引用本文： 李三, 朱黎明, 戴愛國. 中性粒細胞哮喘動物模型建立的研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(5): 529-533. doi: 10.7507/1671-6205.2016122 復制
支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞和細胞組分參與的慢性炎癥性疾病。既往認為嗜酸粒細胞(eosinophil，EOS)為哮喘的主要炎癥細胞。近年來，大量研究證實中性粒細胞(neutrophil，NEU)在哮喘的發生、發展中起著重要作用。Douwes等[1]發現約50%的哮喘是由NEU引起，且NEU與重癥哮喘[2]、遲發型哮喘[3]、激素不敏感型哮喘[4]等密切相關。2006年Simpson等[5]將誘導痰中中性粒細胞百分比(NEU%)＞61%的哮喘患者列為哮喘的一個獨立的亞型——中性粒細胞哮喘(neutrophilic asthma，NA)。NA以其高發病率和難控性而受到廣泛關注，其病因、發病機制、新藥研發和評價、預防及治療均為目前研究的熱點，而這一切均需要成熟可靠的NA實驗動物模型為載體。本文綜述了NA實驗動物模型的常用動物、造模方法及檢測指標，并對其未來的研究前景進行展望。
一 常用于制作NA實驗動物模型的動物
與人類完全相同的動物自發性哮喘模型目前還未發現，往往需要人工加以復制，盡量做到與人類NA相似。目前常用于制作NA模型的動物為小鼠、豚鼠和大鼠。
1.?小鼠：價廉易得，遺傳背景明確，便于探討哮喘氣道炎癥反應及氣道高反應性(airway hyperreactivity，AHR)產生的免疫遺傳機制，目前小鼠已成為國內外用來構建哮喘模型最常用的動物，尤其是BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠。小鼠因品系不同而對致敏原的反應有差異，BALB/c小鼠對致敏原較易產生AHR，而C57BL/6小鼠則不易產生AHR[6]。Hayashi等[7]發現小鼠性別對實驗研究也存在影響，在雞卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘發成熟雌/雄性BALB/c小鼠的遲發性氣道炎癥中，雌性小鼠氣道炎癥細胞浸潤的程度比雄性小鼠嚴重，且其支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎癥細胞數也較雄性多，所以常選擇雌性小鼠用于NA實驗研究。
2.?豚鼠：豚鼠是所有實驗動物中補體含量最多的一種，已廣泛用于遲發型和速發型變態反應的研究，是國內外用于模擬人類哮喘生理學異常常用的動物。豚鼠遲發型變態反應與人相似，采用2~3個月齡或350~400g的豚鼠作遲發型反應研究最合適。不同花色的豚鼠體內免疫球蛋白的含量不同，例如白化豚鼠產生免疫球蛋白的能力較弱，對生活環境中的抗原刺激免疫應答能力顯著低于花色豚鼠[8]。
3.?大鼠：價廉易養，繁殖力強，生物學試劑種類多且易獲得，標本采集量相對較充足，對抗原的反應性較為一致，大鼠基因組與人類的基因組序列比較相似。目前我國最常用于哮喘研究的大鼠有SD大鼠和Wistar大鼠，國外多用Brown Norway大鼠。其中，SD大鼠較Wistar大鼠對呼吸道疾病的抵抗力更強。
二 變應原誘發的NA動物模型
目前用于復制NA模型的變應原主要有OVA、豚草(ragweed，RW)、對甲苯二異氰酸酯(toluene di-isocyanate，TDI)、塵螨(house dust mites，HDM)等。
1.?基于OVA誘發的NA模型：迄今為止，OVA是制備哮喘動物模型最常用的致敏原，有單純OVA和復合OVA(含佐劑)兩種，以復合OVA較常用。除了致敏原以外，細菌內毒素(LPS)[9]、環境污染[10]、香煙煙霧[11]、支原體感染[12]等許多非過敏性因素也可導致哮喘患者或小鼠氣道NEU增多，活性增強，并與AHR有關，因此通常采用OVA聯合非過敏因素建NA實驗動物模型。
(1)?OVA和弗氏完全佐劑(complete Freund’S adjuvant，CFA)誘導的NA動物模型：許多研究證實NA與Th1/Th17抗原特異性反應有關，Th1/Th17細胞主要通過釋放的細胞因子如白細胞介素(interleukin, IL-17)等發揮作用，參與誘導氣道NEU的募集和加重AHR[13]。而CFA是一種強有力的誘導CD4+ T細胞向Th1/Th17細胞分化的佐劑，是目前最常用于動物實驗的佐劑。Bogaert等[14]將OVA聯合CFA致敏和OVA激發成功建立了NA動物模型。此模型表現出明顯的氣道NEU炎癥，但是研究者沒有進一步檢測哮喘小鼠的AHR。Dejager等[15]用同樣的方法成功復制NA模型，BALF中NEU%達59%，出現明顯的AHR，補充了前者的不足，也證明了此方法具有良好的重復性。我們實驗室曾用類似的方法成功建立豚鼠NA模型，彌補了小鼠NA模型取材困難、標本量少等不足，可以滿足對標本量需求大的研究的要求，但是氣道NEU浸潤不及小鼠模型明顯[16]。說明用OVA聯合CFA致敏、激發的方法在不同鼠種之間有一定的差異性。
(2)?OVA和脂多糖(LPS)誘發的NA模型：LPS是一種常用的佐劑，它是革蘭陰性桿菌細胞壁的共同成分，它可通過激活多條信號通路，高效誘導細胞因子合成與釋放，激發炎癥反應，加重AHR[17]，也可以誘導NEU、EOS的募集，從而加重哮喘[9]，因此LPS常用于復制NA動物模型。Bergquist等[18]用BALB/c雌性小鼠腹腔注射10 μg OVA致敏，霧化吸入1%OVA+LPS+PBS混合氣溶膠激發，成功復制NA實驗動物模型，并從蛋白質組學分析EA與NA的不同，進一步確定了此模型符合NA。
我國多位學者采用OVA聯合LPS致敏3次、霧化吸入OVA連續2周激發的方法均成功建立小鼠NA模型[19-20]。此小鼠NA模型發病早期AHR與氣道炎癥分離，發病晚期AHR發生機制不同于早期，最可能與氣道NEU數量增多有關[20]。趙燕等[21]成功構建了以Th17應答為主的氣道NEU增高的小鼠哮喘模型。此模型BALF中除NEU明顯增加外，EOS也有大量增加，兩者之間的差距不如其他模型明顯。
綜合上述OVA聯合LPS復制的NA模型，有以下特點：(1)?實驗對象均為小鼠。(2)?多采用腹腔注射、氣道滴入或者兩者聯合的方式系統致敏。致敏時OVA的量為50~200 μg，而LPS的量為0.1 μg或10 μg。(3)?多采用1%的OVA霧化吸入激發，也有吸入15%的OVA，激發時間可長達14 d。(4)?NA模型均出現AHR，BALF中炎癥細胞以NEU增加為主，以及氣道炎癥以NEU浸潤為主的病理改變。以上模型說明OVA聯合LPS復制NA模型具有良好的調節性和穩定性。但是此類模型對LPS的量及誘導時間要求比較嚴格，LPS的量過多或過少均會影響模型的成功率。
(3)?OVA和香煙煙霧暴露誘發的NA模型：研究表明吸煙可導致氣道Th2炎癥向Th1炎癥轉化[22]，Min等[11]發現OVA聯合香煙煙霧暴露誘導的哮喘小鼠比單獨使用OVA誘導的哮喘小鼠AHR更明顯，BALF中NEU顯著增高，肺組織NEU炎癥浸潤顯著。劉巧維[23]以Wistar大鼠為實驗對象，在單純哮喘模型的基礎上處以煙霧暴露建立NA模型，病理改變為支氣管壁增厚，支氣管腔內及周圍氣道見大量NEU浸潤及較少的EOS，肺組織支氣管炎癥評分中NEU積分顯著高于EOS積分。此模型激發時間長達8周，有利于NEU氣道炎癥和氣道重塑的形成。
(4)?OVA和衣原體感染誘發的NA模型：Patel等[12]發現衣原體感染的哮喘患者誘導痰中NEU比未感染的患者增加明顯，另有實驗證實衣原體可以誘導小鼠氣道NEU大量涌入[24]，推測衣原體感染與NA發展密切相關。Horvat等[25]用OVA聯合衣原體感染復制NA模型，衣原體感染可促進Th1細胞免疫反應，使小鼠血和BALF中NEU大量增加，也可抑制Th2細胞免疫反應使EOS減少，并出現AHR、黏液細胞增生等。此模型為研究衣原體感染與哮喘以及與Th1/Th17相關免疫反應疾病關系的機制研究提供了平臺。
綜合以上OVA所誘導的NA哮喘模型，現將模型致敏、激發以及激發后氣道炎癥反應比較分析如下(表 1)。
表1
OVA所誘導的NA哮喘模型制作方法及炎癥變化比較
2.?RW誘發的NA模型：OVA是哮喘研究中最常用的抗原，但RW比OVA更接近臨床相關抗原，其誘導的NA比OVA誘導的NA程度更高，更加具有代表性，且不需要長時間日常霧化曝光，或者使用佐劑。Srivastava等[26]以RW為致敏原建立NA模型，模型組出現AHR，BALF中NEU顯著增加至(32.5±2.9)%，約為EOS的3倍，氣管、血管周圍大量的炎癥細胞浸潤，杯狀細胞增生，黏液分泌增加等。RW誘導NEU炎癥不是由內毒素引起，而是歸因于RW內的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，因為RW的內毒素水平只有OVA的0.001%。
3.?TDI誘發的NA模型：TDI屬于低分子量化學物質，對機體有半抗原特性，在高濃度情況下具有明顯的黏膜刺激和腐蝕作用，是重要的職業性致喘物之一，臨床研究發現TDI誘導的職業性哮喘誘導痰中往往以NEU為主。宋甲富等[27]用0.3%TDI耳廓致敏2次及口咽部吸入0.01%TDI激發3次建立小鼠NA模型，發現BALF中NEU(約占20%)較對照組顯著增加，出現AHR，支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤同時伴有支氣管上皮的增生。此模型為研究職業性NA提供了新的平臺。
4.?其他NEU增加明顯的重癥哮喘動物模型：目前大量研究已證實NA與重癥哮喘密切相關，且存在激素抵抗。Jiang等[28]用皮下注射、腹腔注射OVA致敏，霧化吸入OVA激發，LPS鼻腔滴入誘導的方法建立以NEU增加為主的重癥哮喘小鼠模型。多種致敏原誘發的哮喘接近臨床重癥哮喘患者的病情，Liu等[29]用3種天然抗原HDM、RW、煙曲霉的提取物共同致敏和激發，建立以NEU增加為主的哮喘模型。此模型具有以下特點：(1)?大量NEU炎癥浸潤和氣道重塑；(2)?高水平的IL-8以及肺上皮細胞和杯狀細胞增生使黏液分泌增加；(3)?地塞米松治療產生抵抗；(4)?NEU氣道炎癥可能與核因子κB(NF-κB)的活性增加有關。此類模型激發時間一般較其他模型長，對氣道反復刺激，氣道反應性增加，出現氣道重塑以及對激素治療抵抗，因此也可用于研究NEU與激素抵抗型哮喘之間關系的研究。
三 NA動物模型檢測指標的測定
動物模型應盡量接近人類疾病。對于NA，理想的動物模型至少應具備NEU浸潤為主的氣道炎癥和AHR兩大特征。目前主要有如下檢測指標。
1.?血或BALF中炎癥細胞的測定：利用涂片、推片技術，瑞士-吉姆薩染色或迪夫快速染色、血球計數儀或流式細胞術等計數血或BALF中細胞總數并進行細胞分類計數。綜合上述模型，我們發現OVA聯合CFA誘導的小鼠NA模型BALF中NEU%較其他模型高，可高達59%，接近臨床NA哮喘患者，且具有良好的重復性及穩定性[15]。
2.?AHR的測定：AHR為哮喘的重要特征，在NA中更明顯[20, 29]。測量動物AHR主要包括整體測量方法和離體測量方法。整體法又主要分為無創法和有創法。無創測量最常用的是Penh(Ehanced pause)的測定，主要通過體積描記法測量計算得出，它最大可能地避免了人為因素對測量結果的影響，但現在并沒有一種理論能說明它與氣道反應性存在必然的相關性[30-31]。有創測量方法是基于單室呼吸模型以及相應的物理公式來進行計算的，主要包括氣道阻抗(input impedance，Zin)、肺阻力(lung resistance，RL)、轉移阻抗(transfer impedance，Ztr)的測定等。Zin是基于強迫脈沖震蕩技術(forced oscillation technique，FOT)原理，是目前最精確、最為標準的測量方法。RL的測定最簡單，國內最常用[32]。離體測量方法是采用電刺激小鼠離體氣管平滑肌測定其收縮能力，但該方法很難反映由氣道內黏液分泌、黏膜水腫及小氣道病變所引起的肺通氣功能障礙，目前已少用。
3.?肺組織病理學檢查：HE染色或過碘酸雪夫染色檢查氣道、肺泡、肺組織等結構的變化，以及杯狀細胞增生、炎癥細胞浸潤情況，或利用免疫組織化學、蛋白免疫印跡、Q-PCR等技術，觀察肺組織中與NEU增加相關的細胞因子的表達情況。
四 NA模型的評價與展望
目前NA是臨床治療的一個難點，其發病機制及防治已成為研究熱點，迫切需要合適的動物模型來推動其發展。由于NA動物模型研究在起步階段，尚無統一的標準來評定NA模型。以往通常用肺功能及BALF中炎癥細胞計數來描述哮喘表型，目前我們發現NA模型中BALF中NEU%在20%~59%，并未達到Simpson等[5]所定義的NA氣道NEU%大于61%的標準。但是綜合以上所有NA動物模型，可初步推測只要是BALF中NEU%大于20%且以NEU炎癥為主的哮喘模型就可以認為是NA模型。由于存在種群差異性，將來的研究可以擴大樣本量，并進一步優化致敏原及佐劑，制定明確的NA動物模型評判標準。此外，個別學者認為蛋白組學[18]、肺組織支氣管炎癥積分[23]可以用于鑒定NA模型，也許還有其他的方法可以用于鑒定NA哮喘模型，將來還需要進一步的拓展。在合理標準的指引下制備出更加接近人類的NA實驗模型，可為NA的病因、發病機制、藥物研發、治療和預防研究提供更好的平臺。
支氣管哮喘(簡稱哮喘)是由多種細胞和細胞組分參與的慢性炎癥性疾病。既往認為嗜酸粒細胞(eosinophil，EOS)為哮喘的主要炎癥細胞。近年來，大量研究證實中性粒細胞(neutrophil，NEU)在哮喘的發生、發展中起著重要作用。Douwes等[1]發現約50%的哮喘是由NEU引起，且NEU與重癥哮喘[2]、遲發型哮喘[3]、激素不敏感型哮喘[4]等密切相關。2006年Simpson等[5]將誘導痰中中性粒細胞百分比(NEU%)＞61%的哮喘患者列為哮喘的一個獨立的亞型——中性粒細胞哮喘(neutrophilic asthma，NA)。NA以其高發病率和難控性而受到廣泛關注，其病因、發病機制、新藥研發和評價、預防及治療均為目前研究的熱點，而這一切均需要成熟可靠的NA實驗動物模型為載體。本文綜述了NA實驗動物模型的常用動物、造模方法及檢測指標，并對其未來的研究前景進行展望。
一 常用于制作NA實驗動物模型的動物
與人類完全相同的動物自發性哮喘模型目前還未發現，往往需要人工加以復制，盡量做到與人類NA相似。目前常用于制作NA模型的動物為小鼠、豚鼠和大鼠。
1.?小鼠：價廉易得，遺傳背景明確，便于探討哮喘氣道炎癥反應及氣道高反應性(airway hyperreactivity，AHR)產生的免疫遺傳機制，目前小鼠已成為國內外用來構建哮喘模型最常用的動物，尤其是BALB/c小鼠、C57BL/6小鼠。小鼠因品系不同而對致敏原的反應有差異，BALB/c小鼠對致敏原較易產生AHR，而C57BL/6小鼠則不易產生AHR[6]。Hayashi等[7]發現小鼠性別對實驗研究也存在影響，在雞卵清蛋白(ovalbumin，OVA)誘發成熟雌/雄性BALB/c小鼠的遲發性氣道炎癥中，雌性小鼠氣道炎癥細胞浸潤的程度比雄性小鼠嚴重，且其支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中炎癥細胞數也較雄性多，所以常選擇雌性小鼠用于NA實驗研究。
2.?豚鼠：豚鼠是所有實驗動物中補體含量最多的一種，已廣泛用于遲發型和速發型變態反應的研究，是國內外用于模擬人類哮喘生理學異常常用的動物。豚鼠遲發型變態反應與人相似，采用2~3個月齡或350~400g的豚鼠作遲發型反應研究最合適。不同花色的豚鼠體內免疫球蛋白的含量不同，例如白化豚鼠產生免疫球蛋白的能力較弱，對生活環境中的抗原刺激免疫應答能力顯著低于花色豚鼠[8]。
3.?大鼠：價廉易養，繁殖力強，生物學試劑種類多且易獲得，標本采集量相對較充足，對抗原的反應性較為一致，大鼠基因組與人類的基因組序列比較相似。目前我國最常用于哮喘研究的大鼠有SD大鼠和Wistar大鼠，國外多用Brown Norway大鼠。其中，SD大鼠較Wistar大鼠對呼吸道疾病的抵抗力更強。
二 變應原誘發的NA動物模型
目前用于復制NA模型的變應原主要有OVA、豚草(ragweed，RW)、對甲苯二異氰酸酯(toluene di-isocyanate，TDI)、塵螨(house dust mites，HDM)等。
1.?基于OVA誘發的NA模型：迄今為止，OVA是制備哮喘動物模型最常用的致敏原，有單純OVA和復合OVA(含佐劑)兩種，以復合OVA較常用。除了致敏原以外，細菌內毒素(LPS)[9]、環境污染[10]、香煙煙霧[11]、支原體感染[12]等許多非過敏性因素也可導致哮喘患者或小鼠氣道NEU增多，活性增強，并與AHR有關，因此通常采用OVA聯合非過敏因素建NA實驗動物模型。
(1)?OVA和弗氏完全佐劑(complete Freund’S adjuvant，CFA)誘導的NA動物模型：許多研究證實NA與Th1/Th17抗原特異性反應有關，Th1/Th17細胞主要通過釋放的細胞因子如白細胞介素(interleukin, IL-17)等發揮作用，參與誘導氣道NEU的募集和加重AHR[13]。而CFA是一種強有力的誘導CD4+ T細胞向Th1/Th17細胞分化的佐劑，是目前最常用于動物實驗的佐劑。Bogaert等[14]將OVA聯合CFA致敏和OVA激發成功建立了NA動物模型。此模型表現出明顯的氣道NEU炎癥，但是研究者沒有進一步檢測哮喘小鼠的AHR。Dejager等[15]用同樣的方法成功復制NA模型，BALF中NEU%達59%，出現明顯的AHR，補充了前者的不足，也證明了此方法具有良好的重復性。我們實驗室曾用類似的方法成功建立豚鼠NA模型，彌補了小鼠NA模型取材困難、標本量少等不足，可以滿足對標本量需求大的研究的要求，但是氣道NEU浸潤不及小鼠模型明顯[16]。說明用OVA聯合CFA致敏、激發的方法在不同鼠種之間有一定的差異性。
(2)?OVA和脂多糖(LPS)誘發的NA模型：LPS是一種常用的佐劑，它是革蘭陰性桿菌細胞壁的共同成分，它可通過激活多條信號通路，高效誘導細胞因子合成與釋放，激發炎癥反應，加重AHR[17]，也可以誘導NEU、EOS的募集，從而加重哮喘[9]，因此LPS常用于復制NA動物模型。Bergquist等[18]用BALB/c雌性小鼠腹腔注射10 μg OVA致敏，霧化吸入1%OVA+LPS+PBS混合氣溶膠激發，成功復制NA實驗動物模型，并從蛋白質組學分析EA與NA的不同，進一步確定了此模型符合NA。
我國多位學者采用OVA聯合LPS致敏3次、霧化吸入OVA連續2周激發的方法均成功建立小鼠NA模型[19-20]。此小鼠NA模型發病早期AHR與氣道炎癥分離，發病晚期AHR發生機制不同于早期，最可能與氣道NEU數量增多有關[20]。趙燕等[21]成功構建了以Th17應答為主的氣道NEU增高的小鼠哮喘模型。此模型BALF中除NEU明顯增加外，EOS也有大量增加，兩者之間的差距不如其他模型明顯。
綜合上述OVA聯合LPS復制的NA模型，有以下特點：(1)?實驗對象均為小鼠。(2)?多采用腹腔注射、氣道滴入或者兩者聯合的方式系統致敏。致敏時OVA的量為50~200 μg，而LPS的量為0.1 μg或10 μg。(3)?多采用1%的OVA霧化吸入激發，也有吸入15%的OVA，激發時間可長達14 d。(4)?NA模型均出現AHR，BALF中炎癥細胞以NEU增加為主，以及氣道炎癥以NEU浸潤為主的病理改變。以上模型說明OVA聯合LPS復制NA模型具有良好的調節性和穩定性。但是此類模型對LPS的量及誘導時間要求比較嚴格，LPS的量過多或過少均會影響模型的成功率。
(3)?OVA和香煙煙霧暴露誘發的NA模型：研究表明吸煙可導致氣道Th2炎癥向Th1炎癥轉化[22]，Min等[11]發現OVA聯合香煙煙霧暴露誘導的哮喘小鼠比單獨使用OVA誘導的哮喘小鼠AHR更明顯，BALF中NEU顯著增高，肺組織NEU炎癥浸潤顯著。劉巧維[23]以Wistar大鼠為實驗對象，在單純哮喘模型的基礎上處以煙霧暴露建立NA模型，病理改變為支氣管壁增厚，支氣管腔內及周圍氣道見大量NEU浸潤及較少的EOS，肺組織支氣管炎癥評分中NEU積分顯著高于EOS積分。此模型激發時間長達8周，有利于NEU氣道炎癥和氣道重塑的形成。
(4)?OVA和衣原體感染誘發的NA模型：Patel等[12]發現衣原體感染的哮喘患者誘導痰中NEU比未感染的患者增加明顯，另有實驗證實衣原體可以誘導小鼠氣道NEU大量涌入[24]，推測衣原體感染與NA發展密切相關。Horvat等[25]用OVA聯合衣原體感染復制NA模型，衣原體感染可促進Th1細胞免疫反應，使小鼠血和BALF中NEU大量增加，也可抑制Th2細胞免疫反應使EOS減少，并出現AHR、黏液細胞增生等。此模型為研究衣原體感染與哮喘以及與Th1/Th17相關免疫反應疾病關系的機制研究提供了平臺。
綜合以上OVA所誘導的NA哮喘模型，現將模型致敏、激發以及激發后氣道炎癥反應比較分析如下(表 1)。
表1
OVA所誘導的NA哮喘模型制作方法及炎癥變化比較
2.?RW誘發的NA模型：OVA是哮喘研究中最常用的抗原，但RW比OVA更接近臨床相關抗原，其誘導的NA比OVA誘導的NA程度更高，更加具有代表性，且不需要長時間日常霧化曝光，或者使用佐劑。Srivastava等[26]以RW為致敏原建立NA模型，模型組出現AHR，BALF中NEU顯著增加至(32.5±2.9)%，約為EOS的3倍，氣管、血管周圍大量的炎癥細胞浸潤，杯狀細胞增生，黏液分泌增加等。RW誘導NEU炎癥不是由內毒素引起，而是歸因于RW內的還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶，因為RW的內毒素水平只有OVA的0.001%。
3.?TDI誘發的NA模型：TDI屬于低分子量化學物質，對機體有半抗原特性，在高濃度情況下具有明顯的黏膜刺激和腐蝕作用，是重要的職業性致喘物之一，臨床研究發現TDI誘導的職業性哮喘誘導痰中往往以NEU為主。宋甲富等[27]用0.3%TDI耳廓致敏2次及口咽部吸入0.01%TDI激發3次建立小鼠NA模型，發現BALF中NEU(約占20%)較對照組顯著增加，出現AHR，支氣管及血管周圍炎癥細胞浸潤同時伴有支氣管上皮的增生。此模型為研究職業性NA提供了新的平臺。
4.?其他NEU增加明顯的重癥哮喘動物模型：目前大量研究已證實NA與重癥哮喘密切相關，且存在激素抵抗。Jiang等[28]用皮下注射、腹腔注射OVA致敏，霧化吸入OVA激發，LPS鼻腔滴入誘導的方法建立以NEU增加為主的重癥哮喘小鼠模型。多種致敏原誘發的哮喘接近臨床重癥哮喘患者的病情，Liu等[29]用3種天然抗原HDM、RW、煙曲霉的提取物共同致敏和激發，建立以NEU增加為主的哮喘模型。此模型具有以下特點：(1)?大量NEU炎癥浸潤和氣道重塑；(2)?高水平的IL-8以及肺上皮細胞和杯狀細胞增生使黏液分泌增加；(3)?地塞米松治療產生抵抗；(4)?NEU氣道炎癥可能與核因子κB(NF-κB)的活性增加有關。此類模型激發時間一般較其他模型長，對氣道反復刺激，氣道反應性增加，出現氣道重塑以及對激素治療抵抗，因此也可用于研究NEU與激素抵抗型哮喘之間關系的研究。
三 NA動物模型檢測指標的測定
動物模型應盡量接近人類疾病。對于NA，理想的動物模型至少應具備NEU浸潤為主的氣道炎癥和AHR兩大特征。目前主要有如下檢測指標。
1.?血或BALF中炎癥細胞的測定：利用涂片、推片技術，瑞士-吉姆薩染色或迪夫快速染色、血球計數儀或流式細胞術等計數血或BALF中細胞總數并進行細胞分類計數。綜合上述模型，我們發現OVA聯合CFA誘導的小鼠NA模型BALF中NEU%較其他模型高，可高達59%，接近臨床NA哮喘患者，且具有良好的重復性及穩定性[15]。
2.?AHR的測定：AHR為哮喘的重要特征，在NA中更明顯[20, 29]。測量動物AHR主要包括整體測量方法和離體測量方法。整體法又主要分為無創法和有創法。無創測量最常用的是Penh(Ehanced pause)的測定，主要通過體積描記法測量計算得出，它最大可能地避免了人為因素對測量結果的影響，但現在并沒有一種理論能說明它與氣道反應性存在必然的相關性[30-31]。有創測量方法是基于單室呼吸模型以及相應的物理公式來進行計算的，主要包括氣道阻抗(input impedance，Zin)、肺阻力(lung resistance，RL)、轉移阻抗(transfer impedance，Ztr)的測定等。Zin是基于強迫脈沖震蕩技術(forced oscillation technique，FOT)原理，是目前最精確、最為標準的測量方法。RL的測定最簡單，國內最常用[32]。離體測量方法是采用電刺激小鼠離體氣管平滑肌測定其收縮能力，但該方法很難反映由氣道內黏液分泌、黏膜水腫及小氣道病變所引起的肺通氣功能障礙，目前已少用。
3.?肺組織病理學檢查：HE染色或過碘酸雪夫染色檢查氣道、肺泡、肺組織等結構的變化，以及杯狀細胞增生、炎癥細胞浸潤情況，或利用免疫組織化學、蛋白免疫印跡、Q-PCR等技術，觀察肺組織中與NEU增加相關的細胞因子的表達情況。
四 NA模型的評價與展望
目前NA是臨床治療的一個難點，其發病機制及防治已成為研究熱點，迫切需要合適的動物模型來推動其發展。由于NA動物模型研究在起步階段，尚無統一的標準來評定NA模型。以往通常用肺功能及BALF中炎癥細胞計數來描述哮喘表型，目前我們發現NA模型中BALF中NEU%在20%~59%，并未達到Simpson等[5]所定義的NA氣道NEU%大于61%的標準。但是綜合以上所有NA動物模型，可初步推測只要是BALF中NEU%大于20%且以NEU炎癥為主的哮喘模型就可以認為是NA模型。由于存在種群差異性，將來的研究可以擴大樣本量，并進一步優化致敏原及佐劑，制定明確的NA動物模型評判標準。此外，個別學者認為蛋白組學[18]、肺組織支氣管炎癥積分[23]可以用于鑒定NA模型，也許還有其他的方法可以用于鑒定NA哮喘模型，將來還需要進一步的拓展。在合理標準的指引下制備出更加接近人類的NA實驗模型，可為NA的病因、發病機制、藥物研發、治療和預防研究提供更好的平臺。
