為慢阻肺的個體化治療提供新思路，降低致殘率和病死率。
對象與方法
一 對象
選擇2014年6月至2014年8月在西南醫科大學附屬醫院、瀘州市江南醫院和瀘州市龍馬潭區紅十字醫院體檢的慢阻肺穩定期患者200例(慢阻肺組)，體檢健康者100例(對照組)。本研究經過瀘州醫學院附屬醫院倫理委員會批準(申請受理號：KY2012021)，在中國臨床試驗注冊中心注冊(注冊號：ChiCTR-IPC-14005425)，并征得所有研究對象的知情同意并簽字。
納入標準：年齡40~90歲；神志清楚，言語溝通無障礙，行為配合；所有慢阻肺穩定期患者的診斷均符合我國《慢性阻塞性肺疾病診治指南》(2013年修訂版)的診斷標準；所有體檢健康者FEV1/FVC＞70%，無呼吸系統及其他疾病。慢阻肺組及對照組由吸煙者和未吸煙者組成。納入標準[8]：吸煙者：吸煙史≥10包年，連續吸煙(大于10年)未進行過戒斷；未吸煙者：從未吸煙，無被動吸煙。排除標準[9]：患支氣管擴張癥、活動性肺結核、支氣管哮喘、肺癌等可造成氣喘或呼吸困難的其他疾病；有阻塞性睡眠呼吸暫停、糖尿病、肝腎功能障礙；近期有手術、外傷；有關節炎、結締組織疾病等全身其他系統性炎癥疾病；患有精神疾病、認知功能障礙、不能交流的患者；身體超重或肥胖(體重指數≥30 kg/m2)。
二 方法
1.肺功能測試：受試者安靜休息30 min，測試前連續3次測量受試者的身高和體重并取平均值。采用日本捷斯特公司的肺功能檢測儀，對無禁忌且能配合完成者進行肺功能檢測。按照使用說明書，并結合肺功能檢測專業技術人員的指導，測試者輸入受試者的身高、體重等生理參數，并由計算機自動獲取各預計參數。主要觀察指標為FEV1/FVC、FEV1%pred。
2.血清標本采集：抽取受試者清晨空腹靜脈血3~5 mL，3 500 r/min離心10 min，分離血清，置于-70 ℃冰箱待測。
3.血清各氧化應激指標的測定：MDA的測定采用硫代巴比妥酸比色法，應用酶標儀于532 nm測定各樣本吸光度(OD)值，MDA (nmol/mL)=[(OD測定管-OD標準空白管)/(OD標準管-OD標準空白管)]×標準品濃度×樣本測試前稀釋倍數；采用ELISA試劑盒檢測血清中PC的OD值，根據標準品OD繪制的標準曲線查出相應的濃度(ng/mL)；8-OHdG的測定采用雙抗體夾心ABC-ELISA法檢測血清中8-OHdG的OD值，根據標準品OD值繪制的標準曲線查出相應的含量，再乘以稀釋倍數得到血清8-OHdG的濃度(pg/mL)；TAC的測定采用菲羅啉比色法，應用分光光度計于520 nm處依序測量各樣本OD值，TAC (U/mL)=[(OD測定管-OD對照管)/0.01]/30×N×n(其中N表示反應體系稀釋倍數：樣品總體積/取樣量，n表示樣本測試前稀釋倍數)。具體操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。
三 統計學處理
所有數據采用SPSS 17.0軟件進行分析，符合正態分布的定量資料采用x±s表示，不符合正態分布的定量資料采用中位數(四分位數間距)(M[P25，P75])表示，定性資料采用百分位數表示。符合正態分布的定量資料的組間差異性比較采用獨立樣本t檢驗，不符合正態分布的定量資料組間比較采用秩和檢驗；定性資料組間差異性比較采用χ2檢驗。多元線性回歸用于探索相關因素與氣流受限程度(FEV1%pred)的關聯程度。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 慢阻肺組與對照組一般資料比較
將受試者按是否患慢阻肺分為慢阻肺組(n=200)和對照組(n=100)；再將慢阻肺患者按是否吸煙分為吸煙亞組(n=93)和未吸煙亞組(n=107)；將慢阻肺患者按照氣流受限程度分為輕-中度亞組(n=107，FEV1pred≥50%)，重-極重度亞組(n=93, FEV1pred＜50%)。慢阻肺組：男119例，女81例；年齡42~87歲，平均年齡(68.2±8.1)歲；吸煙指數28[14,25]包年。對照組：男49例，女51例；年齡51~87歲，平均年齡(67.6±7.6)歲；吸煙指數31[20,41]包年。慢阻肺組與對照組性別構成比、吸煙情況經χ2檢驗，年齡經獨立樣本t檢驗，差異均無統計學意義(P＞0.05)。
二 慢阻肺組與對照組相關氧化應激反應標志物的比較
與對照組比較，慢阻肺組血清MDA、PC、8-OHdG的濃度均升高(P＜0.05)，而血清TAC水平顯著降低(P＜0.001)，結果見表 1。
表1
慢阻肺組與對照組氧化應激反應標志物的比較(M[P25，P75])
三 慢阻肺患者吸煙亞組與未吸煙亞組相關氧化應激指標的差異
與未吸煙亞組比較，吸煙亞組的慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的濃度均明顯升高(P＜0.05)；雖然慢阻肺吸煙亞組血清MDA的濃度升高、TAC的濃度降低，但兩組間差異均無統計學意義(P＞0.05)，結果見表 2。
表2
吸煙對慢阻肺患者各氧化應激指標的影響(M[P25，P75])
四 慢阻肺患者不同程度氣流受限亞組間相關氧化應激指標的差異
重度-極重度亞組的慢阻肺患者血清PC濃度明顯高于輕-中度亞組慢阻肺患者血清PC的濃度(P＜0.01)；而血清MDA、8-OHdG、TAC的水平在這兩亞組間差異均無統計學意義(P＞0.05)，結果見表 3。
表3
慢阻肺患者不同氣流受限亞組間相關氧化應激指標比較(M[P25，P75])
五 氣流受限程度FEV1%pred影響因素的探究
經過多元線性回歸分析可見，自變量PC和8-OHdG與慢阻肺患者FEV1%pred關聯有統計學意義(β=-0.230，-0.219，P＜0.01)，血清PC的水平對FEV1%pred的影響比8-OHdG大。其標準化回歸系數均為負值，說明這兩個變量與FEV1%pred呈負相關，其測定值越小，FEV1%pred越大；這兩個變量測定值越大，FEV1%pred越小，結果見表 4。
表4
各指標對FEV1%pred的多元線性回歸
討論
關于慢阻肺的發病機制，雖然既往研究多集中在炎性機制和彈性蛋白酶/抗彈性蛋白酶失衡兩大重要機制上，但是近年來氧化應激作為一個新的切入點，對慢阻肺發生發展的影響逐漸被人們所認識[10]。有研究證實慢阻肺患者血清、肺組織、呼出氣冷凝液、誘導痰的MDA水平較對照組明顯升高；急性加重期患者痰中MDA的濃度更是顯著高于慢阻肺穩定期組和對照組，經治療后痰中MDA明顯減少[5, 11-15]。本研究也發現慢阻肺組血清MDA濃度明顯高于對照組。可見，慢阻肺穩定期患者體內存在明顯氧化應激，ROS與多不飽和脂肪酸反應產生脂質過氧化物，進而分解出大量MDA。PC是ROS對機體蛋白質氨基酸側鏈氧化損傷的產物，并被認為是評價蛋白質氧化損傷程度的有效指標。Ahmad等[16]研究證實慢阻肺組血清PC濃度明顯高于對照組。也有研究發現慢阻肺組骨骼肌中PC水平明顯高于正常組，在慢阻肺組中血清中的PC含量明顯與骨骼肌中的水平呈正相關[17]。Barreiro等[3]還發現慢阻肺組股四頭肌肌酸激酶羰基化明顯強于對照組，并且肌酸激酶的羰基化強度與FEV1%pred呈負相關。通過研究，我們發現慢阻肺組血清PC濃度明顯高于對照組。這說明我國慢阻肺穩定期患者體內也存在蛋白質的氧化損傷。蛋白質的氧化損傷可使一些酶類、呼吸肌和外周骨骼肌蛋白質羰基化，導致蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫反應、呼吸肌和外周骨骼肌功能障礙，促進慢阻肺的發生、發展[18-19]。ROS可直接攻擊DNA，使DNA上的鳥嘌呤被氧化為8-OHdG。過去，許多學者發現慢阻肺患者尿、肺組織、淋巴細胞和痰液中8-OHdG均明顯高于健康人群；尿中8-OHdG的濃度與FVC%、FEV1%pred、動脈血中的氧含量呈負相關；并且發現高水平的8-OHdG與吸煙導致的慢阻肺密切相關[20-22]。我們的研究發現慢阻肺穩定期患者血清8-OHdG的濃度明顯高于對照組。這說明慢阻肺患者體內氧化應激失衡導致了DNA的氧化損傷。
TAC代表機體抗氧化防御體系的整體狀態。有研究者發現慢阻肺組血清TAC濃度較對照組顯著降低[5, 23]；慢阻肺急性加重期患者經治療緩解后，痰上清液中TAC水平增高[24]。Ekin等[25]發現血清TAC濃度在慢阻肺組與對照組間差異無統計學意義，這可能是由于該研究對照組樣本量較少，影響了檢驗效能。我們的研究也發現慢阻肺組血清TAC水平顯著低于對照組，再次驗證了慢阻肺患者體內TAC下降，這與慢阻肺患者機體氧化應激負荷過重，過度消耗了體內的抗氧化物有關。有研究表明長期使用抗氧化劑可以提高慢阻肺患者肺功能，延緩其下降，改善生活質量，減少慢阻肺急性加重的次數[26-27]。但抗氧化劑在臨床上的使用較少，更多療效較好的抗氧化劑有待進一步發掘，這更需要臨床醫生及研究者們引起重視。
香煙煙霧中含有大量自由基，它們進入機體后不能被有效清除而產生聚集。這些聚集的自由基通過對生物大分子的損傷引起氣道、肺組織，甚至全身細胞、組織的氧化損傷，從而導致慢阻肺的發生和發展。Ceylan等[28]發現血清PC濃度在吸煙慢阻肺組明顯高于對照組。Barreiro等[29]研究發現健康吸煙者及暴露于吸煙環境的小鼠、豚鼠呼吸肌和外周骨骼肌肌肉PC水平升高。Portao de Carlos等[30]也證實香煙煙霧暴露的小鼠肺組織和膈肌發生蛋白質羰基化。但以上研究均不是針對慢阻肺患者吸煙與未吸煙者的比較。在我們的研究中，與未吸煙亞組比較，吸煙亞組的慢阻肺患者血清PC、8-OHdG的濃度明顯增高。這說明吸煙可能大大加重了人體呼吸肌和外周骨骼肌肌肉蛋白質的羰基化。而呼吸肌和外周骨骼肌的氧化損傷可以直接導致肺功能和人體運動耐力的下降，這可能與慢阻肺患者的發病機制密切相關。Yang等[31]的研究表明在吸煙的慢阻肺患者外周血單核細胞DNA中的8-OHDG水平與吸煙量呈正相關，并且與FEV1%pred呈負相關。Ceylan等[28]還發現吸煙相關的慢阻肺患者外周血單核細胞中DNA氧化損傷程度比生物燃料相關的慢阻肺患者更高，吸煙是比生物燃料導致DNA氧化損傷的更顯著危險因素。有研究發現在環境煙草煙霧和砷誘導的肺氣腫小鼠模型中，8-OHdG作為早期生物標志物水平升高[32]。因此，慢阻肺患者血清中8-OHdG濃度的增高，可能與吸煙導致的機體DNA的氧化損傷關系密切。對于吸煙的人群，或許我們可以通過結合監測機體8-OHdG的水平來早期發現慢阻肺。也有研究者發現吸煙會導致慢阻肺患者體內MDA濃度升高[12]，而各種抗氧化物的水平降低[33-34]。在我們的研究中，雖然慢阻肺吸煙亞組較未吸煙亞組血清MDA的濃度升高、TAC的濃度降低，但兩組間差異均無統計學意義。這可能與我們的數據不符合正態分布，使用的是秩和檢驗，檢驗效能相對t檢驗要低，而沒有檢測出這兩組間MDA和TAC水平差異的統計學意義有關。
我們的研究分析得出，與輕-中度亞組相比，重度-極重度亞組慢阻肺患者血清PC濃度明顯升高。Torres-Ramos等[35]也發現慢阻肺患者不同氣流受限程度分級血清PC水平明顯高于正常組，極重度組PC濃度最高，并且比中度組高73%，表明高水平的PC與慢阻肺的嚴重程度密切相關。還有研究證實慢阻肺患者PC水平與FEV1%pred呈負相關[36]。在本研究中，多元線性回歸分析顯示慢阻肺患者血清PC的濃度與FEV1%pred呈顯著負相關。在慢阻肺發病進程中，由于氧化應激導致蛋白質羰基化，使機體產生蛋白/抗蛋白酶失衡、免疫反應、呼吸肌的損害，促使慢阻肺患者肺功能的下降[18-19]。由此，我們推測PC可作為監測慢阻肺進展和氧化應激損傷的生物標志物。我們的研究未發現慢阻肺患者輕-中度、重-極重度亞組間血清MDA、8-OHdG和TAC的水平有顯著差異。但是多元線性回歸分析顯示慢阻肺患者血清8-OHdG的表達也是FEV1%pred的影響因素，血清中8-OHdG的表達也與FEV1%pred呈負相關，并發現慢阻肺患者血清PC的表達對FEV1%pred的影響較8-OHdG大。這可能與FEV1%pred受多種因素的影響有關；也可能是由于根據我們的數據特點使用了秩和檢驗，檢驗效能低于t檢驗，而沒有檢測出慢阻肺患者輕-中度、重-極重度亞組間這三個指標水平差異的統計學意義。通過多元線性回歸分析，我們的研究未發現慢阻肺患者血清MDA、TAC的水平與FEV1%pred有明顯相關性。雖然也有研究發現慢阻肺患者機體的氧化和抗氧化狀態與肺功能無相關性[25, 37]。但Arja等[8]的研究表明血清MDA的濃度與慢阻肺患者FEV1%pred呈負相關，認為血清MDA的增多與慢阻肺的發病進程有關，高水平的MDA增加疾病進展的風險。Ahmad等[16]發現慢阻肺患者血清TAC的水平與FEV1%pred呈顯著正相關，認為較低的抗氧化能力導致更嚴重的氣流受限。我們推測，研究結果的不一致可能是由于慢阻肺的發病機制較復雜，因而對于“易感基因”和慢阻肺分型的研究可能是未來研究的熱點。
雖然血清標本容易獲得，且血清標本中氧化應激反應標記物的檢測方法較成熟，但無法直接反映氣道和肺部局部的氧化應激情況，將來我們可以同時檢測呼出氣冷凝液、痰中的氧化應激反應標志物，與血清中同類標志物進行比較，以進一步探究慢阻肺的氧化應激機制。另外，本研究的局限在于飲食習慣、體育活動、糖皮質激素等藥物的使用可能影響人體內氧化物和抗氧化物的水平，但這些因素難以實現一致，導致我們的許多數據呈偏態分布，可能影響檢驗效能。但通過我們的研究初步發現慢阻肺患者血清MDA、PC、8-OHdG的濃度明顯升高，血清TAC的水平明顯降低；吸煙可使慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的濃度異常升高；氧化應激導致的蛋白質羰基化和DNA氧化損傷是肺功能的影響因素，慢阻肺患者血清PC和8-OHdG的濃度越高，氣流受限程度越重。由此可見，慢阻肺穩定期患者體內存在明顯的氧化和抗氧化失衡；吸煙引起慢阻肺患者血清PC、8-OHdG的水平異常升高，吸煙可能會加重慢阻肺患者體內蛋白質和DNA的氧化損傷；血清PC、8-OHdG的水平均與FEV1%pred呈負相關，表明氧化應激在慢阻肺的發病過程中起了重要作用。我們可以通過避免接觸使機體氧化應激增強的危險因素(如吸煙)和抗氧化治療來預防慢阻肺的發生和發展。
