引用本文： 李靜, 劉曉琴, 楊業, 柳斌. LncRNA KCNQ1OT1在非小細胞肺癌組織中的表達及其臨床意義. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(5): 453-457. doi: 10.7507/1671-6205.2016106 復制
肺癌在全球范圍內新發病例數已超過120萬/年，成為導致腫瘤相關死亡的重要原因。隨著分子生物學的發展，人們逐漸認識到肺癌的發生、發展和轉移是多基因、多階段、多因素共同參與的復雜過程，涉及多種分子機制[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200個堿基的非編碼RNA。已證實LncRNA在癌癥的發生發展中發揮重要作用，與多種癌癥的生物學過程有關，比如癌癥的發生發展、浸潤和轉移過程[3-5]。雖然基因組分析發現了大量的LncRNA，但目前只對少部分LncRNA進行了研究，其中研究較多的是HOTAIR和MALAT-1。這些LncRNA具有作為腫瘤診斷、預后分子標志物的潛力，其表達水平與多種腫瘤的臨床病理特征及預后相關[6-9]。前期通過基因芯片發現LncRNA KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1 overlapping transcript 1, KCNQ1OT1)在非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株中高表達，近年來的研究發現LncRNA KCNQ1重疊轉錄物1 (KCNQ1OT1)參與調節多種腫瘤的發生發展[10]，然而關于LncRNA KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1 overlapping transcritp 1, KCNQ1OT1)在NSCLC中的作用國內外尚未見相關報道。本研究通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，QRT-PCR)方法檢測LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者肺癌組織及其對應的正常肺組織標本中的表達情況，并對患者的臨床病理特征進行分析，揭示LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC中的可能作用，為尋找NSCLC患者臨床預后的靶基因提供依據。
對象與方法
一 對象
收集2011年1月至2013年12月期間在四川省腫瘤醫院行根治性或姑息性切除術的89例NSCLC癌組織及癌旁組織(癌旁組織距離癌組織達5 cm以上)，同時收集患者個人信息和詳細臨床資料。所有組織均經病理學確診為NSCLC，手術切除的新鮮標本立即放入液氮中凍存，所有患者術前均未行放化療。患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結是否轉移及病理類型等方面的臨床資料均收集完整。其中男49例，女40例；平均年齡(50.0±9.2)歲，年齡＜50歲42例，年齡≥50歲47例；臨床分期Ⅰ期23例，Ⅱ期30例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例；鱗癌及其他類型20例，腺癌69例。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。
二 方法
1．隨訪：全部89例患者出院后均隨訪，以電話和復查的方式進行。隨訪內容包括一般情況、臨床癥狀及影像學檢查。隨訪起點為確診日期，末次隨訪時間為2016年6月25日，至隨訪截止日，存活35例，死亡54例，無失訪病例。隨訪時間18~66個月。
2．QRT-PCR分析LncRNA KCNQ1OT1的表達：收集NSCLC組織及癌旁組織50~100 mg，在液氮中磨成粉末后，加入1 mL Trizol液研磨(樣品總體積不超過所用Trizol體積的10%)，分別移入去RNA酶的EP管中，提取總RNA。取上述準備的RNA，逆轉錄反應參照AMV逆轉錄試劑盒說明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進行cDNA的合成。QRT-PCR采用2 × SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為模板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μL體系進行擴增，每個待測樣本設置3個平行樣。以U6 snRNA作為內參。PCR反應在實時定量PCR反應儀上進行。3次獨立試驗后得到的數據采用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進行分析，其中ΔΔCt=(待測樣品的目的基因Ct的平均值－待測樣本的管家基因Ct的平均值)-(對照樣品的目的基因Ct的平均值－對照樣本的管家基因Ct的平均值)。將2-ΔΔCt=1作為分界值，CIP2A表達值＞1為高表達，CIP2A表達值＜1為低表達。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析。患者組織標本中LncRNA KCNQ1OT1表達數據以x±s表示，兩組間樣本均數比較采用t檢驗。應用χ2檢驗分析LncRNA KCNQ1OT1表達水平與各臨床病理參數的關系；采用Kaplan-Meier生存分析法分析LncRNA KCNQ1OT1表達與NSCLC生存期(overall survival，OS)及無進展生存時間(progression-free survival，PFS)之間的關系；采用Cox比例風險模型分析影響NSCLC預后的因素。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者組織中的表達
采用QRT-PCR檢測89例NSCLC癌組織和癌旁組織中LncRNA KCNQ1OT1的表達，結果顯示LncRNA KCNQ1OT1在癌組織中的表達為7.266±0.470，較癌旁組織(1.162±0.087)明顯增高，差異具有統計學意義(t=11.64，P＜0.001)。結果見圖 1。
圖1
LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中的表達
二 LncRNA KCNQ1OT1的表達與患者臨床病理特征的關系
根據KCNQ1OT1在NSCLC組織中表達情況，以組織中KCNQ1OT1表達倍數的中位數3.742為界值，將89例NSCLC患者分為KCNQ1OT1高表達組(n=49)和KCNQ1OT1低表達組(n=40)，分析KCNQ1OT1表達水平與臨床病理特征的關系。LncRNA KCNQ1OT1的表達與患者年齡、性別及病理類型無顯著相關性(P＞0.05)，與腫瘤大小(χ2=12.619，P＜0.001)、淋巴結轉移(χ2=10.298，P=0.001)、TNM分期(χ2=7.199，P=0.007)及吸煙史(χ2=24.005，P＜0.001)明顯相關。
三 LncRNA KCNQ1OT1對患者生存的影響
生存分析提示LncRNA KCNQ1OT1高表達患者的總生存時間顯著低于低表達患者(20.0個月比35.0個月，χ2=45.860，P＜0.001)(圖 2a)。LncRNA KCNQ1OT1高表達患者的中位PFS顯著低于低表達患者(12.0個月比24.0個月，χ2=31.510，P＜0.001)(圖 2b)。
圖2
LncRNA KCNQ1OT1對患者總生存時間及PFS的影響
Cox回歸分析患者的性別、年齡、疾病分期、病理類型及LncRNA KCNQ1OT1表達與患者預后的關系，結果顯示疾病分期和LncRNA KCNQ1OT1可作為獨立的預后因子，分期越晚的相對危險度越高(RR=3.398，95%CI 2.351~7.876，P=0.001)，LncRNA KCNQ1OT1高表達的相對危險度為低表達者的6.318倍(RR=6.318，95%CI 4.745~12.537，P=0.001)。結果見表 2。
表1
LncRNA KCNQ1OT1的表達與患者臨床病理特征的關系(例)
表2
LncRNA KCNQ1OT1表達與NSCLC預后的關系
討論
肺癌是世界范圍內發病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一。肺癌預后差的主要原因是腫瘤細胞發生侵襲與轉移。誘發及促進肺癌細胞發生侵襲和轉移的機制目前尚不十分清楚，早期診斷及轉移的腫瘤標記物缺乏是肺癌治療的重要挑戰之一[11]。LncRNA是一類長度大于200個堿基，缺少完整的開放閱讀框，無或很少有蛋白編碼能力的RNA。研究表明LncRNA在細胞生理和病理活動中發揮重要的作用，并參與包括腫瘤在內的多種疾病的發生發展過程。其中研究得最廣泛的是HOTAIR。研究發現HOTAIR的失調與乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、胃癌、喉鱗狀細胞癌、鼻咽癌、NSCLC及食管癌相關，HOTAIR的失調影響著癌癥患者的預后[12-14]。LncRNA與肺癌臨床病理特征及預后的分析也逐漸增多，MALAT-1是第一個在肺癌中被研究的LncRNA，它可以作為早期肺腺癌中患者預后的一個獨立預后標記物[15-16]。Liu等[17]研究發現HOTAIR在NSCLC樣本中高表達，HOTAIR高表達狀態與NSCLC淋巴結轉移及臨床分級相關，此外，HOTAIR高表達的患者預后相對較差。CCAT2被發現在NSCLC組織中顯著高表達，CCAT2的高表達水平與肺腺癌相關，提示CCAT2可能是一個肺腺癌特異的LncRNA[18]。GAS5在NSCLC組織中低表達，其表達水平與NSCLC的腫瘤大小及臨床分級相關[19]。GAS6-AS1在NSCLC組織中低表達，其表達水平與NSCLC的淋巴結轉移及臨床分級有關，而且GAS6-AS1是NSCLC患者一個獨立的預后標志物[20]。雖然LncRNA與肺癌的研究越來越多，但是數量仍然有限。
KCNQ1OT1是一個位于KCNQ1位點的LncRNA基因。印記基因是指僅一方親本來源的同源基因表達, 而來自另一親本的不表達。KCNQ1OT1只表達父源等位基因，它的轉錄物調控位于11號染色體p端15.5著絲粒位置[21]。印記基因的異常表達引發伴有復雜突變和表型缺陷的多種人類疾病[22-23]。關于KCNQ1OT1在腫瘤中的研究目前尚處于起步階段，近年來的研究發現KCNQ1OT1可促進肝癌的形成[24]，關于KCNQ1OT1在NSCLC中的作用及機制目前國內外尚未見相關報道。本研究采用QRT-PCR法檢測NSCLC癌組織及癌旁組織中LncRNA KCNQ1OT1的表達，結合臨床資料分析其臨床意義。本研究結果發現，與癌旁組織比較，LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC組織中的表達水平明顯增高；LncRNA KCNQ1OT1的表達與患者年齡、性別及病理類型無關，與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期及吸煙史明顯相關；生存分析提示LncRNA KCNQ1OT1高表達患者的總生存時間和中位PFS低于低表達患者；Cox回歸分析發現疾病分期和LncRNA KCNQ1OT1的表達可作為獨立的預后不良的標志。
綜上所述，LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC癌組織標本中高表達，與患者的預后相關，可能是潛在的肺癌預后預測分子標志物。但由于樣本量不大，且缺乏相關分子生物學及實驗室數據，關于KCNQ1OT1在非小細胞肺癌中的具體作用及分子機制尚需進一步深入研究。
肺癌在全球范圍內新發病例數已超過120萬/年，成為導致腫瘤相關死亡的重要原因。隨著分子生物學的發展，人們逐漸認識到肺癌的發生、發展和轉移是多基因、多階段、多因素共同參與的復雜過程，涉及多種分子機制[1-2]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類長度大于200個堿基的非編碼RNA。已證實LncRNA在癌癥的發生發展中發揮重要作用，與多種癌癥的生物學過程有關，比如癌癥的發生發展、浸潤和轉移過程[3-5]。雖然基因組分析發現了大量的LncRNA，但目前只對少部分LncRNA進行了研究，其中研究較多的是HOTAIR和MALAT-1。這些LncRNA具有作為腫瘤診斷、預后分子標志物的潛力，其表達水平與多種腫瘤的臨床病理特征及預后相關[6-9]。前期通過基因芯片發現LncRNA KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1 overlapping transcript 1, KCNQ1OT1)在非小細胞肺癌(NSCLC)細胞株中高表達，近年來的研究發現LncRNA KCNQ1重疊轉錄物1 (KCNQ1OT1)參與調節多種腫瘤的發生發展[10]，然而關于LncRNA KCNQ1重疊轉錄物1(KCNQ1 overlapping transcritp 1, KCNQ1OT1)在NSCLC中的作用國內外尚未見相關報道。本研究通過實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，QRT-PCR)方法檢測LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者肺癌組織及其對應的正常肺組織標本中的表達情況，并對患者的臨床病理特征進行分析，揭示LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC中的可能作用，為尋找NSCLC患者臨床預后的靶基因提供依據。
對象與方法
一 對象
收集2011年1月至2013年12月期間在四川省腫瘤醫院行根治性或姑息性切除術的89例NSCLC癌組織及癌旁組織(癌旁組織距離癌組織達5 cm以上)，同時收集患者個人信息和詳細臨床資料。所有組織均經病理學確診為NSCLC，手術切除的新鮮標本立即放入液氮中凍存，所有患者術前均未行放化療。患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小、淋巴結是否轉移及病理類型等方面的臨床資料均收集完整。其中男49例，女40例；平均年齡(50.0±9.2)歲，年齡＜50歲42例，年齡≥50歲47例；臨床分期Ⅰ期23例，Ⅱ期30例，Ⅲ期20例，Ⅳ期16例；鱗癌及其他類型20例，腺癌69例。本研究經本院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。
二 方法
1．隨訪：全部89例患者出院后均隨訪，以電話和復查的方式進行。隨訪內容包括一般情況、臨床癥狀及影像學檢查。隨訪起點為確診日期，末次隨訪時間為2016年6月25日，至隨訪截止日，存活35例，死亡54例，無失訪病例。隨訪時間18~66個月。
2．QRT-PCR分析LncRNA KCNQ1OT1的表達：收集NSCLC組織及癌旁組織50~100 mg，在液氮中磨成粉末后，加入1 mL Trizol液研磨(樣品總體積不超過所用Trizol體積的10%)，分別移入去RNA酶的EP管中，提取總RNA。取上述準備的RNA，逆轉錄反應參照AMV逆轉錄試劑盒說明，在20 μL體系中加2 μg總RNA進行cDNA的合成。QRT-PCR采用2 × SYBR Green PCR Master Mix，取適量cDNA作為模板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μL體系進行擴增，每個待測樣本設置3個平行樣。以U6 snRNA作為內參。PCR反應在實時定量PCR反應儀上進行。3次獨立試驗后得到的數據采用公式RQ=2-ΔΔCt的方法進行分析，其中ΔΔCt=(待測樣品的目的基因Ct的平均值－待測樣本的管家基因Ct的平均值)-(對照樣品的目的基因Ct的平均值－對照樣本的管家基因Ct的平均值)。將2-ΔΔCt=1作為分界值，CIP2A表達值＞1為高表達，CIP2A表達值＜1為低表達。
三 統計學處理
采用SPSS 13.0統計學軟件進行數據分析。患者組織標本中LncRNA KCNQ1OT1表達數據以x±s表示，兩組間樣本均數比較采用t檢驗。應用χ2檢驗分析LncRNA KCNQ1OT1表達水平與各臨床病理參數的關系；采用Kaplan-Meier生存分析法分析LncRNA KCNQ1OT1表達與NSCLC生存期(overall survival，OS)及無進展生存時間(progression-free survival，PFS)之間的關系；采用Cox比例風險模型分析影響NSCLC預后的因素。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者組織中的表達
采用QRT-PCR檢測89例NSCLC癌組織和癌旁組織中LncRNA KCNQ1OT1的表達，結果顯示LncRNA KCNQ1OT1在癌組織中的表達為7.266±0.470，較癌旁組織(1.162±0.087)明顯增高，差異具有統計學意義(t=11.64，P＜0.001)。結果見圖 1。
圖1
LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC患者癌組織及癌旁組織中的表達
二 LncRNA KCNQ1OT1的表達與患者臨床病理特征的關系
根據KCNQ1OT1在NSCLC組織中表達情況，以組織中KCNQ1OT1表達倍數的中位數3.742為界值，將89例NSCLC患者分為KCNQ1OT1高表達組(n=49)和KCNQ1OT1低表達組(n=40)，分析KCNQ1OT1表達水平與臨床病理特征的關系。LncRNA KCNQ1OT1的表達與患者年齡、性別及病理類型無顯著相關性(P＞0.05)，與腫瘤大小(χ2=12.619，P＜0.001)、淋巴結轉移(χ2=10.298，P=0.001)、TNM分期(χ2=7.199，P=0.007)及吸煙史(χ2=24.005，P＜0.001)明顯相關。
三 LncRNA KCNQ1OT1對患者生存的影響
生存分析提示LncRNA KCNQ1OT1高表達患者的總生存時間顯著低于低表達患者(20.0個月比35.0個月，χ2=45.860，P＜0.001)(圖 2a)。LncRNA KCNQ1OT1高表達患者的中位PFS顯著低于低表達患者(12.0個月比24.0個月，χ2=31.510，P＜0.001)(圖 2b)。
圖2
LncRNA KCNQ1OT1對患者總生存時間及PFS的影響
Cox回歸分析患者的性別、年齡、疾病分期、病理類型及LncRNA KCNQ1OT1表達與患者預后的關系，結果顯示疾病分期和LncRNA KCNQ1OT1可作為獨立的預后因子，分期越晚的相對危險度越高(RR=3.398，95%CI 2.351~7.876，P=0.001)，LncRNA KCNQ1OT1高表達的相對危險度為低表達者的6.318倍(RR=6.318，95%CI 4.745~12.537，P=0.001)。結果見表 2。
表1
LncRNA KCNQ1OT1的表達與患者臨床病理特征的關系(例)
表2
LncRNA KCNQ1OT1表達與NSCLC預后的關系
討論
肺癌是世界范圍內發病率及死亡率最高的惡性腫瘤之一。肺癌預后差的主要原因是腫瘤細胞發生侵襲與轉移。誘發及促進肺癌細胞發生侵襲和轉移的機制目前尚不十分清楚，早期診斷及轉移的腫瘤標記物缺乏是肺癌治療的重要挑戰之一[11]。LncRNA是一類長度大于200個堿基，缺少完整的開放閱讀框，無或很少有蛋白編碼能力的RNA。研究表明LncRNA在細胞生理和病理活動中發揮重要的作用，并參與包括腫瘤在內的多種疾病的發生發展過程。其中研究得最廣泛的是HOTAIR。研究發現HOTAIR的失調與乳腺癌、肝癌、胰腺癌、結腸癌、胃癌、喉鱗狀細胞癌、鼻咽癌、NSCLC及食管癌相關，HOTAIR的失調影響著癌癥患者的預后[12-14]。LncRNA與肺癌臨床病理特征及預后的分析也逐漸增多，MALAT-1是第一個在肺癌中被研究的LncRNA，它可以作為早期肺腺癌中患者預后的一個獨立預后標記物[15-16]。Liu等[17]研究發現HOTAIR在NSCLC樣本中高表達，HOTAIR高表達狀態與NSCLC淋巴結轉移及臨床分級相關，此外，HOTAIR高表達的患者預后相對較差。CCAT2被發現在NSCLC組織中顯著高表達，CCAT2的高表達水平與肺腺癌相關，提示CCAT2可能是一個肺腺癌特異的LncRNA[18]。GAS5在NSCLC組織中低表達，其表達水平與NSCLC的腫瘤大小及臨床分級相關[19]。GAS6-AS1在NSCLC組織中低表達，其表達水平與NSCLC的淋巴結轉移及臨床分級有關，而且GAS6-AS1是NSCLC患者一個獨立的預后標志物[20]。雖然LncRNA與肺癌的研究越來越多，但是數量仍然有限。
KCNQ1OT1是一個位于KCNQ1位點的LncRNA基因。印記基因是指僅一方親本來源的同源基因表達, 而來自另一親本的不表達。KCNQ1OT1只表達父源等位基因，它的轉錄物調控位于11號染色體p端15.5著絲粒位置[21]。印記基因的異常表達引發伴有復雜突變和表型缺陷的多種人類疾病[22-23]。關于KCNQ1OT1在腫瘤中的研究目前尚處于起步階段，近年來的研究發現KCNQ1OT1可促進肝癌的形成[24]，關于KCNQ1OT1在NSCLC中的作用及機制目前國內外尚未見相關報道。本研究采用QRT-PCR法檢測NSCLC癌組織及癌旁組織中LncRNA KCNQ1OT1的表達，結合臨床資料分析其臨床意義。本研究結果發現，與癌旁組織比較，LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC組織中的表達水平明顯增高；LncRNA KCNQ1OT1的表達與患者年齡、性別及病理類型無關，與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期及吸煙史明顯相關；生存分析提示LncRNA KCNQ1OT1高表達患者的總生存時間和中位PFS低于低表達患者；Cox回歸分析發現疾病分期和LncRNA KCNQ1OT1的表達可作為獨立的預后不良的標志。
綜上所述，LncRNA KCNQ1OT1在NSCLC癌組織標本中高表達，與患者的預后相關，可能是潛在的肺癌預后預測分子標志物。但由于樣本量不大，且缺乏相關分子生物學及實驗室數據，關于KCNQ1OT1在非小細胞肺癌中的具體作用及分子機制尚需進一步深入研究。
