引用本文： 馬志敏, 李曉玲, 魏會強, 郝秀玲, 郭麗萍. 還原型谷胱甘肽對大鼠肺纖維化的干預作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(4): 401-405. doi: 10.7507/1671-6205.2016094 復制
肺纖維化是一種由多種病因引起的間質性肺病，病理表現為肺泡單位結構紊亂、彌漫性肺泡炎、膠原沉積、成纖維細胞灶形成以及病變位置不均[1-2]。目前肺纖維化的發病原因和致病機制未完全清晰，一般認為慢性炎癥可引發肺的損傷、促進肺纖維化的進程[3-4]。肺纖維化患者通常呈進行性發展，預后較差[5-6]。既往治療肺纖維化的主要藥物為糖皮質激素，但并不能顯著改善肺纖維化患者的生存率 [7]。有研究發現氧化/抗氧化失衡，尤其是肺泡上皮襯液中谷胱甘肽(GSH)缺乏是肺纖維化發病的重要原因[8]。因此，本研究擬通過與糖皮質激素比較，初步探討不同劑量還原型谷胱甘肽對大鼠肺纖維化的干預作用。
材料與方法
一 材料
選取清潔級健康、雄性SD大鼠共108只(均由南京君科生物工程有限公司提供)，體重(220±10) g。
二 方法
1．分組和造模：所有大鼠隨機分為6組，每組18只。除對照組外，其余5組均經氣管內注入博來霉素A5(5 mg/kg)制造肺纖維化模型。(1)對照組：氣管內注入1.25 mL/kg生理鹽水后第1 d開始腹腔注射生理鹽水1次/d；(2)模型組：經氣管內注入5 mg/kg的博來霉素A5制造肺纖維化模型[1-4]，并于造模后第1 d開始腹腔注射生理鹽水1次/d；(3)地塞米松組：建模過程同模型組，建模后第1 d開始腹腔注射溶于0.2 mL生理鹽水的地塞米松0.5 mg/kg，1次/d；(4)小劑量GSH干預組：建模過程同模型組，建模后第1 d開始給予GSH 100 mg/kg腹腔注射1次/d；(5)中劑量GSH干預組：建模過程同模型組，建模后第1 d開始給予GSH 200 mg/kg腹腔注射1次/d；(6)大劑量GSH干預組：建模過程同模型組，建模后第1 d開始給予GSH 400 mg/kg腹腔注射1次/d。
2．檢測指標和方法：造模后，將每組的18只大鼠分為3個亞組，每組6只，第7、14、28 d分別經10%水合氯醛(3.8 mL/kg)腹腔注射麻醉，在無菌條件下，剪斷大鼠腹主動、靜脈放血處死。用10%中性福爾馬林溶液將摘取的右肺中葉固定并制成石蠟切片，通過Szapiel法評估肺纖維化程度，病理學HE染色、Masson膠原染色檢測大鼠的肺泡炎和纖維化情況，按程度及范圍不同分為1、2、3、4級。肺泡炎程度：0級為無肺泡炎；1級為輕度肺泡炎，表現為單核細胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積＞全肺20%，肺泡結構正常；2級為中度肺泡炎，單核細胞浸潤面積20%~50%，近胸膜部較重；3級為重度肺泡炎，單核細胞浸潤面積＞50%，偶見肺泡腔內由單核細胞及出血造成的實變。肺纖維化程度：0級為無纖維化；1級為輕度肺纖維化，纖維化面積少于全肺20%，纖維化累及胸膜下的肺間質，肺結構紊亂；2級為中度肺纖維化，纖維化面積介于全肺的20%~50%，纖維化區域從胸膜延伸，仍屬局部性；3級為重度肺纖維化，纖維化面積＞全肺50%，肺泡融合，可見大小不等的囊氣腔。摘取大鼠右肺下葉制作肺組織勻漿，并對肺組織GSH、羥脯氨酸(HYP)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)進行測定，測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。GSH、SOD和GSH-Px濃度采用比色法進行測定。HYP濃度采用樣本堿水解法進行測定。
三 統計學處理
所有數據用均使用SPSS 19.0軟件進行處理分析，計量資料以x±s表示，GSH、HYP、SOD、GSH-Px濃度的組間比較均采用t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，肺泡炎和肺纖維化的病理半定量資料比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 肺泡炎和肺纖維化程度
模型組在各時間點的肺泡炎程度均較對照組顯著增高(P＜0.05)，在第14、28 d的肺纖維化程度顯著高于對照組(P＜0.05)。地塞米松干預組和GSH小、中劑量干預組在各時間點的肺泡炎程度均較對照組顯著增高(P＜0.05)；GSH大劑量干預組肺泡炎程度在第7 d較對照組顯著增高，在第14 d和28 d與對照組無顯著差異(P＞0.05)。地塞米松干預組和GSH干預組在第7 d和14 d時肺纖維化程度與對照組和模型組差異無統計學意義(P＞0.05)；在第28 d時肺纖維化程度較對照組顯著增加，較模型組顯著降低(P＜0.05)。GSH不同劑量干預組與地塞米松干預組比較，肺泡炎和肺纖維化程度稍降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見圖 1、2和表 1。
圖1
模型組和對照組肺組織病理檢查像(HE ×400) a．對照組；b．第7 d模型組；c．第14 d模型組；d．第28 d模型組
圖2
第7 d各組肺組織病理檢查像(Masson ×400) a．對照組；b．模型組；c．地塞米松干預組；d．小劑量GSH干預組；e．中劑量GSH干預組；f．大劑量GSH干預組
表1
各組大鼠肺泡炎和肺纖維化程度比較
二 大鼠肺細胞勻漿GSH、HYP、SOD、GSH-Px水平變化
第7 d時模型組肺組織GSH、SOD和GSH-Px水平顯著低于對照組(P＜0.05)，HYP含量顯著高于對照組；第14 d和28 d時模型組GSH含量與對照組無顯著差異，SOD和GSH-Px水平顯著低于對照組，HYP含量顯著高于對照組。第7 d時，地塞米松干預組和小劑量GSH干預組肺組織GSH水平較模型組顯著提高(P＜0.05)，但仍顯著低于對照組(P＜0.05)，第14 d和28 d時與對照組無顯著差異(P＞0.05)；中、大劑量GSH干預組在第7 d時肺組織GSH水平較模型組顯著提高(P＜0.05)，GSH大劑量干預組在第7 d時的GSH水平顯著高于地塞米松干預組(P＜0.05)。地塞米松干預組和GSH干預組各時間點肺組織SOD和GSH-Px水平均較模型組顯著提高(P＜0.05)，與對照組無顯著差異(P＞0.05)，地塞米松干預租與GSH干預組間差異無統計學意義(P＞0.05)。GSH干預組第7 d時的肺組織HYP水平較模型組顯著降低(P＜0.05)，與對照組無顯著差異(P＞0.05)；大劑量GSH干預組第28 d時的HYP水平較模型組顯著降低(P＜0.05)，顯著高于對照組(P＜0.05)；其他劑量或時間點GSH干預組和地塞米松干預組HYP水平與模型組差異無統計學意義(P＞0.05)，較對照組顯著增加(P＜0.05)。結果見表 2。
表2
大鼠肺細胞勻漿GSH和HYP含量測定(x±s,n=6)
討論
肺纖維化主要是以肺泡炎、肺泡上皮受損、膠原異常聚集為特征的慢性炎癥疾病。研究發現高氧肺損傷中的慢性肺損傷會導致肺纖維化，氧自由基釋放導致機體的氧化和抗氧化平衡被打破[1, 4]，降低機體抗氧化能力，引起肺泡上皮胞和血管內皮細胞損傷，從而導致肺部炎癥反應、異常修復的發生，如不及時糾正，則機體將發生肺纖維化[5, 7-8]。GSH是機體內重要的還原劑，所以提高機體抗氧化能力可能成為治療肺纖維化的一種途徑。
在本研究中，造模后第7 d和14 d地塞米松和各劑量GSH干預組與模型組比較，肺泡炎程度顯著減輕(P＜0.05)；在第28 d時，地塞米松干預組和小劑量GSH干預組的纖維化程度較模型組減輕，但兩者間差異無統計學意義(P＞0.05)。造模第28 d 時地塞米松干預組和GSH干預組肺纖維化程度顯著減輕，這提示400 mg/kg的GSH比100 mg/kg和200 mg/kg的GSH具有更強的氧化作用，但是高劑量的GSH相比激素治療并無顯著優勢，這與呂靜[9]、柴文戍等[3]的研究結果一致。
HYP是膠原特有的氨基酸，在膠原蛋白中具有較高的含量，因此可以通過檢測HYP含量反映肺纖維化情況[8]。劉瑞等[4]發現HYP可作為博來霉素誘導的肺纖維化的一個重要的評價指標。本研究中，模型可靠性及GSH干預作用都可通過HYP含量來評價。大鼠肺組織HYP含量經測定，7~28 d時，模型組、地塞米松干預組、GSH干預組肺組織HYP含量顯著高于對照組，各干預組的HYP含量相比模型組均顯著降低。14 d時中劑量GSH干預組與高劑量GSH干預組相比于地塞米松組，HYP含量顯著降低。這提示GSH和激素均可治療肺纖維化，高劑量的GSH在短時間內可以很快降低肺纖維化，但隨著時間延長，這種效果降低。與對照組比較，模型組大鼠肺組織勻漿液中SOD及GSH-Px水平顯著降低，給予GSH治療后SOD及GSH-Px 水平與模型組比較顯著增加。這提示GSH是機體內重要的還原劑，因此通過提高機體抗氧化能力可以作為治療肺纖維化的可能。
綜上所述，GSH可以為臨床治療肺纖維化提供參考，但是GSH對于肺纖維化機制和劑量的選擇還需進一步研究。
肺纖維化是一種由多種病因引起的間質性肺病，病理表現為肺泡單位結構紊亂、彌漫性肺泡炎、膠原沉積、成纖維細胞灶形成以及病變位置不均[1-2]。目前肺纖維化的發病原因和致病機制未完全清晰，一般認為慢性炎癥可引發肺的損傷、促進肺纖維化的進程[3-4]。肺纖維化患者通常呈進行性發展，預后較差[5-6]。既往治療肺纖維化的主要藥物為糖皮質激素，但并不能顯著改善肺纖維化患者的生存率 [7]。有研究發現氧化/抗氧化失衡，尤其是肺泡上皮襯液中谷胱甘肽(GSH)缺乏是肺纖維化發病的重要原因[8]。因此，本研究擬通過與糖皮質激素比較，初步探討不同劑量還原型谷胱甘肽對大鼠肺纖維化的干預作用。
材料與方法
一 材料
選取清潔級健康、雄性SD大鼠共108只(均由南京君科生物工程有限公司提供)，體重(220±10) g。
二 方法
1．分組和造模：所有大鼠隨機分為6組，每組18只。除對照組外，其余5組均經氣管內注入博來霉素A5(5 mg/kg)制造肺纖維化模型。(1)對照組：氣管內注入1.25 mL/kg生理鹽水后第1 d開始腹腔注射生理鹽水1次/d；(2)模型組：經氣管內注入5 mg/kg的博來霉素A5制造肺纖維化模型[1-4]，并于造模后第1 d開始腹腔注射生理鹽水1次/d；(3)地塞米松組：建模過程同模型組，建模后第1 d開始腹腔注射溶于0.2 mL生理鹽水的地塞米松0.5 mg/kg，1次/d；(4)小劑量GSH干預組：建模過程同模型組，建模后第1 d開始給予GSH 100 mg/kg腹腔注射1次/d；(5)中劑量GSH干預組：建模過程同模型組，建模后第1 d開始給予GSH 200 mg/kg腹腔注射1次/d；(6)大劑量GSH干預組：建模過程同模型組，建模后第1 d開始給予GSH 400 mg/kg腹腔注射1次/d。
2．檢測指標和方法：造模后，將每組的18只大鼠分為3個亞組，每組6只，第7、14、28 d分別經10%水合氯醛(3.8 mL/kg)腹腔注射麻醉，在無菌條件下，剪斷大鼠腹主動、靜脈放血處死。用10%中性福爾馬林溶液將摘取的右肺中葉固定并制成石蠟切片，通過Szapiel法評估肺纖維化程度，病理學HE染色、Masson膠原染色檢測大鼠的肺泡炎和纖維化情況，按程度及范圍不同分為1、2、3、4級。肺泡炎程度：0級為無肺泡炎；1級為輕度肺泡炎，表現為單核細胞浸潤使肺泡隔增寬，僅限于局部和近胸膜部，面積＞全肺20%，肺泡結構正常；2級為中度肺泡炎，單核細胞浸潤面積20%~50%，近胸膜部較重；3級為重度肺泡炎，單核細胞浸潤面積＞50%，偶見肺泡腔內由單核細胞及出血造成的實變。肺纖維化程度：0級為無纖維化；1級為輕度肺纖維化，纖維化面積少于全肺20%，纖維化累及胸膜下的肺間質，肺結構紊亂；2級為中度肺纖維化，纖維化面積介于全肺的20%~50%，纖維化區域從胸膜延伸，仍屬局部性；3級為重度肺纖維化，纖維化面積＞全肺50%，肺泡融合，可見大小不等的囊氣腔。摘取大鼠右肺下葉制作肺組織勻漿，并對肺組織GSH、羥脯氨酸(HYP)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)進行測定，測定試劑盒均購于南京建成生物工程研究所。GSH、SOD和GSH-Px濃度采用比色法進行測定。HYP濃度采用樣本堿水解法進行測定。
三 統計學處理
所有數據用均使用SPSS 19.0軟件進行處理分析，計量資料以x±s表示，GSH、HYP、SOD、GSH-Px濃度的組間比較均采用t檢驗；計數資料以例數或百分比表示，肺泡炎和肺纖維化的病理半定量資料比較采用秩和檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 肺泡炎和肺纖維化程度
模型組在各時間點的肺泡炎程度均較對照組顯著增高(P＜0.05)，在第14、28 d的肺纖維化程度顯著高于對照組(P＜0.05)。地塞米松干預組和GSH小、中劑量干預組在各時間點的肺泡炎程度均較對照組顯著增高(P＜0.05)；GSH大劑量干預組肺泡炎程度在第7 d較對照組顯著增高，在第14 d和28 d與對照組無顯著差異(P＞0.05)。地塞米松干預組和GSH干預組在第7 d和14 d時肺纖維化程度與對照組和模型組差異無統計學意義(P＞0.05)；在第28 d時肺纖維化程度較對照組顯著增加，較模型組顯著降低(P＜0.05)。GSH不同劑量干預組與地塞米松干預組比較，肺泡炎和肺纖維化程度稍降低，但差異無統計學意義(P＞0.05)。結果見圖 1、2和表 1。
圖1
模型組和對照組肺組織病理檢查像(HE ×400) a．對照組；b．第7 d模型組；c．第14 d模型組；d．第28 d模型組
圖2
第7 d各組肺組織病理檢查像(Masson ×400) a．對照組；b．模型組；c．地塞米松干預組；d．小劑量GSH干預組；e．中劑量GSH干預組；f．大劑量GSH干預組
表1
各組大鼠肺泡炎和肺纖維化程度比較
二 大鼠肺細胞勻漿GSH、HYP、SOD、GSH-Px水平變化
第7 d時模型組肺組織GSH、SOD和GSH-Px水平顯著低于對照組(P＜0.05)，HYP含量顯著高于對照組；第14 d和28 d時模型組GSH含量與對照組無顯著差異，SOD和GSH-Px水平顯著低于對照組，HYP含量顯著高于對照組。第7 d時，地塞米松干預組和小劑量GSH干預組肺組織GSH水平較模型組顯著提高(P＜0.05)，但仍顯著低于對照組(P＜0.05)，第14 d和28 d時與對照組無顯著差異(P＞0.05)；中、大劑量GSH干預組在第7 d時肺組織GSH水平較模型組顯著提高(P＜0.05)，GSH大劑量干預組在第7 d時的GSH水平顯著高于地塞米松干預組(P＜0.05)。地塞米松干預組和GSH干預組各時間點肺組織SOD和GSH-Px水平均較模型組顯著提高(P＜0.05)，與對照組無顯著差異(P＞0.05)，地塞米松干預租與GSH干預組間差異無統計學意義(P＞0.05)。GSH干預組第7 d時的肺組織HYP水平較模型組顯著降低(P＜0.05)，與對照組無顯著差異(P＞0.05)；大劑量GSH干預組第28 d時的HYP水平較模型組顯著降低(P＜0.05)，顯著高于對照組(P＜0.05)；其他劑量或時間點GSH干預組和地塞米松干預組HYP水平與模型組差異無統計學意義(P＞0.05)，較對照組顯著增加(P＜0.05)。結果見表 2。
表2
大鼠肺細胞勻漿GSH和HYP含量測定(x±s,n=6)
討論
肺纖維化主要是以肺泡炎、肺泡上皮受損、膠原異常聚集為特征的慢性炎癥疾病。研究發現高氧肺損傷中的慢性肺損傷會導致肺纖維化，氧自由基釋放導致機體的氧化和抗氧化平衡被打破[1, 4]，降低機體抗氧化能力，引起肺泡上皮胞和血管內皮細胞損傷，從而導致肺部炎癥反應、異常修復的發生，如不及時糾正，則機體將發生肺纖維化[5, 7-8]。GSH是機體內重要的還原劑，所以提高機體抗氧化能力可能成為治療肺纖維化的一種途徑。
在本研究中，造模后第7 d和14 d地塞米松和各劑量GSH干預組與模型組比較，肺泡炎程度顯著減輕(P＜0.05)；在第28 d時，地塞米松干預組和小劑量GSH干預組的纖維化程度較模型組減輕，但兩者間差異無統計學意義(P＞0.05)。造模第28 d 時地塞米松干預組和GSH干預組肺纖維化程度顯著減輕，這提示400 mg/kg的GSH比100 mg/kg和200 mg/kg的GSH具有更強的氧化作用，但是高劑量的GSH相比激素治療并無顯著優勢，這與呂靜[9]、柴文戍等[3]的研究結果一致。
HYP是膠原特有的氨基酸，在膠原蛋白中具有較高的含量，因此可以通過檢測HYP含量反映肺纖維化情況[8]。劉瑞等[4]發現HYP可作為博來霉素誘導的肺纖維化的一個重要的評價指標。本研究中，模型可靠性及GSH干預作用都可通過HYP含量來評價。大鼠肺組織HYP含量經測定，7~28 d時，模型組、地塞米松干預組、GSH干預組肺組織HYP含量顯著高于對照組，各干預組的HYP含量相比模型組均顯著降低。14 d時中劑量GSH干預組與高劑量GSH干預組相比于地塞米松組，HYP含量顯著降低。這提示GSH和激素均可治療肺纖維化，高劑量的GSH在短時間內可以很快降低肺纖維化，但隨著時間延長，這種效果降低。與對照組比較，模型組大鼠肺組織勻漿液中SOD及GSH-Px水平顯著降低，給予GSH治療后SOD及GSH-Px 水平與模型組比較顯著增加。這提示GSH是機體內重要的還原劑，因此通過提高機體抗氧化能力可以作為治療肺纖維化的可能。
綜上所述，GSH可以為臨床治療肺纖維化提供參考，但是GSH對于肺纖維化機制和劑量的選擇還需進一步研究。
