引用本文： 高亭, 蔣引娣, 劉小偉, 馬玉娟, 何小鵬. 羥基紅花黃色素A對Lewis肺癌移植瘤微血管密度及血管內皮生長因子mRNA表達的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(5): 461-464. doi: 10.7507/1671-6205.2016108 復制
腫瘤的生長及轉移需要豐富的營養物質，血管生成在其中發揮了重要的作用，當阻斷腫瘤的血液供應后腫瘤只能生長到2 mm大小[1]。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是從紅花中提取的一種查爾酮單體，研究顯示HSYA能夠抑制血管生成，且這種抑制作用與藥物劑量有關[2-3]。目前關于HSYA抗腫瘤的研究報道甚少[4]。謝軍平等[5]研究表明HSYA能抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長，并能降低小鼠Lewis肺癌移植瘤組織中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。本研究觀察了HSYA對C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤微血管密度(microvessel density，MVD)的影響及VEGF mRNA表達的影響，進一步探討HSYA對腫瘤血管作用的分子機制。
材料與方法
一 材料
1.細胞株與試驗動物：小鼠Lewis肺癌細胞株購自于北京協和醫科大學細胞庫。C57BL/6雌性小鼠購自于湖南斯萊克達試驗動物有限公司，體重18~20 g，周齡6~8周，共60只。
2.藥物：HSYA標準品購自于上海順勃生物工程技術有限公司，純度≥98%；注射用環磷酰胺(CTX)購自于江蘇恒瑞股份有限公司，200 g/支。
3.主要試劑：DMEM培養基、胎牛血清購自于美國Gibco公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自于TAKARA公司，VEGF引物由武漢博士德生物有限公司合成。CD34鼠源單克隆抗體(一抗、抗人、小鼠、大鼠)購自于美國Santa Cruz公司。
二 方法
1.細胞培養、藥物配置、造模：均參考謝軍平等[5]的方法。
2.動物分組與給藥：將60只接種有Lewis肺癌細胞C57/BL小鼠隨機分為5組，每組12只，分別為對照組、環磷酰胺(CTX)組及HSYA不同劑量組，每組12只。參考謝軍平等[5]的方法設定干預劑量。其中，肺癌細胞接種后第2 d開始，對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，每天2次；CTX組按25 mg/kg注射CTX，使用生理鹽水稀釋為2 g/L，隔天1次，每次0.2 mL；HSYA組分別按28 mg/L、56 mg/L、112 mg/L注射HSYA，每天接種1次。
3.腫瘤組織MVD計數：用藥第22 d處死所有小鼠，剝離腫瘤組織并脫水包埋、切片，檢測MVD。參考文獻[6]的方法，通過CD34免疫組織化學染色的強弱判斷MVD計數。具體方法為：當血管內皮細胞表現為棕褐色，并與周圍結締組織等分界清楚計為一個微血管；與周圍組織結構不相連的血管分支結構也可以作為一個微血管。使用100倍光學顯微鏡，每張組織切片選擇3個黃褐色著色最明顯的部位，然后切換至400倍視野下，隨機計數5個視野內微血管數目，取平均值進行分析。
4.實時熒光定量PCR檢測：取28 mg/L HSYA組及對照組腫瘤組織各100 mg，加入1 mL Trizol進行勻漿。根據Trizol試劑說明書提取RNA，逆轉錄成cDNA后進行定量PCR檢測。引物由武漢博士德生物有限公司合成，上游5′-CAGACCAAAGAAA GACAGAACAAAG-3′，下游5′-CTACAGGAATCCCA GAAACAACC-3′，產物為296個堿基對(bp)[6]。退火溫度為57.1 ℃，使用LightCycler2.0記錄擴增至閾值所需要的循環次數(Ct)，目標基因表達水平之間的差異通過各組內標基因所測CR值表示。反復檢測3次，取PCR產物5 mL，用溴化乙錠和1.2%瓊脂糖凝膠電泳染色，FluorChem凝膠成像系統進行DNA電泳條帶拍照，對擴增結果進行抽樣驗證。
三 統計學處理
所有試驗數據均采用x±s表示，采用SPSS 17.0軟件分析，行ANOVA單因素方差分析，LSD比較，P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 HSYA對小鼠Lewis肺癌移植瘤MVD的影響
觀察移植瘤組織切片，黃褐色著染者為CD34標記的血管內皮細胞，可見腫瘤微血管內皮細胞被染成黃褐色。對照組可見較多的被染色的血管，且表現為條索狀、空泡狀及囊狀；隨著HSYA干預劑量的減低，被染色成黃褐色的血管逐漸減少，微血管發生萎縮、退化等表現；CTX組未見明顯的微血管，血管明顯萎縮、消退(圖 1)。結果顯示：28 mg/L、56 mg/L HSYA組與CTX組腫瘤組織中MVD分別為22.56±2.11、30.01±3.12、16.21±2.40，顯著低于對照組的41.10±2.93以及112 mg/L HSYA組的37.66±3.04，差異有統計學意義，差異值分別為(χ2=3.16，P=0.007；χ2=2.82，P=0.010；χ2=4.58，P=0.000)及(χ2=2.45，P=0.016；χ2=1.98，P=0.038；χ2=3.82，P=0.001)；而112 mg/L HSYA組與對照組的MVD比較，差異無統計學意義(χ2=0.56，P=0.61)。
圖1
Lewis肺癌移植瘤組織光學顯微鏡像(免疫組織化學染色×400)
a.對照組；b.112 mg/L HSYA組；c.56 mg/L HSYA組；d.28 mg/L HSYA組；e.CTX組。對照組可見較多的被染色的血管；隨著HSYA干預劑量的減低，被染色成黃棕色的血管逐漸減少，微血管發生萎縮、退化等表現；CTX組未見明顯的微血管
二 HSYA對Lewis肺癌移植瘤VEGF mRNA表達的影響
對照組與28 mg/L HSYA組腫瘤組織中均發現VEGF mRNA的表達，其擴增的產物大小為296 bp，與理論擴增片段大小一致(圖 2)。28 mg/L HSYA組與對照組VEGF擴增熒光表達閾值所需循環Ct值比較，差異無統計學意義，但經過擴增后，28 mg/L HSYA組VEGF mRNA的表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見表 1。
圖2
腫瘤組織VEGF mRNA實時熒光定量PCR產物凝膠電泳圖
1.DNA分子量標準；2.對照組；2.28 mg/L HSYA組
表1
28 mg/L HSYA組和對照組腫瘤組織總RNA中VEGF mRNA擴增的Ct、CR值(x±s)
討論
既往對腫瘤的研究主要集中在腫瘤細胞本身，而忽略腫瘤間質部分的研究，然而所有的腫瘤都包括實質及間質組織兩部分，二者相互作用，共同促進腫瘤的增長。血管是腫瘤間質的重要組成部分之一[7]。當腫瘤新生血管成熟后可直接為腫瘤細胞提供營養物質，促進其快速增殖，從而增加轉移的風險，使得腫瘤治療更加困難[8]。研究指出，腫瘤在生長過程中，當其直徑超過1~2 mm時，此時如無新生血管生成，腫瘤將退化縮小，但當新生血管生成并長入后腫瘤的轉移和侵襲能力大大加強[9]。腫瘤新生血管的生成為腫瘤的生長、轉移及浸潤提供了重要的營養條件[10]。通過抗腫瘤治療能夠是腫瘤血管退化，阻斷腫瘤養分供應及氧氣輸送，可以達到治療腫瘤的目的，許多通過抑制腫瘤新生血管形成的藥物已在小鼠移植瘤模型中取得成功[11]。腫瘤血管生成是一個復雜的過程，VEGF是目前所知作用最強、特異性最高的促血管內皮增殖的調控因子，可增加血管通透性、促進纖維蛋白原外滲，導致腫瘤間質水腫，為腫瘤的轉移提供條件，VEGF通過與血管內皮特異性抗體結合，具有極強的促血管生成作用，其幾乎在人體所有的腫瘤及腫瘤細胞中皆有表達[12]。
Lewis肺癌移植瘤造模時間短及成功率高，是公認最具代表性的肺癌動物模型[13]，廣泛應用于抑制腫瘤血管形成的研究。MVD是反映腫瘤微血管生成的定量指標之一，與腫瘤的生長、侵襲、轉移及預后密切相關。CD34在反映微血管增生中具有較高的敏感性及特異性，因此常被應用于血管增生的評價中[6]。此外，CD34在大多數腫瘤實質細胞中幾乎不被表達，而僅在腫瘤血管內皮細胞中表達，因此使用CD34抗體可以有選擇性且清楚地識別血管內皮細胞[6, 14]。
紅花具有通血活絡、散瘀止痛的功效，HSYA作為紅花發揮藥理作用的中藥成分之一，研究顯示其具有抗氧化、增加機體免疫、抗感染、抗腫瘤等多種藥理功效[15-17]，對心腦血管系統疾病具有良好的治療效果[18]。張前等[2]通過研究發現HSYA能夠有效抑制毛細血管生成，并與濃度具有相關性。Xi等[15]通過研究證實其對裸鼠人胃腺癌BGC-823移植瘤的血管生成有一定的抑制作用。謝軍平等[5]研究表明，HSYA隨濃度的不同對肺癌移植瘤中VEGF的表達具有不同的抑制作用，其中112 mg/L HSYA對Lewis肺癌移植瘤中VEGF表達的抑制作用較低，因此我們在此基礎上主要對抑瘤效果較好的28 mg/L的HSYA進行研究。
研究結果顯示CTX組腫瘤組織的MVD最低，表明CTX對血管生成的抑制作用最明顯。這可能與CTX既可以殺傷腫瘤細胞，同時又可以抑制腫瘤血管生成的雙重作用機制有關[19]。研究結果還顯示，與對照組對比，28 mg/L HSYA對腫瘤MVD抑制效果最為顯著，其差異有統計學意義，而112 mg/L HSYA組與對照組比較MVD略有降低，但其差異無統計學意義。這可能與112 mg/L的HSYA具有促進血管內皮細胞生長的作用[20]，進而加速腫瘤血管生成有關，而28 mg/L HSYA則表現為抑制血管內皮生長的作用，并隨劑量的降低而逐漸增強[3]。實時熒光定量PCR檢測結果也顯示，28 mg/L HSYA組與對照組腫瘤組織VEGF擴增熒光表達閾值所需循環Ct值比較，差異沒有統計學意義，但其VEGF mRNA的表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義。這表明28 mg/L的HSYA能夠減少腫瘤組織分泌血管生長因子，減少腫瘤組織血管生成，這與Xi等[15]的研究相一致。
本研究存在一些不足。首先，在導致腫瘤微血管生成過程中，除了VEGF外還存在其他的血管生成刺激因子，如成纖維細胞生長因子等，HSYA是否同樣可以抑制這些因子的表達仍需研究。其次，HYSA干預劑量設置較少。從目前的研究結果看，HYSA可能是一把“雙刃劍”，112 mg/L的HSYA對移植瘤的MVD無明顯影響，但28 mg/L的HSYA對移植瘤的MVD有顯著的抑制作用，而最佳的抑制劑量也有待進一步分析。
腫瘤的生長及轉移需要豐富的營養物質，血管生成在其中發揮了重要的作用，當阻斷腫瘤的血液供應后腫瘤只能生長到2 mm大小[1]。羥基紅花黃色素A(hydroxysafflor yellow A，HSYA)是從紅花中提取的一種查爾酮單體，研究顯示HSYA能夠抑制血管生成，且這種抑制作用與藥物劑量有關[2-3]。目前關于HSYA抗腫瘤的研究報道甚少[4]。謝軍平等[5]研究表明HSYA能抑制Lewis肺癌小鼠腫瘤生長，并能降低小鼠Lewis肺癌移植瘤組織中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達。本研究觀察了HSYA對C57BL/6小鼠Lewis肺癌移植瘤微血管密度(microvessel density，MVD)的影響及VEGF mRNA表達的影響，進一步探討HSYA對腫瘤血管作用的分子機制。
材料與方法
一 材料
1.細胞株與試驗動物：小鼠Lewis肺癌細胞株購自于北京協和醫科大學細胞庫。C57BL/6雌性小鼠購自于湖南斯萊克達試驗動物有限公司，體重18~20 g，周齡6~8周，共60只。
2.藥物：HSYA標準品購自于上海順勃生物工程技術有限公司，純度≥98%；注射用環磷酰胺(CTX)購自于江蘇恒瑞股份有限公司，200 g/支。
3.主要試劑：DMEM培養基、胎牛血清購自于美國Gibco公司，實時熒光定量PCR試劑盒購自于TAKARA公司，VEGF引物由武漢博士德生物有限公司合成。CD34鼠源單克隆抗體(一抗、抗人、小鼠、大鼠)購自于美國Santa Cruz公司。
二 方法
1.細胞培養、藥物配置、造模：均參考謝軍平等[5]的方法。
2.動物分組與給藥：將60只接種有Lewis肺癌細胞C57/BL小鼠隨機分為5組，每組12只，分別為對照組、環磷酰胺(CTX)組及HSYA不同劑量組，每組12只。參考謝軍平等[5]的方法設定干預劑量。其中，肺癌細胞接種后第2 d開始，對照組小鼠腹腔注射生理鹽水，每天2次；CTX組按25 mg/kg注射CTX，使用生理鹽水稀釋為2 g/L，隔天1次，每次0.2 mL；HSYA組分別按28 mg/L、56 mg/L、112 mg/L注射HSYA，每天接種1次。
3.腫瘤組織MVD計數：用藥第22 d處死所有小鼠，剝離腫瘤組織并脫水包埋、切片，檢測MVD。參考文獻[6]的方法，通過CD34免疫組織化學染色的強弱判斷MVD計數。具體方法為：當血管內皮細胞表現為棕褐色，并與周圍結締組織等分界清楚計為一個微血管；與周圍組織結構不相連的血管分支結構也可以作為一個微血管。使用100倍光學顯微鏡，每張組織切片選擇3個黃褐色著色最明顯的部位，然后切換至400倍視野下，隨機計數5個視野內微血管數目，取平均值進行分析。
4.實時熒光定量PCR檢測：取28 mg/L HSYA組及對照組腫瘤組織各100 mg，加入1 mL Trizol進行勻漿。根據Trizol試劑說明書提取RNA，逆轉錄成cDNA后進行定量PCR檢測。引物由武漢博士德生物有限公司合成，上游5′-CAGACCAAAGAAA GACAGAACAAAG-3′，下游5′-CTACAGGAATCCCA GAAACAACC-3′，產物為296個堿基對(bp)[6]。退火溫度為57.1 ℃，使用LightCycler2.0記錄擴增至閾值所需要的循環次數(Ct)，目標基因表達水平之間的差異通過各組內標基因所測CR值表示。反復檢測3次，取PCR產物5 mL，用溴化乙錠和1.2%瓊脂糖凝膠電泳染色，FluorChem凝膠成像系統進行DNA電泳條帶拍照，對擴增結果進行抽樣驗證。
三 統計學處理
所有試驗數據均采用x±s表示，采用SPSS 17.0軟件分析，行ANOVA單因素方差分析，LSD比較，P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 HSYA對小鼠Lewis肺癌移植瘤MVD的影響
觀察移植瘤組織切片，黃褐色著染者為CD34標記的血管內皮細胞，可見腫瘤微血管內皮細胞被染成黃褐色。對照組可見較多的被染色的血管，且表現為條索狀、空泡狀及囊狀；隨著HSYA干預劑量的減低，被染色成黃褐色的血管逐漸減少，微血管發生萎縮、退化等表現；CTX組未見明顯的微血管，血管明顯萎縮、消退(圖 1)。結果顯示：28 mg/L、56 mg/L HSYA組與CTX組腫瘤組織中MVD分別為22.56±2.11、30.01±3.12、16.21±2.40，顯著低于對照組的41.10±2.93以及112 mg/L HSYA組的37.66±3.04，差異有統計學意義，差異值分別為(χ2=3.16，P=0.007；χ2=2.82，P=0.010；χ2=4.58，P=0.000)及(χ2=2.45，P=0.016；χ2=1.98，P=0.038；χ2=3.82，P=0.001)；而112 mg/L HSYA組與對照組的MVD比較，差異無統計學意義(χ2=0.56，P=0.61)。
圖1
Lewis肺癌移植瘤組織光學顯微鏡像(免疫組織化學染色×400)
a.對照組；b.112 mg/L HSYA組；c.56 mg/L HSYA組；d.28 mg/L HSYA組；e.CTX組。對照組可見較多的被染色的血管；隨著HSYA干預劑量的減低，被染色成黃棕色的血管逐漸減少，微血管發生萎縮、退化等表現；CTX組未見明顯的微血管
二 HSYA對Lewis肺癌移植瘤VEGF mRNA表達的影響
對照組與28 mg/L HSYA組腫瘤組織中均發現VEGF mRNA的表達，其擴增的產物大小為296 bp，與理論擴增片段大小一致(圖 2)。28 mg/L HSYA組與對照組VEGF擴增熒光表達閾值所需循環Ct值比較，差異無統計學意義，但經過擴增后，28 mg/L HSYA組VEGF mRNA的表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見表 1。
圖2
腫瘤組織VEGF mRNA實時熒光定量PCR產物凝膠電泳圖
1.DNA分子量標準；2.對照組；2.28 mg/L HSYA組
表1
28 mg/L HSYA組和對照組腫瘤組織總RNA中VEGF mRNA擴增的Ct、CR值(x±s)
討論
既往對腫瘤的研究主要集中在腫瘤細胞本身，而忽略腫瘤間質部分的研究，然而所有的腫瘤都包括實質及間質組織兩部分，二者相互作用，共同促進腫瘤的增長。血管是腫瘤間質的重要組成部分之一[7]。當腫瘤新生血管成熟后可直接為腫瘤細胞提供營養物質，促進其快速增殖，從而增加轉移的風險，使得腫瘤治療更加困難[8]。研究指出，腫瘤在生長過程中，當其直徑超過1~2 mm時，此時如無新生血管生成，腫瘤將退化縮小，但當新生血管生成并長入后腫瘤的轉移和侵襲能力大大加強[9]。腫瘤新生血管的生成為腫瘤的生長、轉移及浸潤提供了重要的營養條件[10]。通過抗腫瘤治療能夠是腫瘤血管退化，阻斷腫瘤養分供應及氧氣輸送，可以達到治療腫瘤的目的，許多通過抑制腫瘤新生血管形成的藥物已在小鼠移植瘤模型中取得成功[11]。腫瘤血管生成是一個復雜的過程，VEGF是目前所知作用最強、特異性最高的促血管內皮增殖的調控因子，可增加血管通透性、促進纖維蛋白原外滲，導致腫瘤間質水腫，為腫瘤的轉移提供條件，VEGF通過與血管內皮特異性抗體結合，具有極強的促血管生成作用，其幾乎在人體所有的腫瘤及腫瘤細胞中皆有表達[12]。
Lewis肺癌移植瘤造模時間短及成功率高，是公認最具代表性的肺癌動物模型[13]，廣泛應用于抑制腫瘤血管形成的研究。MVD是反映腫瘤微血管生成的定量指標之一，與腫瘤的生長、侵襲、轉移及預后密切相關。CD34在反映微血管增生中具有較高的敏感性及特異性，因此常被應用于血管增生的評價中[6]。此外，CD34在大多數腫瘤實質細胞中幾乎不被表達，而僅在腫瘤血管內皮細胞中表達，因此使用CD34抗體可以有選擇性且清楚地識別血管內皮細胞[6, 14]。
紅花具有通血活絡、散瘀止痛的功效，HSYA作為紅花發揮藥理作用的中藥成分之一，研究顯示其具有抗氧化、增加機體免疫、抗感染、抗腫瘤等多種藥理功效[15-17]，對心腦血管系統疾病具有良好的治療效果[18]。張前等[2]通過研究發現HSYA能夠有效抑制毛細血管生成，并與濃度具有相關性。Xi等[15]通過研究證實其對裸鼠人胃腺癌BGC-823移植瘤的血管生成有一定的抑制作用。謝軍平等[5]研究表明，HSYA隨濃度的不同對肺癌移植瘤中VEGF的表達具有不同的抑制作用，其中112 mg/L HSYA對Lewis肺癌移植瘤中VEGF表達的抑制作用較低，因此我們在此基礎上主要對抑瘤效果較好的28 mg/L的HSYA進行研究。
研究結果顯示CTX組腫瘤組織的MVD最低，表明CTX對血管生成的抑制作用最明顯。這可能與CTX既可以殺傷腫瘤細胞，同時又可以抑制腫瘤血管生成的雙重作用機制有關[19]。研究結果還顯示，與對照組對比，28 mg/L HSYA對腫瘤MVD抑制效果最為顯著，其差異有統計學意義，而112 mg/L HSYA組與對照組比較MVD略有降低，但其差異無統計學意義。這可能與112 mg/L的HSYA具有促進血管內皮細胞生長的作用[20]，進而加速腫瘤血管生成有關，而28 mg/L HSYA則表現為抑制血管內皮生長的作用，并隨劑量的降低而逐漸增強[3]。實時熒光定量PCR檢測結果也顯示，28 mg/L HSYA組與對照組腫瘤組織VEGF擴增熒光表達閾值所需循環Ct值比較，差異沒有統計學意義，但其VEGF mRNA的表達水平明顯低于對照組，差異有統計學意義。這表明28 mg/L的HSYA能夠減少腫瘤組織分泌血管生長因子，減少腫瘤組織血管生成，這與Xi等[15]的研究相一致。
本研究存在一些不足。首先，在導致腫瘤微血管生成過程中，除了VEGF外還存在其他的血管生成刺激因子，如成纖維細胞生長因子等，HSYA是否同樣可以抑制這些因子的表達仍需研究。其次，HYSA干預劑量設置較少。從目前的研究結果看，HYSA可能是一把“雙刃劍”，112 mg/L的HSYA對移植瘤的MVD無明顯影響，但28 mg/L的HSYA對移植瘤的MVD有顯著的抑制作用，而最佳的抑制劑量也有待進一步分析。
