引用本文： 高航, 殷俊, 包勇. 非小細胞肺癌患者中外周血漿K-ras基因突變的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(5): 458-460. doi: 10.7507/1671-6205.2016107 復制
肺癌的發病率及病死率在我國居于各惡性腫瘤之首，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占75%~80%[1]。目前針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的靶向治療在NSCLC患者中的治療取得了較好的療效。有研究表明，EGFR突變是引起NSCLC對酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)敏感的主要機制[2-3]。但在臨床治療中發現，有部分患者對EGFR-TKI產生耐藥，進一步研究發現，K-ras突變是患者對EGFR-TKI產生耐藥的機制之一，因此需要根據K-ras基因突變檢測結果調整NSCLC患者的治療方案[4-7]。目前檢測K-ras基因突變的標本主要來自肺癌組織，但通過獲取每位患者的肺癌組織進行K-ras突變的治療前檢查比較困難，且難以重復動態監測，而外周血漿中游離DNA大多為腫瘤細胞的壞死、凋亡或腫瘤細胞主動釋放，故在理論上能夠實現對腫瘤基因狀態的實時動態監測。多項研究顯示K-ras基因突變因區域、種族不同而不同[8-10]。本研究通過對242例四川地區NSCLC患者的外周血漿中的游離DNA及肺癌組織應用突變富集液相芯片技術檢測K-ras基因突變進行對比，探討檢測外周血漿中的K-ras基因突變在四川地區NSCLC患者中的可行性及準確性。
對象與方法
一 對象
選取我院2013年1月至2015年8月病理確診的四川地區NSCLC患者242例，且242例患者均為四川地區原住人口。其中男163例，年齡55~78歲，平均年齡(61.2±13.3)歲；女79例，年齡50~80歲，平均年齡(66.7±15.3)歲；包括腺癌150例，鱗癌71例，其他類型肺癌21例。
二 方法
1．提取DNA：收集NSCLC患者治療前靜脈血4 mL，于4 ℃靜置2 h后離心，2 500 r/min 10 min，留取血漿至新離心管中，再次離心10 min，留取血漿約1 mL加入蛋白酶K(20 g/L)15 μL、10％十二烷基磺酸鈉50 μL，水浴(60 ℃)2 h后進行酚-氯仿-異戊醇抽提，酒精沉淀過夜，次日離心，洗鹽，將沉淀溶于適量三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽及乙二胺四乙酸的混合物中，-20 ℃保存備用。
取NSCLC組織樣本30 mg，加入裂解液、蛋白酶K，水浴(水溫保持在60 ℃)，3~6 h，再行酚-氯仿-異戊醇提取DNA，于-20 ℃保存待檢。
2．PCR擴增DNA：引物設計：參考K-ras基因的核酸序列(NM-033360.2)。K-ras上游引物：5′-AGGCCTGCTGTGACTGA-3′；K-ras下游引物：5′-CCTCTATIGITGGATCATATrCGT-3′。將提取的DNA置于PCR反應體系中擴增，PCR反應條件：95 ℃ 15 min、94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。
3．微球雜交反應：微球雜交體系由22 μL雜交預混液和3 μL LDR反應產物組成，雜交體系配制完成后置于PCR擴增儀上45 ℃ 10 min后，加入75 μL SA-PE，繼續保持45℃孵育15 min。Luminex 100儀器讀數。
三 統計學處理
應用SPSS 17.0軟件進行數據分析，K-ras基因突變在外周血漿與肺癌組織中的檢出率用χ2檢驗進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義；外周血漿游離DNA中的K-ras基因突變檢出率與肺癌組織中的檢出率的相關性使用Kappa檢驗進行分析，其評價標準為：Kappa值≥0.75時表示兩結果一致性較好，0.40＜Kappa值＜0.75時表示一致性中等，0＜Kappa值≤0.40時一致性較差，Kappa值＜0時一致程度比機遇造成的還差。
結果
在本組242例NSCLC病例中，肺癌組織中檢測出K-ras基因突變者共有12例患者，檢出率為4.96%，外周血漿中檢出10例K-ras基因突變，檢出率為4.13%。結果見表 1。外周血漿游離DNA中的K-ras基因突變檢出率與肺癌組織中的檢出率具有較好的一致性(Kappa值=0.81)。結果見表 2。
表1
K-ras基因突變在不同組織學類型中的檢出率[例(%)]
表2
K-ras基因突變在肺癌組織與外周血漿中的檢出例數的比較
討論
K-ras基因突變是引起NSCLC患者對EGFR-TKI產生耐藥的機制之一，有研究發現發生K-ras基因突變的NSCLC患者全部對EGFR-TKI產生耐藥，其作用機制尚未完全明確[4-7]。楊帆等[4]對EGFR下游通路研究發現，突變的K-ras替代EGFR激活了下游通路，包括AKT、STAT和Ras/MSPK三條途徑，進一步研究發現K-ras變異引起的EGFR-TKI耐藥除AKT及STAT通路持續激活外，可能存在其他通路影響。在《2009年NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》明確指出：當K-ras基因發生突變，則不建議患者單獨使用厄洛替尼(Tarceva/特羅凱/Erlotinib)進行分子靶向治療。因此，患者治療前能夠明確K-ras基因是否發生突變顯得十分重要。
研究發現K-ras基因突變在非亞洲人群中較高，在腺癌患者達到了30%~50%；亞洲國家NSCLC患者K-ras基因的突變率為4%~24%[11-13]。在國內的研究中，羅煒等[11]報道的廣東地區肺癌組織中K-ras基因突變率為3.7%；張卉等[12-13]報道的北京地區肺腺癌和肺鱗癌組織中K-ras基因突變率分別為7.8%和5%；衣素琴等[14]報道的江蘇地區肺癌組織中K-ras基因突變率為5.03%，在肺腺癌和肺鱗癌患者中的突變率分別為5.30%和4.17%；許春偉等[15]報道的肺癌組織K-ras基因突變率則高達11.28%。其中突出率差異的原因可能是K-ras基因突變也與EGFR基因突變一樣，在不同種族或同一種族不同地區中存在差異，因此對多地區樣本進行檢測分析對臨床工作有指導意義[15]。
本研究納入242例患者主要為四川川中(成都、德陽、綿陽、遂寧、眉山、資陽)漢族患者，也有部分川西涼山彝族自治州與甘孜阿壩藏族自治州的少數民族患者。通過對同一患者的肺癌組織和外周血標本同時進行K-ras基因突變檢測，發現肺癌組織中K-ras基因突變檢出率為4.96%，外周血漿檢出率為4.13%；在不同組織類型中，腺癌K-ras基因突變檢出率在肺癌組織和外周血漿分別為5.33%和4.67%；鱗癌K-ras基因突變檢出率在肺癌組織和外周血漿分別為2.82%和1.41%；肉瘤樣癌的K-ras基因突變檢出率較高，在肺癌組織中檢出率20.00%，在外周血漿檢出率10.00%，且通過對比肺癌組織與外周血漿中的K-ras基因突變發現，兩者具有較好的相關性(Kappa值=0.81)，并且兩者的檢出率并差異無統計學意義，說明可以通過外周血漿游離DNA對四川地區NSCLC患者有無K-ras突變進行檢測，以指導其治療方式的選擇。本研究中腺鱗癌患者外周血漿中檢出1例K-ras基因突變，而在肺癌組織中未檢出，可能與肺癌組織取材有關，由于病灶為非均質性，病灶活檢標本可能不攜帶K-ras突變基因，而循環血DNA可以來自肺癌原發灶，也可以來自轉移灶；同時在本組研究中，有3例在肺癌組織中檢出K-ras基因突變，但在外周血漿中未檢出，可能是因為肺癌攜帶突變基因部分釋放進入血的DNA少于肺癌組織或肺癌組織，如炎性組織釋放進入外周血導致DNA稀釋導致外周血漿中K-ras突變基因含量過低，擴增次數不足。
本研究采用新型的突變富集液相芯片技術進行肺癌組織及外周血標本的K-ras突變基因檢測，相較于實時熒光定量PCR，無需提取樣品mRNA, 避免了因mRNA不穩定導致檢測結果準確度下降。突變富集液相芯片法靈敏度高，最低可檢測出占野生型拷貝數0.1%的突變序列，血漿及各類的組織標本，包括手術切除的巨大腫瘤組織標本和臨床常見的微小組織標本如支氣管鏡活檢、胸膜活檢、肺穿刺、胸水包埋等都可以滿足檢測K-ras基因突變的檢測要求[16]。
綜上所述，檢測四川地區NSCLC患者K-ras基因突變發生率與其他地區報道雖不盡相同，但也證實了我國不同地區肺癌患者K-ras突變分布確實存在差異。采用外周血進行K-ras基因檢測，標本容易獲取，可多次重復檢測。本研究表明，四川地區NSCLC患者外周血漿與肺癌組織中K-ras基因突變的檢出率具有較好一致性，可以替代肺癌組織進行檢測篩查，有利于實現個性化治療，避免不必要的靶向治療帶來的負擔。
肺癌的發病率及病死率在我國居于各惡性腫瘤之首，其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)約占75%~80%[1]。目前針對表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的靶向治療在NSCLC患者中的治療取得了較好的療效。有研究表明，EGFR突變是引起NSCLC對酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)敏感的主要機制[2-3]。但在臨床治療中發現，有部分患者對EGFR-TKI產生耐藥，進一步研究發現，K-ras突變是患者對EGFR-TKI產生耐藥的機制之一，因此需要根據K-ras基因突變檢測結果調整NSCLC患者的治療方案[4-7]。目前檢測K-ras基因突變的標本主要來自肺癌組織，但通過獲取每位患者的肺癌組織進行K-ras突變的治療前檢查比較困難，且難以重復動態監測，而外周血漿中游離DNA大多為腫瘤細胞的壞死、凋亡或腫瘤細胞主動釋放，故在理論上能夠實現對腫瘤基因狀態的實時動態監測。多項研究顯示K-ras基因突變因區域、種族不同而不同[8-10]。本研究通過對242例四川地區NSCLC患者的外周血漿中的游離DNA及肺癌組織應用突變富集液相芯片技術檢測K-ras基因突變進行對比，探討檢測外周血漿中的K-ras基因突變在四川地區NSCLC患者中的可行性及準確性。
對象與方法
一 對象
選取我院2013年1月至2015年8月病理確診的四川地區NSCLC患者242例，且242例患者均為四川地區原住人口。其中男163例，年齡55~78歲，平均年齡(61.2±13.3)歲；女79例，年齡50~80歲，平均年齡(66.7±15.3)歲；包括腺癌150例，鱗癌71例，其他類型肺癌21例。
二 方法
1．提取DNA：收集NSCLC患者治療前靜脈血4 mL，于4 ℃靜置2 h后離心，2 500 r/min 10 min，留取血漿至新離心管中，再次離心10 min，留取血漿約1 mL加入蛋白酶K(20 g/L)15 μL、10％十二烷基磺酸鈉50 μL，水浴(60 ℃)2 h后進行酚-氯仿-異戊醇抽提，酒精沉淀過夜，次日離心，洗鹽，將沉淀溶于適量三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽及乙二胺四乙酸的混合物中，-20 ℃保存備用。
取NSCLC組織樣本30 mg，加入裂解液、蛋白酶K，水浴(水溫保持在60 ℃)，3~6 h，再行酚-氯仿-異戊醇提取DNA，于-20 ℃保存待檢。
2．PCR擴增DNA：引物設計：參考K-ras基因的核酸序列(NM-033360.2)。K-ras上游引物：5′-AGGCCTGCTGTGACTGA-3′；K-ras下游引物：5′-CCTCTATIGITGGATCATATrCGT-3′。將提取的DNA置于PCR反應體系中擴增，PCR反應條件：95 ℃ 15 min、94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，35個循環，72 ℃ 10 min，4 ℃保存。
3．微球雜交反應：微球雜交體系由22 μL雜交預混液和3 μL LDR反應產物組成，雜交體系配制完成后置于PCR擴增儀上45 ℃ 10 min后，加入75 μL SA-PE，繼續保持45℃孵育15 min。Luminex 100儀器讀數。
三 統計學處理
應用SPSS 17.0軟件進行數據分析，K-ras基因突變在外周血漿與肺癌組織中的檢出率用χ2檢驗進行分析，以P＜0.05為差異有統計學意義；外周血漿游離DNA中的K-ras基因突變檢出率與肺癌組織中的檢出率的相關性使用Kappa檢驗進行分析，其評價標準為：Kappa值≥0.75時表示兩結果一致性較好，0.40＜Kappa值＜0.75時表示一致性中等，0＜Kappa值≤0.40時一致性較差，Kappa值＜0時一致程度比機遇造成的還差。
結果
在本組242例NSCLC病例中，肺癌組織中檢測出K-ras基因突變者共有12例患者，檢出率為4.96%，外周血漿中檢出10例K-ras基因突變，檢出率為4.13%。結果見表 1。外周血漿游離DNA中的K-ras基因突變檢出率與肺癌組織中的檢出率具有較好的一致性(Kappa值=0.81)。結果見表 2。
表1
K-ras基因突變在不同組織學類型中的檢出率[例(%)]
表2
K-ras基因突變在肺癌組織與外周血漿中的檢出例數的比較
討論
K-ras基因突變是引起NSCLC患者對EGFR-TKI產生耐藥的機制之一，有研究發現發生K-ras基因突變的NSCLC患者全部對EGFR-TKI產生耐藥，其作用機制尚未完全明確[4-7]。楊帆等[4]對EGFR下游通路研究發現，突變的K-ras替代EGFR激活了下游通路，包括AKT、STAT和Ras/MSPK三條途徑，進一步研究發現K-ras變異引起的EGFR-TKI耐藥除AKT及STAT通路持續激活外，可能存在其他通路影響。在《2009年NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》明確指出：當K-ras基因發生突變，則不建議患者單獨使用厄洛替尼(Tarceva/特羅凱/Erlotinib)進行分子靶向治療。因此，患者治療前能夠明確K-ras基因是否發生突變顯得十分重要。
研究發現K-ras基因突變在非亞洲人群中較高，在腺癌患者達到了30%~50%；亞洲國家NSCLC患者K-ras基因的突變率為4%~24%[11-13]。在國內的研究中，羅煒等[11]報道的廣東地區肺癌組織中K-ras基因突變率為3.7%；張卉等[12-13]報道的北京地區肺腺癌和肺鱗癌組織中K-ras基因突變率分別為7.8%和5%；衣素琴等[14]報道的江蘇地區肺癌組織中K-ras基因突變率為5.03%，在肺腺癌和肺鱗癌患者中的突變率分別為5.30%和4.17%；許春偉等[15]報道的肺癌組織K-ras基因突變率則高達11.28%。其中突出率差異的原因可能是K-ras基因突變也與EGFR基因突變一樣，在不同種族或同一種族不同地區中存在差異，因此對多地區樣本進行檢測分析對臨床工作有指導意義[15]。
本研究納入242例患者主要為四川川中(成都、德陽、綿陽、遂寧、眉山、資陽)漢族患者，也有部分川西涼山彝族自治州與甘孜阿壩藏族自治州的少數民族患者。通過對同一患者的肺癌組織和外周血標本同時進行K-ras基因突變檢測，發現肺癌組織中K-ras基因突變檢出率為4.96%，外周血漿檢出率為4.13%；在不同組織類型中，腺癌K-ras基因突變檢出率在肺癌組織和外周血漿分別為5.33%和4.67%；鱗癌K-ras基因突變檢出率在肺癌組織和外周血漿分別為2.82%和1.41%；肉瘤樣癌的K-ras基因突變檢出率較高，在肺癌組織中檢出率20.00%，在外周血漿檢出率10.00%，且通過對比肺癌組織與外周血漿中的K-ras基因突變發現，兩者具有較好的相關性(Kappa值=0.81)，并且兩者的檢出率并差異無統計學意義，說明可以通過外周血漿游離DNA對四川地區NSCLC患者有無K-ras突變進行檢測，以指導其治療方式的選擇。本研究中腺鱗癌患者外周血漿中檢出1例K-ras基因突變，而在肺癌組織中未檢出，可能與肺癌組織取材有關，由于病灶為非均質性，病灶活檢標本可能不攜帶K-ras突變基因，而循環血DNA可以來自肺癌原發灶，也可以來自轉移灶；同時在本組研究中，有3例在肺癌組織中檢出K-ras基因突變，但在外周血漿中未檢出，可能是因為肺癌攜帶突變基因部分釋放進入血的DNA少于肺癌組織或肺癌組織，如炎性組織釋放進入外周血導致DNA稀釋導致外周血漿中K-ras突變基因含量過低，擴增次數不足。
本研究采用新型的突變富集液相芯片技術進行肺癌組織及外周血標本的K-ras突變基因檢測，相較于實時熒光定量PCR，無需提取樣品mRNA, 避免了因mRNA不穩定導致檢測結果準確度下降。突變富集液相芯片法靈敏度高，最低可檢測出占野生型拷貝數0.1%的突變序列，血漿及各類的組織標本，包括手術切除的巨大腫瘤組織標本和臨床常見的微小組織標本如支氣管鏡活檢、胸膜活檢、肺穿刺、胸水包埋等都可以滿足檢測K-ras基因突變的檢測要求[16]。
綜上所述，檢測四川地區NSCLC患者K-ras基因突變發生率與其他地區報道雖不盡相同，但也證實了我國不同地區肺癌患者K-ras突變分布確實存在差異。采用外周血進行K-ras基因檢測，標本容易獲取，可多次重復檢測。本研究表明，四川地區NSCLC患者外周血漿與肺癌組織中K-ras基因突變的檢出率具有較好一致性，可以替代肺癌組織進行檢測篩查，有利于實現個性化治療，避免不必要的靶向治療帶來的負擔。
