引用本文： 楊海華, 龍豐, 李圣青, 張霞, 金先橋. 1,25-(OH)2D3 對激素抵抗型哮喘患者 T 淋巴細胞 JNK/AP-1 和糖皮質激素受體的影響 . 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(2): 155-159. doi: 10.7507/1671-6205.201610033 復制
哮喘是一種常見的呼吸道疾病，嚴重危害人們的身心健康，糖皮質激素是治療哮喘急性發作的重要藥物。在臨床工作中，激素抵抗型支氣管哮喘（簡稱 SR 哮喘，約占哮喘患者的5%～10%）因反復急性發作，應用較大劑量的糖皮質激素治療效果差，耗費了哮喘患者中超過 50% 的醫療資源[1-2]。T淋巴細胞是哮喘發病機制中的主要炎癥細胞，糖皮質激素能抑制 T 淋巴細胞等炎癥細胞的致炎作用；T 淋巴細胞對糖皮質激素的抗炎作用反應性低下是臨床糖皮質激素抵抗機制的基礎[1, 3]。糖皮質激素通過與糖皮質激素受體結合而產生生物效應，糖皮質激素受體磷酸化異常以及糖皮質激素受體與激素的親和力降低在糖皮質激素抵抗的機制中起重要作用[4-6]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核轉錄因子活化蛋白 1（activator protein 1，AP-1）可與糖皮質激素受體結合，從而影響糖皮質激素功能的發揮，進而參與糖皮質激素的抵抗機制[4, 7]。維生素 D 可改善糖皮質激素抵抗，可作為 SR 哮喘的輔助治療，但在改善 SR 哮喘糖皮質激素抵抗中的作用機制有待進一步研究[4, 8-12]。本研究擬就維生素 D 對 SR 哮喘患者 T 淋巴細胞 JNK/AP-1 信號通路和糖皮質激素受體的影響及機制進行探討。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
收集 2014 年至 2015 年期間至復旦大學附屬華山醫院北院門診和住院部急性發作的哮喘患者。所有哮喘患者診斷符合 2013 GINA 指南診斷標準。入組者均進行肺功能檢查，SR 哮喘和激素敏感型支氣管哮喘（簡稱 SS 哮喘）的分診斷根據文獻標準，口服潑尼松 20 mg/d，連續 7 d，第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）改善不足 15% 者為 SR 哮喘，FEV1 改善超過 25% 者為 SS 哮喘[13-14]。SR 哮喘和 SS 哮喘的診斷均在此次入組前已診斷明確。SS 哮喘急性發作患者 26 例，男 10 例，女 16 例；平均年齡為（52.3±15.4）歲；中度急性發作 20 例，重度急性發作 6 例。SR 哮喘急性發作患者 36 例，男 16 例，女 20 例；平均年齡為（53.4±14.8）歲；中度急性發作 28 例，重度急性發作 8 例。健康對照者來自復旦大學附屬華山醫院北院體檢中心，共 25 例，男 10 例，女 15 例，平均年齡為（51.9±16.9 ）歲。哮喘入組患者此次急性發作入組前的半年內均進行了基礎肺功能檢查，SS 哮喘患者的 FEV1 值為（2.16±0.91）L，SR 哮喘患者的 FEV1 值為（2.03±0.87）L。入組者排除條件如下：（1）吸煙、服用影響糖皮質激素代謝的藥物如抗驚厥藥和利福平等；（2）患有除哮喘以外其他肺部疾病史；（3）近 4 周內有呼吸道感染；（4）患有肝臟、腎臟疾病等嚴重內科疾病；（5）近 4 周內有應用維生素 D 和全身使用糖皮質激素史。本試驗倫理由復旦大學附屬華山醫院倫理委員會審批通過。所有入組者均知情同意并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 T 淋巴細胞分離、純化、培養及分組 SS 哮喘和 SR 哮喘患者均在入院第 1 d 取外周靜脈血，SS 哮喘患者和健康對照者抽取外周靜脈血 15 ml，SR 哮喘患者抽取外周靜脈血 30 ml。以上入組者外周靜脈血均留取 5 ml 用于檢測 25-(OH)D 水平，余外周靜脈血經肝素抗凝后采用 Ficoll 密度梯度離心法進行細胞分離，將分離的外周血單個核細胞加入 RPMI-1640 培養基中培養 4 h（貼壁）后取出懸浮的 T 淋巴細胞，用錐蟲藍染色計數活細胞比例，當活細胞比例大于 96% 后再進入下一步試驗驗。用含 10% 胎牛血清培養液調整細胞濃度 2×106個/ml。試驗分組如下：（1）A 組：健康對照組；（2）B 組：SS 哮喘對照組；（3）C 組：SR 哮喘對照組；（4）D 組：SR 哮喘 JNK 抑制劑+1,25-(OH)2D3 組，先加 5 μmol/L JNK抑制劑 SP600125 預處理 30 min，再加入 100 nmol/L 的 1,25-(OH)2D3；（5）E 組：SR 哮喘 JNK 抑制劑組，加入 5 μmol/L 的 SP600125；（6）F 組：SR 哮喘 1,25-(OH)2D3 組，加入 100 nmol/L 的 1,25-(OH)2D3。除干預因素不同外，每組細胞培養條件均一致。以上各組 T 淋巴細胞共培養 48 h，培養結束后離心收集沉淀的 T 淋巴細胞用于下一步實驗。
1.2.2 Western blot 方法檢測 T 淋巴細胞中 p-JNK 和 p-GR 的表達 取出 T 淋巴細胞，加入細胞裂解液，放置冰上裂解 30 min，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，根據 BCA 法進行蛋白定量。總蛋白經 SDS-PAGE 分離后，轉移到 PVDF 膜上。用 5% 脫脂奶粉封閉 1.5 h，隨后加入磷酸化 JNK（p-JNK）抗體和磷酸化糖皮質激素受體（ p-GR） 抗體（ Cell Signaling Technology 公司），4 ℃ 過夜，用 TBST 洗 3 次，每次 10 min。將 PVDF 膜用發光試劑 ECL 顯色，凝膠成像系統掃描分析結果。
1.2.3 RT-PCR 法檢測 T 淋巴細胞中 c-Jun mRNA 的表達 取出 T 淋巴細胞，按照總 RNA 提取試劑盒（GI GEN 公司）說明書方法進行提取總 RNA，計算樣品總 RNA 進行 RT-PCR 檢測。c-Jun 引物（由上海生工合成），引物序列如下：上游 5’-ATGACTGCAAAGATGGAAACGACC-3’，下游 5’-GATGTGCCCGTTGCTGGACTGGAT-3’（264 bp）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物，上游 5’-GAAGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游 5’-TTCACACCCATGACGAACAT-3’（402 bp）。c-Jun 的退火溫度為 53℃，30 s，35 個循環；GAPDH 退火溫度為 55℃，1 min，30 個循環。PCR 產物以 1% 瓊脂糖凝膠電泳。Fluorochem5500 成像系統采集圖像，以 c-Jun mRNA 吸光度和 Tbp 吸光度的比值表示 c-Jun mRNA 相對表達量。
1.2.4 ELISA 法檢測血清中 25-(OH)D 水平 ELISA 法按照試劑盒（R&D 公司）說明書進行操作。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 16.0 統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ ）表示，在方差齊性基礎上，兩組間比較采用 t 檢驗。計數資料之間的比較采用 χ2 檢驗。用 Pearson 相關分析檢測兩因素之間相關關系。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 入組者一般情況和 25-(OH)D 水平情況
A 組、B 組和 C 組研究對象在性別構成、年齡、體重指數方面差異無統計學意義（P>0.05）。B 組和 C 組的基礎肺功能 FEV1 差異無統計學意義（P>0.05）。B 組和 C 組 25-（OH）D 水平均低于 A 組[（40.77±9.29）nmol/L 和（31.89±7.10）nmol/L 比（55.74±11.54） nmol/L，P<0.05]，C 組 25-(OH)D 水平低于 B 組[（31.89±7.10）nmol/L 比（40.77±9.29）nmol/L，P<0.05]。結果見圖 1。
圖1
各組間血清 25-(OH)D 水平的比較
2.2 T 淋巴細胞 p-JNK 和 p-GR 的表達情況
B 組和 C 組 p-JNK 蛋白表達水平高于 A 組（0.22±0.02 和 0.51±0.04 比 0.13±0.01， P<0.05），而 C 組高于 B 組（0.51±0.04 比 0.22±0.02，P<0.05），E 組和 F 組均低于 C 組（0.35±0.04 和 0.39±0.02 比 0.51±0.04，P<0.05），D 組低于 F 組（0.27±0.03 比 0.39±0.02，P<0.05）。結果見圖 2 和 3。
圖2
Western blot 法檢測T淋巴細胞中 p-JNK 的表達水平
圖3
各組間 p-JNK 水平的比較
A 組和 B 組的 p-GR 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。C 組的 p-GR 蛋白表達水平低于 A 組和 B 組（0.46±0.06 比 1.19±0.06 和 1.23±0.07，P<0.05），E 組和 F 組均高于 C 組（0.76±0.07 和 0.83±0.08 比 0.46±0.06，P<0.05），D 組高于 F 組（0.95±0.08 比0.83±0.08， P<0.05）。結果見圖 4 和 5。
圖4
Western blot 法檢測 T 淋巴細胞中 p-GR 的表達水平
圖5
各組間 p-GR 水平的比較
2.3 T 淋巴細胞 c-Jun mRNA 的表達情況
B 組和 C 組 c-Jun mRNA 的表達水平顯著高于 A 組 （1.32±0.06 和 1.57±0.09 比 0.62±0.05，P<0.05），且 C 組高于 B 組 （1.57±0.09 比 1.32±0.06，P<0.05），E 組和 F 組均低于 C 組（1.04±0.08 和 1.16±0.07 比 1.57±0.09，P<0.05），D 組低于 F 組（0.87±0.06 比 1.16±0.07，P<0.05）。結果見圖 6。
圖6
各組間 c-Jun mRNA 水平的比較
2.4 相關性分析
C 組患者血清中 25-(OH)D 水平與 T 淋巴細胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平呈負相關（r=–0.69，r=–0.65，P<0.05），與 p-GR 平呈正相關（r=0.72，P<0.05）。
3 討論
25-(OH)D 是維生素 D 在人體血液中的主要形式，其性質最穩定且含量又最多，因此血清的 25-(OH)D水平可作為維生素 D 營養狀況檢測的客觀指標。外周血清 25-(OH)D<50 nmol/L 定義為維生素 D 缺乏，25-(OH)D 50～70 nmol/L 定義為維生素 D 不足[15]。1,25-(OH)2D3 是維生素 D 在體內的主要活性形式，維生素 D 的大部分功能是通過 1,25-(OH)2D3 發揮作用[16]。哮喘患者由于容易過敏、戶外運動減少從而導致有效日光照射不足，以及反復急性發作缺氧、食欲減退等造成維生素 D 合成和吸收減少；此外，哮喘患者長期治療需使用糖皮質激素而使維生素 D 的代謝增加。因此，哮喘患者維生素 D 缺乏情況較普遍[11, 17-19]。而以上影響維生素 D 吸收、合成和代謝的因素在 SR 哮喘患者的病程中更為明顯。本研究結果也顯示，維生素 D 不足或缺乏在 SS 哮喘和 SR 哮喘患者中患病率高，而 SR 哮喘較 SS 哮喘患者更為嚴重。
JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族信號系統的成員之一。AP-1 是位于 JNK 下游的關鍵信號蛋白分子。AP-1 主要由 c-Jun 和 c-Fos 家族構成，JNK 接受上游炎癥因子等刺激信號后被磷酸化激活，可進一步使核內轉錄因子 c-Jun 的氨基末端磷酸化，進而激活 c-Jun 繼而啟動并增強炎癥轉錄。有研究發現，JNK 可通過使糖皮質激素受體的絲氨酸 226 磷酸化（正常情況下糖皮質激素受體的絲氨酸 211 被磷酸化而活化）而抑制糖皮質激素反應元件的轉錄活性；哮喘患者存在 AP-1 異常活化，AP-1 與糖皮質激素受體結合形成復合物，導致糖皮質激素受體有效數目減少。此外，c-Jun 還可抑制 80% 的糖皮質激素受體啟動子活性[4, 20]。因此，JNK/AP-1 信號通路可影響糖皮質激素受體而參與糖皮質激素的抵抗。糖皮質激素是治療哮喘急性發作的重要藥物，而 T 淋巴細胞在哮喘急性發作的炎癥反應中起重要作用，同時也參與了糖皮質激素抵抗的發病機制，因此我們對急性發作期 SR 哮喘患者的 T 淋巴細胞在糖皮質激素抵抗中的機制進行研究。本研究發現，SR 哮喘患者的 T 淋巴細胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 的表達水平較 SS 哮喘和健康對照組高，而 p-GR 的表達降低。為進一步探討 JNK/AP-1 信號通路對 SR 哮喘患者 T 淋巴細胞糖皮質激素受體的影響，我們在實驗中加入 JNK 抑制劑 SP600125，結果顯示 SR 哮喘患者 T 淋巴細胞的 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平均降低，而 p-GR 的表達增加。因此，我們推測 SR 哮喘患者 T 淋巴細胞的 p-JNK 和 c-Jun 過度表達，繼而抑制了 p-GR 的表達，從而導致糖皮質激素抵抗。
有研究報道，哮喘患者的維生素 D 水平與糖皮質激素抵抗有關，而適當補充維生素 D 可改善糖皮質激素抵抗[4, 8-9, 21]。本實驗發現，SR 哮喘患者中維生素 D 缺乏患病率高；而 1,25-(OH)2D3 可降低 SR 哮喘的 T 淋巴細胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 的表達，增加 p-GR 的表達；相關分析顯示，SR 哮喘患者血清中 25-(OH)D 水平與 T 淋巴細胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平呈負相關，與 p-GR 水平呈正相關。以上結果提示 1,25-(OH)2D3 可通過抑制 SR 哮喘 T 淋巴細胞 JNK/AP-1 信號通路而促進 p-GR 的表達，這可能是維生素 D 可改善 SR 哮喘糖皮質激素抵抗機制之一。隨著研究的深入，相信維生素 D 將會為 SR 哮喘的治療提供新的思路。
哮喘是一種常見的呼吸道疾病，嚴重危害人們的身心健康，糖皮質激素是治療哮喘急性發作的重要藥物。在臨床工作中，激素抵抗型支氣管哮喘（簡稱 SR 哮喘，約占哮喘患者的5%～10%）因反復急性發作，應用較大劑量的糖皮質激素治療效果差，耗費了哮喘患者中超過 50% 的醫療資源[1-2]。T淋巴細胞是哮喘發病機制中的主要炎癥細胞，糖皮質激素能抑制 T 淋巴細胞等炎癥細胞的致炎作用；T 淋巴細胞對糖皮質激素的抗炎作用反應性低下是臨床糖皮質激素抵抗機制的基礎[1, 3]。糖皮質激素通過與糖皮質激素受體結合而產生生物效應，糖皮質激素受體磷酸化異常以及糖皮質激素受體與激素的親和力降低在糖皮質激素抵抗的機制中起重要作用[4-6]。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和核轉錄因子活化蛋白 1（activator protein 1，AP-1）可與糖皮質激素受體結合，從而影響糖皮質激素功能的發揮，進而參與糖皮質激素的抵抗機制[4, 7]。維生素 D 可改善糖皮質激素抵抗，可作為 SR 哮喘的輔助治療，但在改善 SR 哮喘糖皮質激素抵抗中的作用機制有待進一步研究[4, 8-12]。本研究擬就維生素 D 對 SR 哮喘患者 T 淋巴細胞 JNK/AP-1 信號通路和糖皮質激素受體的影響及機制進行探討。
1 資料與方法
1.1 臨床資料和分組
收集 2014 年至 2015 年期間至復旦大學附屬華山醫院北院門診和住院部急性發作的哮喘患者。所有哮喘患者診斷符合 2013 GINA 指南診斷標準。入組者均進行肺功能檢查，SR 哮喘和激素敏感型支氣管哮喘（簡稱 SS 哮喘）的分診斷根據文獻標準，口服潑尼松 20 mg/d，連續 7 d，第 1 秒用力呼氣容積（FEV1）改善不足 15% 者為 SR 哮喘，FEV1 改善超過 25% 者為 SS 哮喘[13-14]。SR 哮喘和 SS 哮喘的診斷均在此次入組前已診斷明確。SS 哮喘急性發作患者 26 例，男 10 例，女 16 例；平均年齡為（52.3±15.4）歲；中度急性發作 20 例，重度急性發作 6 例。SR 哮喘急性發作患者 36 例，男 16 例，女 20 例；平均年齡為（53.4±14.8）歲；中度急性發作 28 例，重度急性發作 8 例。健康對照者來自復旦大學附屬華山醫院北院體檢中心，共 25 例，男 10 例，女 15 例，平均年齡為（51.9±16.9 ）歲。哮喘入組患者此次急性發作入組前的半年內均進行了基礎肺功能檢查，SS 哮喘患者的 FEV1 值為（2.16±0.91）L，SR 哮喘患者的 FEV1 值為（2.03±0.87）L。入組者排除條件如下：（1）吸煙、服用影響糖皮質激素代謝的藥物如抗驚厥藥和利福平等；（2）患有除哮喘以外其他肺部疾病史；（3）近 4 周內有呼吸道感染；（4）患有肝臟、腎臟疾病等嚴重內科疾病；（5）近 4 周內有應用維生素 D 和全身使用糖皮質激素史。本試驗倫理由復旦大學附屬華山醫院倫理委員會審批通過。所有入組者均知情同意并簽署知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 T 淋巴細胞分離、純化、培養及分組 SS 哮喘和 SR 哮喘患者均在入院第 1 d 取外周靜脈血，SS 哮喘患者和健康對照者抽取外周靜脈血 15 ml，SR 哮喘患者抽取外周靜脈血 30 ml。以上入組者外周靜脈血均留取 5 ml 用于檢測 25-(OH)D 水平，余外周靜脈血經肝素抗凝后采用 Ficoll 密度梯度離心法進行細胞分離，將分離的外周血單個核細胞加入 RPMI-1640 培養基中培養 4 h（貼壁）后取出懸浮的 T 淋巴細胞，用錐蟲藍染色計數活細胞比例，當活細胞比例大于 96% 后再進入下一步試驗驗。用含 10% 胎牛血清培養液調整細胞濃度 2×106個/ml。試驗分組如下：（1）A 組：健康對照組；（2）B 組：SS 哮喘對照組；（3）C 組：SR 哮喘對照組；（4）D 組：SR 哮喘 JNK 抑制劑+1,25-(OH)2D3 組，先加 5 μmol/L JNK抑制劑 SP600125 預處理 30 min，再加入 100 nmol/L 的 1,25-(OH)2D3；（5）E 組：SR 哮喘 JNK 抑制劑組，加入 5 μmol/L 的 SP600125；（6）F 組：SR 哮喘 1,25-(OH)2D3 組，加入 100 nmol/L 的 1,25-(OH)2D3。除干預因素不同外，每組細胞培養條件均一致。以上各組 T 淋巴細胞共培養 48 h，培養結束后離心收集沉淀的 T 淋巴細胞用于下一步實驗。
1.2.2 Western blot 方法檢測 T 淋巴細胞中 p-JNK 和 p-GR 的表達 取出 T 淋巴細胞，加入細胞裂解液，放置冰上裂解 30 min，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，根據 BCA 法進行蛋白定量。總蛋白經 SDS-PAGE 分離后，轉移到 PVDF 膜上。用 5% 脫脂奶粉封閉 1.5 h，隨后加入磷酸化 JNK（p-JNK）抗體和磷酸化糖皮質激素受體（ p-GR） 抗體（ Cell Signaling Technology 公司），4 ℃ 過夜，用 TBST 洗 3 次，每次 10 min。將 PVDF 膜用發光試劑 ECL 顯色，凝膠成像系統掃描分析結果。
1.2.3 RT-PCR 法檢測 T 淋巴細胞中 c-Jun mRNA 的表達 取出 T 淋巴細胞，按照總 RNA 提取試劑盒（GI GEN 公司）說明書方法進行提取總 RNA，計算樣品總 RNA 進行 RT-PCR 檢測。c-Jun 引物（由上海生工合成），引物序列如下：上游 5’-ATGACTGCAAAGATGGAAACGACC-3’，下游 5’-GATGTGCCCGTTGCTGGACTGGAT-3’（264 bp）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物，上游 5’-GAAGTGAAGGTCGGAGTCA-3’，下游 5’-TTCACACCCATGACGAACAT-3’（402 bp）。c-Jun 的退火溫度為 53℃，30 s，35 個循環；GAPDH 退火溫度為 55℃，1 min，30 個循環。PCR 產物以 1% 瓊脂糖凝膠電泳。Fluorochem5500 成像系統采集圖像，以 c-Jun mRNA 吸光度和 Tbp 吸光度的比值表示 c-Jun mRNA 相對表達量。
1.2.4 ELISA 法檢測血清中 25-(OH)D 水平 ELISA 法按照試劑盒（R&D 公司）說明書進行操作。
1.3 統計學方法
應用 SPSS 16.0 統計軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差（ ）表示，在方差齊性基礎上，兩組間比較采用 t 檢驗。計數資料之間的比較采用 χ2 檢驗。用 Pearson 相關分析檢測兩因素之間相關關系。P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 入組者一般情況和 25-(OH)D 水平情況
A 組、B 組和 C 組研究對象在性別構成、年齡、體重指數方面差異無統計學意義（P>0.05）。B 組和 C 組的基礎肺功能 FEV1 差異無統計學意義（P>0.05）。B 組和 C 組 25-（OH）D 水平均低于 A 組[（40.77±9.29）nmol/L 和（31.89±7.10）nmol/L 比（55.74±11.54） nmol/L，P<0.05]，C 組 25-(OH)D 水平低于 B 組[（31.89±7.10）nmol/L 比（40.77±9.29）nmol/L，P<0.05]。結果見圖 1。
圖1
各組間血清 25-(OH)D 水平的比較
2.2 T 淋巴細胞 p-JNK 和 p-GR 的表達情況
B 組和 C 組 p-JNK 蛋白表達水平高于 A 組（0.22±0.02 和 0.51±0.04 比 0.13±0.01， P<0.05），而 C 組高于 B 組（0.51±0.04 比 0.22±0.02，P<0.05），E 組和 F 組均低于 C 組（0.35±0.04 和 0.39±0.02 比 0.51±0.04，P<0.05），D 組低于 F 組（0.27±0.03 比 0.39±0.02，P<0.05）。結果見圖 2 和 3。
圖2
Western blot 法檢測T淋巴細胞中 p-JNK 的表達水平
圖3
各組間 p-JNK 水平的比較
A 組和 B 組的 p-GR 蛋白表達水平比較差異無統計學意義（P>0.05）。C 組的 p-GR 蛋白表達水平低于 A 組和 B 組（0.46±0.06 比 1.19±0.06 和 1.23±0.07，P<0.05），E 組和 F 組均高于 C 組（0.76±0.07 和 0.83±0.08 比 0.46±0.06，P<0.05），D 組高于 F 組（0.95±0.08 比0.83±0.08， P<0.05）。結果見圖 4 和 5。
圖4
Western blot 法檢測 T 淋巴細胞中 p-GR 的表達水平
圖5
各組間 p-GR 水平的比較
2.3 T 淋巴細胞 c-Jun mRNA 的表達情況
B 組和 C 組 c-Jun mRNA 的表達水平顯著高于 A 組 （1.32±0.06 和 1.57±0.09 比 0.62±0.05，P<0.05），且 C 組高于 B 組 （1.57±0.09 比 1.32±0.06，P<0.05），E 組和 F 組均低于 C 組（1.04±0.08 和 1.16±0.07 比 1.57±0.09，P<0.05），D 組低于 F 組（0.87±0.06 比 1.16±0.07，P<0.05）。結果見圖 6。
圖6
各組間 c-Jun mRNA 水平的比較
2.4 相關性分析
C 組患者血清中 25-(OH)D 水平與 T 淋巴細胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平呈負相關（r=–0.69，r=–0.65，P<0.05），與 p-GR 平呈正相關（r=0.72，P<0.05）。
3 討論
25-(OH)D 是維生素 D 在人體血液中的主要形式，其性質最穩定且含量又最多，因此血清的 25-(OH)D水平可作為維生素 D 營養狀況檢測的客觀指標。外周血清 25-(OH)D<50 nmol/L 定義為維生素 D 缺乏，25-(OH)D 50～70 nmol/L 定義為維生素 D 不足[15]。1,25-(OH)2D3 是維生素 D 在體內的主要活性形式，維生素 D 的大部分功能是通過 1,25-(OH)2D3 發揮作用[16]。哮喘患者由于容易過敏、戶外運動減少從而導致有效日光照射不足，以及反復急性發作缺氧、食欲減退等造成維生素 D 合成和吸收減少；此外，哮喘患者長期治療需使用糖皮質激素而使維生素 D 的代謝增加。因此，哮喘患者維生素 D 缺乏情況較普遍[11, 17-19]。而以上影響維生素 D 吸收、合成和代謝的因素在 SR 哮喘患者的病程中更為明顯。本研究結果也顯示，維生素 D 不足或缺乏在 SS 哮喘和 SR 哮喘患者中患病率高，而 SR 哮喘較 SS 哮喘患者更為嚴重。
JNK 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族信號系統的成員之一。AP-1 是位于 JNK 下游的關鍵信號蛋白分子。AP-1 主要由 c-Jun 和 c-Fos 家族構成，JNK 接受上游炎癥因子等刺激信號后被磷酸化激活，可進一步使核內轉錄因子 c-Jun 的氨基末端磷酸化，進而激活 c-Jun 繼而啟動并增強炎癥轉錄。有研究發現，JNK 可通過使糖皮質激素受體的絲氨酸 226 磷酸化（正常情況下糖皮質激素受體的絲氨酸 211 被磷酸化而活化）而抑制糖皮質激素反應元件的轉錄活性；哮喘患者存在 AP-1 異常活化，AP-1 與糖皮質激素受體結合形成復合物，導致糖皮質激素受體有效數目減少。此外，c-Jun 還可抑制 80% 的糖皮質激素受體啟動子活性[4, 20]。因此，JNK/AP-1 信號通路可影響糖皮質激素受體而參與糖皮質激素的抵抗。糖皮質激素是治療哮喘急性發作的重要藥物，而 T 淋巴細胞在哮喘急性發作的炎癥反應中起重要作用，同時也參與了糖皮質激素抵抗的發病機制，因此我們對急性發作期 SR 哮喘患者的 T 淋巴細胞在糖皮質激素抵抗中的機制進行研究。本研究發現，SR 哮喘患者的 T 淋巴細胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 的表達水平較 SS 哮喘和健康對照組高，而 p-GR 的表達降低。為進一步探討 JNK/AP-1 信號通路對 SR 哮喘患者 T 淋巴細胞糖皮質激素受體的影響，我們在實驗中加入 JNK 抑制劑 SP600125，結果顯示 SR 哮喘患者 T 淋巴細胞的 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平均降低，而 p-GR 的表達增加。因此，我們推測 SR 哮喘患者 T 淋巴細胞的 p-JNK 和 c-Jun 過度表達，繼而抑制了 p-GR 的表達，從而導致糖皮質激素抵抗。
有研究報道，哮喘患者的維生素 D 水平與糖皮質激素抵抗有關，而適當補充維生素 D 可改善糖皮質激素抵抗[4, 8-9, 21]。本實驗發現，SR 哮喘患者中維生素 D 缺乏患病率高；而 1,25-(OH)2D3 可降低 SR 哮喘的 T 淋巴細胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 的表達，增加 p-GR 的表達；相關分析顯示，SR 哮喘患者血清中 25-(OH)D 水平與 T 淋巴細胞 p-JNK 和 c-Jun mRNA 水平呈負相關，與 p-GR 水平呈正相關。以上結果提示 1,25-(OH)2D3 可通過抑制 SR 哮喘 T 淋巴細胞 JNK/AP-1 信號通路而促進 p-GR 的表達，這可能是維生素 D 可改善 SR 哮喘糖皮質激素抵抗機制之一。隨著研究的深入，相信維生素 D 將會為 SR 哮喘的治療提供新的思路。
