引用本文： 於海洋, 李妍, 韓鋒鋒, 羅勇, 徐衛國. 慢性阻塞性肺疾病大鼠肺組織自噬相關蛋白的變化. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(5): 470-476. doi: 10.7507/1671-6205.2016110 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是呼吸系統疾病常見病和多發病，不僅表現為肺部通氣功能障礙，還常常合并體重減輕、營養不良、骨骼肌萎縮等肺外表現，嚴重影響患者的勞動力和生活質量，給社會造成巨大的經濟負擔[1-2]。因此預防和治療慢阻肺已經成為一個不可忽視的公眾話題。以前認為慢阻肺的發病機制包括氧化應激、氣道慢性炎癥、蛋白酶抗蛋白酶失衡、細胞凋亡等[3]。我們前期研究慢阻肺與骨骼肌營養代謝時發現慢阻肺大鼠趾長伸肌組織內PI3K/AKT/mTOR信號通路被激活，可能是骨骼肌萎縮的代償機制之一[4]。進一步研究發現自噬系統作為降解途徑也參與骨骼肌萎縮，并且與泛素系統之間有一定聯系[5]。近年來越來越多的研究表明自噬在慢阻肺的發生發展中也具有重要的作用。自噬是真核生物處于缺氧、饑餓或感染時，在自噬相關基因的調控下，利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質，為細胞修復、更新提供原料與營養，保持能量穩態的過程，是有別于凋亡的另一種程序性死亡機制，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路是影響細胞自噬重要的信號通路[6-7]。那么慢阻肺大鼠肺組織自噬過程中上游蛋白PI3K、AKT、mTOR及自噬基因相關蛋白是如何表達的呢？因此，本研究建立慢阻肺大鼠肺模型，檢測自噬上游蛋白PI3K、AKT、mTOR及自噬基因相關蛋白的表達，探討在慢阻肺大鼠肺組織中自噬水平及自噬相關蛋白的變化。
材料與方法
一 材料
雄性大鼠24只，6周齡，體重150~200 g[上海西普爾-必凱試驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2003-0002，使用許可證號：SYXK(滬)2003-0031]。采用隨機數字表方法分為兩組：對照組(12只)和慢阻肺組(12只)。大前門香煙(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，煙草堿含量14 mg)，購自上海煙草公司。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain-3B，LC3B)抗體、Atg5抗體購自Abcam。p-AKT抗體、AKT抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體、Beclin-1抗體、P62抗體購自CST。GAPDH抗體、辣根過氧化物酶山羊抗兔、辣根過氧化物酶山羊抗小鼠購自碧云天。逆轉錄試劑盒[TakaRa，寶生物工程(大連)有限公司]。大鼠白細胞介素6(IL-6)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(達科為，中國)，大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(達科為，中國)。
二 方法
1．慢阻肺模型的構建：采用香煙煙熏法建立慢阻肺大鼠模型，慢阻肺組每6只SD大鼠置于熏煙箱(體積50 cm×40 cm×30 cm)，被動地接受香煙煙霧暴露。每天被動吸煙2次、每次4個循環，每個循環4支大前門香煙，每周6次，持續12周。對照組吸入正常空氣。12周后，應用小動物肺功能儀(BUXCO，美國)測定兩組大鼠肺功能情況。肺功能檢測結束后，用戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉。
2．慢阻肺模型的鑒定
(1)支氣管肺泡灌洗液(BALF)制備：暴露氣管及胸腔，在環形軟骨上方行“V”型切口，用靜脈留置針插管至隆突上，連接5 mL注射器，用3 mL預冷PBS液灌洗肺組織共3次，回收灌洗液。離心收集上清、置于-80 ℃保存。
(2)肺組織的提取：打開胸腔，心臟采血后留取大鼠左肺葉。小心地用鑷子將大鼠左側肺葉分離，用刀片從矢狀面切取約2 mm厚度的肺組織的中外側帶，迅速轉移至4%的多聚甲醛中固定48 h后行石蠟包埋切片制備，其余組織放入凍存管中，放入-80 ℃，留做后續實驗。
(3)肺組織病理切片的制備：將已固定好的肺組織，標本常規脫水、石蠟包埋、二甲苯脫蠟、經各級乙醇至水洗，然后經蘇木素-伊紅(HE)染色、常規脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。
(4)ELISA測定BALF中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達：按照ELLSA試劑盒所提供的操作指南進行操作，將不同濃度的標準品和樣品加入相應的孔中，37 ℃孵育2 h，洗板。然后依次加入辣根過氧化物酶工作液、標準色液、終止液，用自動酶標儀處在30 min內讀取光密度值(OD)。根據標準曲線計算待測樣品的IL-6、TNF-α的含量。
3.免疫組織化學LC3B染色：將肺組織切片70 ℃烤箱中烤片60 min，組織切片依次經二甲苯與梯度酒精脫蠟與水化，使用3%過氧化氫內源性過氧化物酶阻斷8 min，切片置入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液溶液中，然后放入微波爐15 min中進行抗原修復，稀釋一抗濃度為LC3B(1 :800), 添加一抗，4 ℃孵育過夜，滴加二抗并置入37 ℃恒溫箱中孵育30 min，然后再經過DAB顯色、流水沖洗玻片、蘇木素復染、鹽酸中分化、碳酸鋰中藍化、梯度酒精脫水、二甲苯透明、晾干玻片、中性樹膠封片等步驟后顯微鏡下觀察結果。
4.RT-PCR檢測肺組織中Atg5、Beclin1、Atg12、Atg7的mRNA表達：取相同質量50 mg的大鼠肺組織放入勻漿器中，加入1 mL Trziol提取RNA，測定RNA濃度。反向轉錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green進行實時熒光PCR反應，反應參數：95 ℃ 30s1個循環，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s為40個循環，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，15s1個循環，內參為GAPDH，樣本中目的基因的計算方法為2-ΔΔCt。引物序列見表 1。
表1
引物序列
5.Western blot檢測PI3K、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT和LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5、P62的表達：取相同質量30 mg的肺組織提取蛋白，放入勻漿器內，加入300 μL裂解液[RIPA裂解液中加入PMSF(100 :1)和羅氏磷酸酶抑制劑(100 :10)]，然后研磨使組織塊消失，裂解液無沉淀，冰上裂解30 min。14 000 r/min離心20 min，取上清為細胞總蛋白。BCA法蛋白定量，于6%~12%SDS-PAGE行組織蛋白電泳，轉于PVDF膜上，根據目的蛋白選擇相應的條帶，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后加入2 mL稀釋后的一抗(一抗/一抗稀釋液1 :1 000)，4 ℃過夜。第2 d一抗復溫30 min后，孵HRE標記的二抗1 h，暗室中加入顯影液曝光。PVDF膜用Bio-Rad全自動凝膠成像系統GellDocXR+成像，結果經Image LabTM軟件分析，進行灰度分析。
三 統計學處理
應用GraphPad Prism5統計軟件對實驗數據進行統計學分析，數據以x±s表示，兩樣本計量資料采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 體重變化
煙熏0周和煙熏4周時慢阻肺組和正常組大鼠的平均體重差異無統計學意義，煙熏8周時慢阻肺組大鼠體重低于對照組大鼠體重(P＜0.05)。煙熏12周時慢阻肺組大鼠體重明顯低于正常組大鼠體重(P＜0.01)。結果見圖 1。
圖1
大鼠體重的變化
與正常組比較，*
二 肺功能變化
兩組肺功能各項指標慢阻肺組較正常組下降(P＜0.01)。結果見表 1。
表1
兩組大鼠肺功能結果(x±s)
三 大鼠BALF上清中IL-6、TNF-α的表達
慢阻肺組與正常組相比，BALF上清中IL-6及TNF-α表達明顯增高，有統計學意義。其中TNF-α的P＜0.01。結果見圖 2。
圖2
大鼠BALF上清中的IL-6、TNF-α的表達
與正常組比較，*
四 肺組織形態學改變
肺組織石蠟切片HE染色，正常組大鼠肺組織結構清晰，支氣管黏膜上皮完整，未見炎性細胞浸潤，未見腺體增生。慢阻肺組大鼠可見明顯的肺組織結構破壞，肺氣腫形成，肺實質有肺泡管、肺泡腔不規則擴大，氣道周圍炎性細胞浸潤明顯，有腺體增生，部分中小血管有血管壁增厚改變。結果見圖 3。
圖3
大鼠肺組織病理像(×200) a.正常組；b.慢阻肺組
五 肺組織石蠟切片中LC3B免疫組化
LC3B蛋白表達在肺上皮細胞胞漿中，與正常組大鼠相比，可見慢阻肺組大鼠肺上皮細胞LC3B表達增加。結果見圖 4。
圖4
鼠肺組織免疫組織化學病理像(×200) a.正常組；b.慢阻肺組
六 自噬相關基因Beclin1、Atg5、Atg12、Atg7的mRNA表達變化
RT-PCR結果分析顯示慢阻肺組大鼠肺組織中自噬相關基因Beclin1、Atg5、Atg12的mRNA顯著高于正常組大鼠(其中Atg5及Beclin1兩組比較P＜0.01，Atg12兩組比較P＜0.05)。Atg7表達兩組間的差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見圖 5。
圖5
大鼠肺組織內beclin1、Atg5、Atg12、Atg7的mRNA表達
與正常組比較，*
七 PI3K、t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR蛋白及自噬相關蛋白Beclin1、Atg5、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的蛋白表達變化
Western blot分析結果顯示，PI3K蛋白、p-AKT/ t-AKT及p-mTOR/ t-mTOR蛋白表達慢阻肺組顯著低于正常組(P＜0.05)，自噬相關基因Beclin1、Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達慢阻肺組顯著高于正常組(P＜0.05，其中Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ兩組之間比較P＜0.01)，P62蛋白表達慢阻肺組顯著低于正常組(P＜0.01)。結果見圖 6~8。
圖6
大鼠肺組織內PI3K的蛋白表達
與正常組比較，*
圖7
大鼠肺組織內t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR的蛋白表達
與正常組比較，*
圖8
大鼠肺組織內LC3B、Beclin1、Atg5、P62的蛋白表達
與正常組比較，*
討論
慢阻肺是呼吸系統中的常見病和多發病，是一組氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，患病率和病死率居高不下。慢阻肺的病理改變主要表現為慢性支氣管炎及肺氣腫的病理變化。慢性支氣管炎主要表現為支氣管黏膜上皮細胞變性、壞死，潰瘍形成，纖毛倒伏、變短甚至部分脫落，支氣管腺體肥大增生，杯狀細胞增生，黏液分泌增多。肺氣腫的病理改變可見肺泡壁變薄，肺泡腔擴大，細支氣管壁有炎癥細胞浸潤[8]。慢阻肺通常表現為肺功能進行性減退，嚴重影響患者的勞動力和生存質量。慢阻肺已造成巨大的社會和經濟負擔，根據世界衛生組織發表的研究，至2020年慢阻肺將成為世界疾病經濟負擔的第三名[9]。目前，研究表明慢阻肺的發病機制包括慢性炎癥、氧化應激、蛋白酶抗蛋白酶失衡、細胞凋亡、細胞衰老等[3]。但是，現在對于慢阻肺并沒有有效的藥物治療可以阻止疾病的進展。近年來細胞自噬與疾病的關系成為研究的熱點，已有研究表明自噬是許多疾病的發病機制，包括癌癥、神經退行性病變、炎癥性腸病等[10]。Chen等[11]首次提出自噬的增加導致的細胞死亡增加可能是慢阻肺的發病機制。其研究發現與正常人相比，慢阻肺患者自噬小體形成增加。除此之外，自噬相關基因Atg4、Atg5-12復合物、Atg7表達增加，自噬水平增加。選擇性敲除小鼠中調節自噬的關鍵基因LC3B和Beclin，可以發現與野生型小鼠相比，基因敲除的小鼠煙熏后凋亡基因表達減少，小鼠肺氣腫減輕，證明在慢阻肺的發展過程中存在自噬水平的改變。同樣，我們的研究也發現，相對于正常SD大鼠，煙熏法制備的慢阻肺大鼠肺組織自噬相關基因Beclin1、Atg5、Atg12、LC3Ⅱ/Ⅰ表達量增加，自噬水平增高。以上表明在慢阻肺疾病中，自噬水平增加，提示自噬可能參與慢阻肺疾病的發生發展。
自噬是一個溶酶體依賴的降解途徑，對于細胞生存、變異、發展和穩態都有重要的意義[12]。細胞在饑餓的情況下，自噬系統被激活，自噬小體形成，降解蛋白質，為延長細胞壽命提供營養物質。自噬可被內、外源性的刺激激活，在維持細胞穩態和抵御有害刺激的過程中起重要的作用[13-14]。BCL-2作用蛋白Beclin1(在酵母中為Atg6)和LC3B(Atg8)已經作為調節哺乳動物自噬的主要調控基因。其中，微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)是重要的自噬體標志性蛋白，當自噬啟動后，胞質型LC3(即LC3Ⅰ)轉位到自噬體膜(即LC3Ⅱ)已經被認為是自噬體形成的標志物。除此之外，其他的自噬相關蛋白也被發現，如Atg5、Atg12、Atg7等在自噬的誘導和進展過程中都有自己獨特的作用，已證明Atg5-Atg12參與自噬體膜的形成[15]。我們的研究發現，相對于正常組大鼠，慢阻肺大鼠P62蛋白表達減少。P62又稱SQSTM1，是一種泛素結合蛋白，在自噬過程中具有重要的作用。P62可與LC3Ⅱ結合形成復合物，并將待降解的蛋白質轉入自噬溶酶體中，然后被降解。當自噬發生時，自噬溶酶體中的蛋白質會被降解，P62也會逐漸減少；而自噬降解的功能缺陷時，則自噬溶酶體無法降解，P62的降解水平下降，引起P62累積。P62蛋白水平與自噬活性成反比，是檢測自噬活性的一個標志蛋白[16-17]。
PI3K/AKT是一條經典的存活細胞通路，在細胞凋亡和腫瘤發生過程中發揮著重要作用[18]。PI3K可以通過其下游分子AKT磷酸化發揮作用。近年來，許多研究證明了PI3K/AKT信號通路可以通過下游分子mTOR來調節自噬。Saiki等[19]發現咖啡因可以通過抑制PI3K/AKT/p70S6K通路的表達，增加自噬水平。Heras-Sandoval等[20]證明在神經系統疾病中，PI3K/AKT/mTOR通路通過調節自噬來清除積聚的蛋白。Fan等[21]同樣發現PI3K/AKT/mTOR通路參與了Aβ25-35誘導的自噬。我們的研究也發現，相對于正常SD大鼠，煙熏法制備的慢阻肺大鼠肺組織，PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達量下降，伴隨著自噬水平的增高。mTOR是調節細胞生長和增殖的重要細胞因子，在與營養分子有關的信號轉導、蛋白質翻譯調控、細胞周期進展等過程中都占據重要地位；同時，它也是自噬啟動階段的關鍵調節因子，活化后可抑制自噬發生[22]。mTOR的功能主要通過調節mTOR復合物1(mTORC1)和mTORC2。mTORC1對自噬主要是負性調節而且是細胞生長發育、分化和生存的主要調節點。該自噬途徑啟動受營養剝奪、胰島素和其他生長因子等刺激因素的影響，這些因素可以與酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)結合而導致該受體激活，從而誘導其下游信號級聯啟動涉及磷酸化胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)，IRS1的激活則直接導致Ⅰ類PI3K的激活，繼而激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB, 即Akt)，最終激活mTOR。而mTOR的激活可直接抑制自噬的啟動，通過調控自噬相關基因(autophagic related genes, Atgs)，磷酸化Atg13，導致其不能與Atg1結合，從而阻斷自噬[23]。
在本次研究中我們通過免疫組織化學等方法檢測慢阻肺大鼠肺組織LC3B蛋白的表達，通過Western blot及RT-PCR等方法，檢測PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相關基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1、P62、Atg7、Atg12的表達。結果顯示：煙熏12周的慢阻肺大鼠肺組織中LC3B表達高于正常組，自噬上游蛋白PI3K、AKT、mTOR表達降低，自噬相關基因表達增高，自噬水平增加。但關于自噬對于肺組織到底是一種保護機制還是損傷機制，目前仍有爭議。有研究表明，在慢阻肺疾病早期患者肺上皮中可以檢測出大量的自噬蛋白及自噬標記物，而在疾病的后期才能檢測出與凋亡相關的酶，自噬表達減低[11]。這些表明在肺疾病的早期自噬是保護機制，但在疾病的后期，過度的自噬可以誘導凋亡，自噬與凋亡的關系密切相關。更有研究表明PI3K/AKT/mTOR通路參與自噬誘導的凋亡[24-25]。故更加深入的研究自噬對于慢阻肺疾病具有重要的意義，可為疾病的治療提供新靶向。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是呼吸系統疾病常見病和多發病，不僅表現為肺部通氣功能障礙，還常常合并體重減輕、營養不良、骨骼肌萎縮等肺外表現，嚴重影響患者的勞動力和生活質量，給社會造成巨大的經濟負擔[1-2]。因此預防和治療慢阻肺已經成為一個不可忽視的公眾話題。以前認為慢阻肺的發病機制包括氧化應激、氣道慢性炎癥、蛋白酶抗蛋白酶失衡、細胞凋亡等[3]。我們前期研究慢阻肺與骨骼肌營養代謝時發現慢阻肺大鼠趾長伸肌組織內PI3K/AKT/mTOR信號通路被激活，可能是骨骼肌萎縮的代償機制之一[4]。進一步研究發現自噬系統作為降解途徑也參與骨骼肌萎縮，并且與泛素系統之間有一定聯系[5]。近年來越來越多的研究表明自噬在慢阻肺的發生發展中也具有重要的作用。自噬是真核生物處于缺氧、饑餓或感染時，在自噬相關基因的調控下，利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質，為細胞修復、更新提供原料與營養，保持能量穩態的過程，是有別于凋亡的另一種程序性死亡機制，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)通路是影響細胞自噬重要的信號通路[6-7]。那么慢阻肺大鼠肺組織自噬過程中上游蛋白PI3K、AKT、mTOR及自噬基因相關蛋白是如何表達的呢？因此，本研究建立慢阻肺大鼠肺模型，檢測自噬上游蛋白PI3K、AKT、mTOR及自噬基因相關蛋白的表達，探討在慢阻肺大鼠肺組織中自噬水平及自噬相關蛋白的變化。
材料與方法
一 材料
雄性大鼠24只，6周齡，體重150~200 g[上海西普爾-必凱試驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK(滬)2003-0002，使用許可證號：SYXK(滬)2003-0031]。采用隨機數字表方法分為兩組：對照組(12只)和慢阻肺組(12只)。大前門香煙(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，煙草堿含量14 mg)，購自上海煙草公司。微管相關蛋白1輕鏈3(microtubule associated protein 1 light chain-3B，LC3B)抗體、Atg5抗體購自Abcam。p-AKT抗體、AKT抗體、p-mTOR抗體、mTOR抗體、Beclin-1抗體、P62抗體購自CST。GAPDH抗體、辣根過氧化物酶山羊抗兔、辣根過氧化物酶山羊抗小鼠購自碧云天。逆轉錄試劑盒[TakaRa，寶生物工程(大連)有限公司]。大鼠白細胞介素6(IL-6)酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(達科為，中國)，大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)ELISA試劑盒(達科為，中國)。
二 方法
1．慢阻肺模型的構建：采用香煙煙熏法建立慢阻肺大鼠模型，慢阻肺組每6只SD大鼠置于熏煙箱(體積50 cm×40 cm×30 cm)，被動地接受香煙煙霧暴露。每天被動吸煙2次、每次4個循環，每個循環4支大前門香煙，每周6次，持續12周。對照組吸入正常空氣。12周后，應用小動物肺功能儀(BUXCO，美國)測定兩組大鼠肺功能情況。肺功能檢測結束后，用戊巴比妥鈉0.1 mL/100 g腹腔注射麻醉。
2．慢阻肺模型的鑒定
(1)支氣管肺泡灌洗液(BALF)制備：暴露氣管及胸腔，在環形軟骨上方行“V”型切口，用靜脈留置針插管至隆突上，連接5 mL注射器，用3 mL預冷PBS液灌洗肺組織共3次，回收灌洗液。離心收集上清、置于-80 ℃保存。
(2)肺組織的提取：打開胸腔，心臟采血后留取大鼠左肺葉。小心地用鑷子將大鼠左側肺葉分離，用刀片從矢狀面切取約2 mm厚度的肺組織的中外側帶，迅速轉移至4%的多聚甲醛中固定48 h后行石蠟包埋切片制備，其余組織放入凍存管中，放入-80 ℃，留做后續實驗。
(3)肺組織病理切片的制備：將已固定好的肺組織，標本常規脫水、石蠟包埋、二甲苯脫蠟、經各級乙醇至水洗，然后經蘇木素-伊紅(HE)染色、常規脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察。
(4)ELISA測定BALF中炎癥因子IL-6、TNF-α的表達：按照ELLSA試劑盒所提供的操作指南進行操作，將不同濃度的標準品和樣品加入相應的孔中，37 ℃孵育2 h，洗板。然后依次加入辣根過氧化物酶工作液、標準色液、終止液，用自動酶標儀處在30 min內讀取光密度值(OD)。根據標準曲線計算待測樣品的IL-6、TNF-α的含量。
3.免疫組織化學LC3B染色：將肺組織切片70 ℃烤箱中烤片60 min，組織切片依次經二甲苯與梯度酒精脫蠟與水化，使用3%過氧化氫內源性過氧化物酶阻斷8 min，切片置入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液溶液中，然后放入微波爐15 min中進行抗原修復，稀釋一抗濃度為LC3B(1 :800), 添加一抗，4 ℃孵育過夜，滴加二抗并置入37 ℃恒溫箱中孵育30 min，然后再經過DAB顯色、流水沖洗玻片、蘇木素復染、鹽酸中分化、碳酸鋰中藍化、梯度酒精脫水、二甲苯透明、晾干玻片、中性樹膠封片等步驟后顯微鏡下觀察結果。
4.RT-PCR檢測肺組織中Atg5、Beclin1、Atg12、Atg7的mRNA表達：取相同質量50 mg的大鼠肺組織放入勻漿器中，加入1 mL Trziol提取RNA，測定RNA濃度。反向轉錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green進行實時熒光PCR反應，反應參數：95 ℃ 30s1個循環，95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s為40個循環，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，15s1個循環，內參為GAPDH，樣本中目的基因的計算方法為2-ΔΔCt。引物序列見表 1。
表1
引物序列
5.Western blot檢測PI3K、mTOR、p-mTOR、AKT、p-AKT和LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Atg5、P62的表達：取相同質量30 mg的肺組織提取蛋白，放入勻漿器內，加入300 μL裂解液[RIPA裂解液中加入PMSF(100 :1)和羅氏磷酸酶抑制劑(100 :10)]，然后研磨使組織塊消失，裂解液無沉淀，冰上裂解30 min。14 000 r/min離心20 min，取上清為細胞總蛋白。BCA法蛋白定量，于6%~12%SDS-PAGE行組織蛋白電泳，轉于PVDF膜上，根據目的蛋白選擇相應的條帶，5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后加入2 mL稀釋后的一抗(一抗/一抗稀釋液1 :1 000)，4 ℃過夜。第2 d一抗復溫30 min后，孵HRE標記的二抗1 h，暗室中加入顯影液曝光。PVDF膜用Bio-Rad全自動凝膠成像系統GellDocXR+成像，結果經Image LabTM軟件分析，進行灰度分析。
三 統計學處理
應用GraphPad Prism5統計軟件對實驗數據進行統計學分析，數據以x±s表示，兩樣本計量資料采用獨立樣本t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 體重變化
煙熏0周和煙熏4周時慢阻肺組和正常組大鼠的平均體重差異無統計學意義，煙熏8周時慢阻肺組大鼠體重低于對照組大鼠體重(P＜0.05)。煙熏12周時慢阻肺組大鼠體重明顯低于正常組大鼠體重(P＜0.01)。結果見圖 1。
圖1
大鼠體重的變化
與正常組比較，*
二 肺功能變化
兩組肺功能各項指標慢阻肺組較正常組下降(P＜0.01)。結果見表 1。
表1
兩組大鼠肺功能結果(x±s)
三 大鼠BALF上清中IL-6、TNF-α的表達
慢阻肺組與正常組相比，BALF上清中IL-6及TNF-α表達明顯增高，有統計學意義。其中TNF-α的P＜0.01。結果見圖 2。
圖2
大鼠BALF上清中的IL-6、TNF-α的表達
與正常組比較，*
四 肺組織形態學改變
肺組織石蠟切片HE染色，正常組大鼠肺組織結構清晰，支氣管黏膜上皮完整，未見炎性細胞浸潤，未見腺體增生。慢阻肺組大鼠可見明顯的肺組織結構破壞，肺氣腫形成，肺實質有肺泡管、肺泡腔不規則擴大，氣道周圍炎性細胞浸潤明顯，有腺體增生，部分中小血管有血管壁增厚改變。結果見圖 3。
圖3
大鼠肺組織病理像(×200) a.正常組；b.慢阻肺組
五 肺組織石蠟切片中LC3B免疫組化
LC3B蛋白表達在肺上皮細胞胞漿中，與正常組大鼠相比，可見慢阻肺組大鼠肺上皮細胞LC3B表達增加。結果見圖 4。
圖4
鼠肺組織免疫組織化學病理像(×200) a.正常組；b.慢阻肺組
六 自噬相關基因Beclin1、Atg5、Atg12、Atg7的mRNA表達變化
RT-PCR結果分析顯示慢阻肺組大鼠肺組織中自噬相關基因Beclin1、Atg5、Atg12的mRNA顯著高于正常組大鼠(其中Atg5及Beclin1兩組比較P＜0.01，Atg12兩組比較P＜0.05)。Atg7表達兩組間的差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見圖 5。
圖5
大鼠肺組織內beclin1、Atg5、Atg12、Atg7的mRNA表達
與正常組比較，*
七 PI3K、t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR蛋白及自噬相關蛋白Beclin1、Atg5、MAP-LC3Ⅱ/Ⅰ、P62的蛋白表達變化
Western blot分析結果顯示，PI3K蛋白、p-AKT/ t-AKT及p-mTOR/ t-mTOR蛋白表達慢阻肺組顯著低于正常組(P＜0.05)，自噬相關基因Beclin1、Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達慢阻肺組顯著高于正常組(P＜0.05，其中Atg5、LC3Ⅱ/Ⅰ兩組之間比較P＜0.01)，P62蛋白表達慢阻肺組顯著低于正常組(P＜0.01)。結果見圖 6~8。
圖6
大鼠肺組織內PI3K的蛋白表達
與正常組比較，*
圖7
大鼠肺組織內t-AKT、p-AKT、t-mTOR、p-mTOR的蛋白表達
與正常組比較，*
圖8
大鼠肺組織內LC3B、Beclin1、Atg5、P62的蛋白表達
與正常組比較，*
討論
慢阻肺是呼吸系統中的常見病和多發病，是一組氣流受限為特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，患病率和病死率居高不下。慢阻肺的病理改變主要表現為慢性支氣管炎及肺氣腫的病理變化。慢性支氣管炎主要表現為支氣管黏膜上皮細胞變性、壞死，潰瘍形成，纖毛倒伏、變短甚至部分脫落，支氣管腺體肥大增生，杯狀細胞增生，黏液分泌增多。肺氣腫的病理改變可見肺泡壁變薄，肺泡腔擴大，細支氣管壁有炎癥細胞浸潤[8]。慢阻肺通常表現為肺功能進行性減退，嚴重影響患者的勞動力和生存質量。慢阻肺已造成巨大的社會和經濟負擔，根據世界衛生組織發表的研究，至2020年慢阻肺將成為世界疾病經濟負擔的第三名[9]。目前，研究表明慢阻肺的發病機制包括慢性炎癥、氧化應激、蛋白酶抗蛋白酶失衡、細胞凋亡、細胞衰老等[3]。但是，現在對于慢阻肺并沒有有效的藥物治療可以阻止疾病的進展。近年來細胞自噬與疾病的關系成為研究的熱點，已有研究表明自噬是許多疾病的發病機制，包括癌癥、神經退行性病變、炎癥性腸病等[10]。Chen等[11]首次提出自噬的增加導致的細胞死亡增加可能是慢阻肺的發病機制。其研究發現與正常人相比，慢阻肺患者自噬小體形成增加。除此之外，自噬相關基因Atg4、Atg5-12復合物、Atg7表達增加，自噬水平增加。選擇性敲除小鼠中調節自噬的關鍵基因LC3B和Beclin，可以發現與野生型小鼠相比，基因敲除的小鼠煙熏后凋亡基因表達減少，小鼠肺氣腫減輕，證明在慢阻肺的發展過程中存在自噬水平的改變。同樣，我們的研究也發現，相對于正常SD大鼠，煙熏法制備的慢阻肺大鼠肺組織自噬相關基因Beclin1、Atg5、Atg12、LC3Ⅱ/Ⅰ表達量增加，自噬水平增高。以上表明在慢阻肺疾病中，自噬水平增加，提示自噬可能參與慢阻肺疾病的發生發展。
自噬是一個溶酶體依賴的降解途徑，對于細胞生存、變異、發展和穩態都有重要的意義[12]。細胞在饑餓的情況下，自噬系統被激活，自噬小體形成，降解蛋白質，為延長細胞壽命提供營養物質。自噬可被內、外源性的刺激激活，在維持細胞穩態和抵御有害刺激的過程中起重要的作用[13-14]。BCL-2作用蛋白Beclin1(在酵母中為Atg6)和LC3B(Atg8)已經作為調節哺乳動物自噬的主要調控基因。其中，微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)是重要的自噬體標志性蛋白，當自噬啟動后，胞質型LC3(即LC3Ⅰ)轉位到自噬體膜(即LC3Ⅱ)已經被認為是自噬體形成的標志物。除此之外，其他的自噬相關蛋白也被發現，如Atg5、Atg12、Atg7等在自噬的誘導和進展過程中都有自己獨特的作用，已證明Atg5-Atg12參與自噬體膜的形成[15]。我們的研究發現，相對于正常組大鼠，慢阻肺大鼠P62蛋白表達減少。P62又稱SQSTM1，是一種泛素結合蛋白，在自噬過程中具有重要的作用。P62可與LC3Ⅱ結合形成復合物，并將待降解的蛋白質轉入自噬溶酶體中，然后被降解。當自噬發生時，自噬溶酶體中的蛋白質會被降解，P62也會逐漸減少；而自噬降解的功能缺陷時，則自噬溶酶體無法降解，P62的降解水平下降，引起P62累積。P62蛋白水平與自噬活性成反比，是檢測自噬活性的一個標志蛋白[16-17]。
PI3K/AKT是一條經典的存活細胞通路，在細胞凋亡和腫瘤發生過程中發揮著重要作用[18]。PI3K可以通過其下游分子AKT磷酸化發揮作用。近年來，許多研究證明了PI3K/AKT信號通路可以通過下游分子mTOR來調節自噬。Saiki等[19]發現咖啡因可以通過抑制PI3K/AKT/p70S6K通路的表達，增加自噬水平。Heras-Sandoval等[20]證明在神經系統疾病中，PI3K/AKT/mTOR通路通過調節自噬來清除積聚的蛋白。Fan等[21]同樣發現PI3K/AKT/mTOR通路參與了Aβ25-35誘導的自噬。我們的研究也發現，相對于正常SD大鼠，煙熏法制備的慢阻肺大鼠肺組織，PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表達量下降，伴隨著自噬水平的增高。mTOR是調節細胞生長和增殖的重要細胞因子，在與營養分子有關的信號轉導、蛋白質翻譯調控、細胞周期進展等過程中都占據重要地位；同時，它也是自噬啟動階段的關鍵調節因子，活化后可抑制自噬發生[22]。mTOR的功能主要通過調節mTOR復合物1(mTORC1)和mTORC2。mTORC1對自噬主要是負性調節而且是細胞生長發育、分化和生存的主要調節點。該自噬途徑啟動受營養剝奪、胰島素和其他生長因子等刺激因素的影響，這些因素可以與酪氨酸激酶受體(receptor tyrosine kinase, RTK)結合而導致該受體激活，從而誘導其下游信號級聯啟動涉及磷酸化胰島素受體底物1(insulin receptor substrate 1，IRS1)，IRS1的激活則直接導致Ⅰ類PI3K的激活，繼而激活蛋白激酶B(protein kinase B，PKB, 即Akt)，最終激活mTOR。而mTOR的激活可直接抑制自噬的啟動，通過調控自噬相關基因(autophagic related genes, Atgs)，磷酸化Atg13，導致其不能與Atg1結合，從而阻斷自噬[23]。
在本次研究中我們通過免疫組織化學等方法檢測慢阻肺大鼠肺組織LC3B蛋白的表達，通過Western blot及RT-PCR等方法，檢測PI3K/AKT/mTOR通路及自噬相關基因LC3Ⅱ/Ⅰ、Atg5、Beclin1、P62、Atg7、Atg12的表達。結果顯示：煙熏12周的慢阻肺大鼠肺組織中LC3B表達高于正常組，自噬上游蛋白PI3K、AKT、mTOR表達降低，自噬相關基因表達增高，自噬水平增加。但關于自噬對于肺組織到底是一種保護機制還是損傷機制，目前仍有爭議。有研究表明，在慢阻肺疾病早期患者肺上皮中可以檢測出大量的自噬蛋白及自噬標記物，而在疾病的后期才能檢測出與凋亡相關的酶，自噬表達減低[11]。這些表明在肺疾病的早期自噬是保護機制，但在疾病的后期，過度的自噬可以誘導凋亡，自噬與凋亡的關系密切相關。更有研究表明PI3K/AKT/mTOR通路參與自噬誘導的凋亡[24-25]。故更加深入的研究自噬對于慢阻肺疾病具有重要的意義，可為疾病的治療提供新靶向。
