引用本文： 謝哲凡, 董航明, 魏依藍, 黃超文, 蔡紹曦. 低氧微環境對人肺癌細胞上皮間充質轉化及遷移侵襲能力的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(5): 465-469. doi: 10.7507/1671-6205.2016109 復制
腫瘤微環境，主要是指腫瘤組織所在的局部環境，它與腫瘤細胞本身是相輔相成的[1]。當腫瘤組織生長過于快速時，周圍血管無法提供給腫瘤細胞足夠的營養和氧氣，使其處于低氧的微環境之中。低氧是腫瘤微環境最為重要的一個標志，是所有實體腫瘤的普遍特性，同時也是腫瘤發生轉移的惡性啟動因素之一。當腫瘤細胞處在這樣一個缺氧的環境中時，其自身會發生多種細微的改變，如上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT是一個上皮細胞逐漸轉化為間充質樣細胞的過程[2]。EMT過程中上皮細胞失去細胞極性和粘附能力，并成為擁有遷移和侵襲屬性的間質表型，這是導致腫瘤轉移的一個重要因素。在肺癌中，仍未清楚的是低氧微環境是否會促進肺癌細胞的轉移，而肺癌細胞的轉移又是否通過細胞EMT來進行。
材料與方法
一 材料
H460細胞系、RPMI1640培養基(Gibco)、胎牛血清(FBS，Gibco)、PBS(Gibco)、胰酶(吉諾生物)、總蛋白提取試劑盒(南京凱基)、結晶紫(Sigma)、無水乙醇(廣州化學試劑廠)、甘氨酸(Sigma)、Tris-base(Sigma)、SDS(華奇盛生物)、脫脂奶粉(Sigma)、PVDF膜(Bio-Rad)、甲醇(廣州華大)、TEMED(Biosharp)、吐溫-20(斯佳生物)、兔抗人β肌動蛋白(β-actin)抗體(Abcam)、小鼠抗人低氧誘導因子1α(HIF-1α)單抗(Abcam)、兔抗人E-cadherin抗體(Santa)、兔抗人Vimentin抗體(Abcam)、驢抗兔、鼠IgG-HRP二抗(Cell Signaling)、ECL化學發光試劑盒(南京凱基)、4%多聚甲醛(博士德)、Transwell板(Corning)。
二 方法
1．H460細胞培養：H460(人大細胞肺癌細胞系)購于中山大學實驗動物中心細胞庫，將細胞復蘇后接種在含10%FBS的RPMI1640培養基中，放置在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，每隔2 d更換1次培養液。等到細胞大概生長到90%融合后，用0.25%濃度的胰酶消化2 min，收集細胞懸液，在室溫環境中離心2 min，棄上清并重懸細胞，將細胞按實驗要求的密度接種于相應規格的培養皿、瓶或培養板中，用于下一步實驗。所有實驗中使用的細胞均處于復蘇后2~4代，防止細胞老化對實驗結果產生干擾。
2．細胞分組培養：將H460細胞分為常氧組和低氧組。常氧組：將細胞置于常氧、5%CO2的培養箱中培養。低氧組：將細胞置于1%O2、5%CO2和94%N2的培養箱中培養。細胞低氧處理的前1 d，將需要低氧處理的基本培養基、PBS等液體預先放入低氧培養箱中平衡過夜，使液體中的氧含量也處于1%的低氧條件。
3．Western blot檢測EMT關鍵分子E-cadherin和Vimentin蛋白水平的變化：收集常氧組和低氧組細胞，預冷PBS洗滌2次，按RIPA裂解液說明書操作提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性后用10% SDS PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用濕電轉印法將蛋白轉印至PVDF膜上，室溫條件下封閉蛋白2 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。第2 d，TBST洗膜后加入二抗溶液，室溫孵育2 h；用ECL化學發光法顯影，拍照。Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。實驗結果重復3次。
4．Transwell遷移及侵襲實驗：H460細胞在常氧環境中培養24 h后，用無血清培養基饑餓10 h。遷移實驗中上室加入1×105個細胞的細胞懸液0.2 mL，下室加入含10%FBS的RPMI1640培養基0.6 mL。按分組分別放入常氧或低氧培養箱中。16 h后收樣，取出小室，多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下拍照。侵襲實驗在實驗前3 h將Matrgel膠按1 :3稀釋，每個上室加25 μL，收樣時間為24 h，其余操作與遷移實驗相同。
三 統計學處理
采用SPSS 20.0統計分析軟件進行數據資料的統計分析。對于計量數據資料采用Shapiro-Wilk法進行數據正態性檢驗，如果數據符合正態分布計量資料則用x±s描述。計量資料組間如果方差齊，兩樣本均數比較用獨立樣本t檢驗。假如方差不齊的話，兩樣本均數比較用近似t′檢驗。所有統計分析均為雙側檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 低氧導致細胞形態學改變
形態學改變是細胞發生EMT最直觀的指標。腫瘤細胞在發生EMT時，形態會由原來的上皮樣(即普通的貼壁樣細胞，不規則多邊形)轉變為間質樣細胞(形態更加瘦長的紡錘形)。在細胞低氧處理24 h后，顯微鏡下觀察細胞形態，可見常氧組的H460細胞呈不規則的多邊形，而低氧組細胞開始出現紡錘形改變，部分細胞變得更加瘦長，結果見圖 1。
圖1
低氧誘導細胞發生EMT相關的形態學變化(×100)
二 低氧對EMT標志物的影響
細胞發生EMT時，往往會伴隨著蛋白表達量的改變，而其中上皮細胞標志蛋白(如E-cadherin)的減少和間質細胞標志蛋白(如Vimentin)的增加是判斷細胞是否發生了EMT的標志。H460在低氧處理24 h后，可以看到HIP-1α有一定量的增高，證明低氧刺激有效。以β-actin為內參蛋白，3次重復實驗的條帶灰度值分析結果顯示，與常氧組相比，低氧組的上皮標志蛋白E-cadherin表達下調，而間質標志蛋白Vimentin增加，差異有統計學意義。結果見圖 2。
圖2
低氧誘導細胞發生EMT相關的分子改變
*
三 低氧對細胞遷移能力的影響
EMT的發生可引起功能學的變化，表現為腫瘤細胞的侵襲性和遷移能力明顯增強，可能也與腫瘤晚期轉移有關。使用Transwell細胞遷移實驗，觀察低氧處理后肺癌細胞遷移能力的改變。實驗結果顯示，在接種16 h后，低氧處理過的H460細胞穿過濾膜的細胞數明顯多于常氧對照組，差異有統計學意義。低氧應激促進了腫瘤細胞的遷移能力。結果見圖 3。
圖3
低氧促進H460細胞的遷移能力(×40)
*
四 低氧對細胞侵襲能力的影響
既然低氧應激可以提高細胞的遷移能力，那么肺癌細胞在低氧環境下的侵襲能力是否也會增強呢？我們通過Transwell侵襲實驗觀察H460細胞在低氧刺激下侵襲能力的變化。在接種處理24 h后，低氧組細胞穿透濾膜至小室背面的細胞數明顯要高于常氧處理的細胞，差異有統計學意義。低氧應激提高了A549細胞的侵襲能力。結果見圖 4。
圖4
低氧促進H460細胞的侵襲能力(×40)
*
3 討論
腫瘤微環境是指腫瘤組織所在的局部環境，它不僅包括腫瘤所在組織的外部環境，而且也與腫瘤細胞自身的內在環境有關[3]，在腫瘤的發生、發展和轉移中起到了重要的作用。與正常組織所處的環境相比，腫瘤微環境往往具有組織低氧、間質高壓和營養缺乏等特殊的生物學特征[4]，而低氧是腫瘤微環境主要的特點之一。
低氧是腫瘤發生惡性轉移的啟動因素之一[5]。腫瘤組織本身生長迅速，血管生成的速度遠遠趕不上腫瘤生長的速度，因此外部氧氣的供應不足以保證腫瘤微環境局部的氧含量。另一方面，腫瘤組織本身處于高代謝狀態，對氧氣和養分的需求量要遠遠高于正常組織，這又加劇了原本的缺氧狀態。正常組織在這種高度缺氧的環境是無法生存的，但腫瘤組織卻可以通過各種生物學調整很好地適應這種特殊的環境。但這是一種惡性循環，這種惡劣的環境使腫瘤的基因組更加不穩定，易于產生更多的突變，即異質性。而適應環境生存下來的腫瘤細胞的增殖又會繼續加劇微環境的缺氧狀況。在這樣的缺氧條件下，腫瘤細胞往往會通過自分泌或旁分泌作用改變自身周圍生存和發展的環境，促進腫瘤繼續生長和發展。腫瘤細胞本身的一些特征也會隨之改變，發生EMT，使其更有利于脫離目前的惡劣環境，轉移到新的部位[6]。
EMT是一個上皮樣細胞逐漸轉化為間充質樣細胞的過程，同時失去上皮細胞大部分的功能和特點。目前普遍認為，EMT參與了許多肺部疾病的發病機制，例如肺組織發育不全、組織纖維化重塑、肺癌等[7]。EMT過程中上皮細胞失去細胞極性和粘附能力，并成為擁有遷移和侵襲屬性的間質表型，這是導致腫瘤轉移的一個重要因素。低氧環境是調節腫瘤細胞EMT的重要因素。許多腫瘤細胞在低氧環境下更容易發生EMT，這使得它們更容易發生遠位轉移。同時，細胞發生EMT，與其產生的獲得性耐藥相關[8-9]。研究發現在體外誘導耐藥細胞株時，細胞同時往往會同時發生EMT的改變，如細胞形態由原來的鋪路石樣變為細長的紡錘體樣，上皮樣標志物表達下調，而像Vimentin之類的間充質標志物會隨著升高。
同樣，EMT在非小細胞肺癌的發生發展中也起到了重要作用[10]。Sulzer等[11]發現非小細胞肺癌患者的預后與EMT標志物E-cadherin的表達量密切相關，E-cadherin上調的患者3年生存率為60%，但是表達較低的患者3年生存率僅為30%左右。近年來也有相關研究發現，另一個EMT相關標志物Vimentin也與肺癌的遠處轉移相關[12]。化療是晚期非小細胞肺癌治療的主要手段，而腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性則決定了患者的生存率[13]，肺癌的耐藥往往與EMT相關[14]。研究發現，肺癌組織的EMT程度與化療的敏感性呈負相關關系[15]。因此，進一步加深肺癌與EMT關系的研究有助于肺癌的防治。我們在非小細胞肺癌細胞系H460上也看到了這樣的結果，肺癌細胞在1%的低氧環境中24 h之后，細胞形態出現了間充質樣改變，遷移和侵襲能力大大增強，說明低氧也是非小細胞肺癌發生EMT的重要誘導因素。
綜上所述，低氧微環境可以明顯誘導肺癌細胞發生EMT，使腫瘤細胞更容易發生轉移，引起不良的預后。因此，改善腫瘤低氧微環境或許可以成為治療肺癌的新方法。
腫瘤微環境，主要是指腫瘤組織所在的局部環境，它與腫瘤細胞本身是相輔相成的[1]。當腫瘤組織生長過于快速時，周圍血管無法提供給腫瘤細胞足夠的營養和氧氣，使其處于低氧的微環境之中。低氧是腫瘤微環境最為重要的一個標志，是所有實體腫瘤的普遍特性，同時也是腫瘤發生轉移的惡性啟動因素之一。當腫瘤細胞處在這樣一個缺氧的環境中時，其自身會發生多種細微的改變，如上皮間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)。EMT是一個上皮細胞逐漸轉化為間充質樣細胞的過程[2]。EMT過程中上皮細胞失去細胞極性和粘附能力，并成為擁有遷移和侵襲屬性的間質表型，這是導致腫瘤轉移的一個重要因素。在肺癌中，仍未清楚的是低氧微環境是否會促進肺癌細胞的轉移，而肺癌細胞的轉移又是否通過細胞EMT來進行。
材料與方法
一 材料
H460細胞系、RPMI1640培養基(Gibco)、胎牛血清(FBS，Gibco)、PBS(Gibco)、胰酶(吉諾生物)、總蛋白提取試劑盒(南京凱基)、結晶紫(Sigma)、無水乙醇(廣州化學試劑廠)、甘氨酸(Sigma)、Tris-base(Sigma)、SDS(華奇盛生物)、脫脂奶粉(Sigma)、PVDF膜(Bio-Rad)、甲醇(廣州華大)、TEMED(Biosharp)、吐溫-20(斯佳生物)、兔抗人β肌動蛋白(β-actin)抗體(Abcam)、小鼠抗人低氧誘導因子1α(HIF-1α)單抗(Abcam)、兔抗人E-cadherin抗體(Santa)、兔抗人Vimentin抗體(Abcam)、驢抗兔、鼠IgG-HRP二抗(Cell Signaling)、ECL化學發光試劑盒(南京凱基)、4%多聚甲醛(博士德)、Transwell板(Corning)。
二 方法
1．H460細胞培養：H460(人大細胞肺癌細胞系)購于中山大學實驗動物中心細胞庫，將細胞復蘇后接種在含10%FBS的RPMI1640培養基中，放置在37 ℃、5%CO2的恒溫培養箱中培養，每隔2 d更換1次培養液。等到細胞大概生長到90%融合后，用0.25%濃度的胰酶消化2 min，收集細胞懸液，在室溫環境中離心2 min，棄上清并重懸細胞，將細胞按實驗要求的密度接種于相應規格的培養皿、瓶或培養板中，用于下一步實驗。所有實驗中使用的細胞均處于復蘇后2~4代，防止細胞老化對實驗結果產生干擾。
2．細胞分組培養：將H460細胞分為常氧組和低氧組。常氧組：將細胞置于常氧、5%CO2的培養箱中培養。低氧組：將細胞置于1%O2、5%CO2和94%N2的培養箱中培養。細胞低氧處理的前1 d，將需要低氧處理的基本培養基、PBS等液體預先放入低氧培養箱中平衡過夜，使液體中的氧含量也處于1%的低氧條件。
3．Western blot檢測EMT關鍵分子E-cadherin和Vimentin蛋白水平的變化：收集常氧組和低氧組細胞，預冷PBS洗滌2次，按RIPA裂解液說明書操作提取細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，煮沸變性后用10% SDS PAGE凝膠電泳分離蛋白，采用濕電轉印法將蛋白轉印至PVDF膜上，室溫條件下封閉蛋白2 h，分別加入一抗，4 ℃孵育過夜。第2 d，TBST洗膜后加入二抗溶液，室溫孵育2 h；用ECL化學發光法顯影，拍照。Image J圖像分析軟件分析條帶灰度值。實驗結果重復3次。
4．Transwell遷移及侵襲實驗：H460細胞在常氧環境中培養24 h后，用無血清培養基饑餓10 h。遷移實驗中上室加入1×105個細胞的細胞懸液0.2 mL，下室加入含10%FBS的RPMI1640培養基0.6 mL。按分組分別放入常氧或低氧培養箱中。16 h后收樣，取出小室，多聚甲醛固定，結晶紫染色，顯微鏡下拍照。侵襲實驗在實驗前3 h將Matrgel膠按1 :3稀釋，每個上室加25 μL，收樣時間為24 h，其余操作與遷移實驗相同。
三 統計學處理
采用SPSS 20.0統計分析軟件進行數據資料的統計分析。對于計量數據資料采用Shapiro-Wilk法進行數據正態性檢驗，如果數據符合正態分布計量資料則用x±s描述。計量資料組間如果方差齊，兩樣本均數比較用獨立樣本t檢驗。假如方差不齊的話，兩樣本均數比較用近似t′檢驗。所有統計分析均為雙側檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 低氧導致細胞形態學改變
形態學改變是細胞發生EMT最直觀的指標。腫瘤細胞在發生EMT時，形態會由原來的上皮樣(即普通的貼壁樣細胞，不規則多邊形)轉變為間質樣細胞(形態更加瘦長的紡錘形)。在細胞低氧處理24 h后，顯微鏡下觀察細胞形態，可見常氧組的H460細胞呈不規則的多邊形，而低氧組細胞開始出現紡錘形改變，部分細胞變得更加瘦長，結果見圖 1。
圖1
低氧誘導細胞發生EMT相關的形態學變化(×100)
二 低氧對EMT標志物的影響
細胞發生EMT時，往往會伴隨著蛋白表達量的改變，而其中上皮細胞標志蛋白(如E-cadherin)的減少和間質細胞標志蛋白(如Vimentin)的增加是判斷細胞是否發生了EMT的標志。H460在低氧處理24 h后，可以看到HIP-1α有一定量的增高，證明低氧刺激有效。以β-actin為內參蛋白，3次重復實驗的條帶灰度值分析結果顯示，與常氧組相比，低氧組的上皮標志蛋白E-cadherin表達下調，而間質標志蛋白Vimentin增加，差異有統計學意義。結果見圖 2。
圖2
低氧誘導細胞發生EMT相關的分子改變
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三 低氧對細胞遷移能力的影響
EMT的發生可引起功能學的變化，表現為腫瘤細胞的侵襲性和遷移能力明顯增強，可能也與腫瘤晚期轉移有關。使用Transwell細胞遷移實驗，觀察低氧處理后肺癌細胞遷移能力的改變。實驗結果顯示，在接種16 h后，低氧處理過的H460細胞穿過濾膜的細胞數明顯多于常氧對照組，差異有統計學意義。低氧應激促進了腫瘤細胞的遷移能力。結果見圖 3。
圖3
低氧促進H460細胞的遷移能力(×40)
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四 低氧對細胞侵襲能力的影響
既然低氧應激可以提高細胞的遷移能力，那么肺癌細胞在低氧環境下的侵襲能力是否也會增強呢？我們通過Transwell侵襲實驗觀察H460細胞在低氧刺激下侵襲能力的變化。在接種處理24 h后，低氧組細胞穿透濾膜至小室背面的細胞數明顯要高于常氧處理的細胞，差異有統計學意義。低氧應激提高了A549細胞的侵襲能力。結果見圖 4。
圖4
低氧促進H460細胞的侵襲能力(×40)
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3 討論
腫瘤微環境是指腫瘤組織所在的局部環境，它不僅包括腫瘤所在組織的外部環境，而且也與腫瘤細胞自身的內在環境有關[3]，在腫瘤的發生、發展和轉移中起到了重要的作用。與正常組織所處的環境相比，腫瘤微環境往往具有組織低氧、間質高壓和營養缺乏等特殊的生物學特征[4]，而低氧是腫瘤微環境主要的特點之一。
低氧是腫瘤發生惡性轉移的啟動因素之一[5]。腫瘤組織本身生長迅速，血管生成的速度遠遠趕不上腫瘤生長的速度，因此外部氧氣的供應不足以保證腫瘤微環境局部的氧含量。另一方面，腫瘤組織本身處于高代謝狀態，對氧氣和養分的需求量要遠遠高于正常組織，這又加劇了原本的缺氧狀態。正常組織在這種高度缺氧的環境是無法生存的，但腫瘤組織卻可以通過各種生物學調整很好地適應這種特殊的環境。但這是一種惡性循環，這種惡劣的環境使腫瘤的基因組更加不穩定，易于產生更多的突變，即異質性。而適應環境生存下來的腫瘤細胞的增殖又會繼續加劇微環境的缺氧狀況。在這樣的缺氧條件下，腫瘤細胞往往會通過自分泌或旁分泌作用改變自身周圍生存和發展的環境，促進腫瘤繼續生長和發展。腫瘤細胞本身的一些特征也會隨之改變，發生EMT，使其更有利于脫離目前的惡劣環境，轉移到新的部位[6]。
EMT是一個上皮樣細胞逐漸轉化為間充質樣細胞的過程，同時失去上皮細胞大部分的功能和特點。目前普遍認為，EMT參與了許多肺部疾病的發病機制，例如肺組織發育不全、組織纖維化重塑、肺癌等[7]。EMT過程中上皮細胞失去細胞極性和粘附能力，并成為擁有遷移和侵襲屬性的間質表型，這是導致腫瘤轉移的一個重要因素。低氧環境是調節腫瘤細胞EMT的重要因素。許多腫瘤細胞在低氧環境下更容易發生EMT，這使得它們更容易發生遠位轉移。同時，細胞發生EMT，與其產生的獲得性耐藥相關[8-9]。研究發現在體外誘導耐藥細胞株時，細胞同時往往會同時發生EMT的改變，如細胞形態由原來的鋪路石樣變為細長的紡錘體樣，上皮樣標志物表達下調，而像Vimentin之類的間充質標志物會隨著升高。
同樣，EMT在非小細胞肺癌的發生發展中也起到了重要作用[10]。Sulzer等[11]發現非小細胞肺癌患者的預后與EMT標志物E-cadherin的表達量密切相關，E-cadherin上調的患者3年生存率為60%，但是表達較低的患者3年生存率僅為30%左右。近年來也有相關研究發現，另一個EMT相關標志物Vimentin也與肺癌的遠處轉移相關[12]。化療是晚期非小細胞肺癌治療的主要手段，而腫瘤細胞對化療藥物的耐藥性則決定了患者的生存率[13]，肺癌的耐藥往往與EMT相關[14]。研究發現，肺癌組織的EMT程度與化療的敏感性呈負相關關系[15]。因此，進一步加深肺癌與EMT關系的研究有助于肺癌的防治。我們在非小細胞肺癌細胞系H460上也看到了這樣的結果，肺癌細胞在1%的低氧環境中24 h之后，細胞形態出現了間充質樣改變，遷移和侵襲能力大大增強，說明低氧也是非小細胞肺癌發生EMT的重要誘導因素。
綜上所述，低氧微環境可以明顯誘導肺癌細胞發生EMT，使腫瘤細胞更容易發生轉移，引起不良的預后。因此，改善腫瘤低氧微環境或許可以成為治療肺癌的新方法。
