引用本文： 孫青峰, 李理, 張安兵, 黃文杰. 應用基因芯片篩選轉染FOXO1后A549細胞差異表達基因. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(4): 368-373. doi: 10.7507/1671-6205.2016087 復制
急性肺損傷(ALI)及其更嚴重階段急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床危重癥發生急性呼吸衰竭的主要原因，病死率高達50%[1]。ALI發病機制錯綜復雜，迄今為止尚未闡明清楚，其實質是過度放大的炎癥反應及氧化應激反應共同作用的結果。叉頭蛋白O1(FOXO1)是叉頭蛋白(Forkhead box protein，FOX)蛋白家族在哺乳動物中的一個亞型，可直接參與基因轉錄的調節以及協同其他轉錄因子進行轉錄調節[2]，在哺乳動物細胞的凋亡、氧化應激、細胞周期阻滯、DNA損傷/修復、腫瘤發生及糖代謝調節中起重要作用。關于FOXO1基因在ALI氧化應激過程中作用的研究不多。研究發現FOXO1高表達時，細胞的生長受到抑制，當FOXO1從細胞漿轉位至細胞核時，將促進細胞的凋亡[3-5]。因此，本研究以腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激Ⅱ型肺泡上皮細胞來源的A549細胞，模擬ALI時的細胞炎癥損傷過程；同時，運用基因芯片技術篩選轉染FOXO1基因后A549細胞差異表達基因并進行分析，深入探討FOXO1在ALI肺泡上皮細胞凋亡中的作用。
材料與方法
一 材料
A549細胞由廣州軍區總醫院醫學實驗科細胞庫提供，胎牛血清購于美國Gibco公司，RPMI-1640培養液購于美國Theomo公司，胰蛋白酶購于美國Life公司，重組人TNF-α購于美國Pepro Tech公司，GV230-FOXO1真核表達載體和GV230空載體由吉凱基因公司提供，轉染試劑脂質體lipofectamine?LTX&Plus Reagent購于美國Invitrogen公司，總RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司。基因芯片為A10502-1-2 RiboArrayTM Human Apoptosis Array 1×2K購自廣州銳博公司。
二 方法
1．實驗分組：細胞分為對照組、TNF-α組、FOXO1質粒+TNF-α組、陰性對照組質粒+TNF-α組。FOXO1質粒+TNF-α組、陰性對照組質粒+TNF-α組分別轉染相應質粒(轉染方法詳見下文)，轉染10 h后，這兩組和TNF-α組均采用不含血清10 ng/mL TNF-α培養基刺激24 h，收集細胞。
2．真核表達載體與細胞轉染：設計并合成FOXO1基因編碼區特異性對寡聚核苷酸引物(上游5′-TCCGCTCGAGATGGCCGAGGCGCCTCAGGT-3′，下游5′-ATGGGGTACCGTGCCTGACACCCAGCTATG TG-3′)。本實驗所用載體為GV230(吉凱基因公司提供)，其元件順序：CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，克隆位點為XhoⅠ和 KpnⅠ，真核抗性為Kanamycin，見圖 1。以A549細胞cDNA作為模板，放入PCR擴增儀中進行擴增。0.9%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結果。擴增FOXO1編碼基因到真核表達載體GV230-FOXO1，見圖 2。用Lipofectamine?LTX&Plus Reagent轉染試劑將2 μg GV230-FOXO1及GV230空載體分別轉染35 mm平皿A549細胞，轉染24 h后熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，見圖 3。48 h后收獲細胞。
圖1
GV230載體
圖2
GV230-FOXO1
圖3
轉染質粒及空載體24 h后熒光顯微鏡照片(×10)
3．總RNA提取及mRNA純化：Trizol試劑一步法提取正常A549細胞、TNF-α誘導細胞以及轉染GV230-FOXO1及GV230空載體的TNF-α誘導A549細胞的總RNA，分別標記為對照組、TNF-α組、FOXO1質粒+TNF-α組、陰性對照質粒+TNF-α組。FOXO1質粒+TNF-α組和陰性對照質粒+TNF-α組樣品經分光光度計檢測吸光度A值，并行熱穩定實驗，于-20 ℃和170 ℃保存1 h后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測28S、18S條帶變化。純化mRNA并行電泳檢測。RNA質檢合格后進行分裝-80 ℃保存。
4．芯片雜交及洗滌：取0.5~2 μg的Total RNA使用ULS標記法標記上Cy3，通過紫外分光光度計測得A260、A550，根據實驗報告所列公式計算標記率DOL(DOL最佳范圍是1.0~3.6)；進行預雜交，芯片在無菌去離子水中65 ℃孵育10 min，換預雜交液37 ℃孵育1 h；將Cy3標記的RNA全部用于配置雜交液，雜交液95 ℃變性3 min，冰上孵育20 s；將芯片預雜交液吸出，換雜交液，37 ℃雜交16 h；芯片取出依次用6×SSPET，3×SSPET，0.5×SSPET，0.5×SSPET洗1遍，去除非特異性雜交背景；加顯影液及蓋玻片于雜交區域，進行掃描；掃描后所得圖片提取數據，進行生物信息學分析。
5．檢測與分析：應用廣州市銳博生物科技有限公司的GenePix4000B激光掃描儀掃描芯片。用預先選定的內參照基因對Cy3和Cy5的原始提取信號進行均衡和修正。采用50% scaling的校正方法，分析Cy3、Cy5兩種熒光信號的強度，計算Cy5/Cy3比值。陽性結果判斷：Cy5/Cy3＞2.0，紅色熒光，顯示表達增強；Cy5/Cy3＜0.5，為綠色熒光，顯示表達減弱。
結果
一 FOXO1表達載體的構建
真核表達質粒GV230-FOXO1經過限制性內切酶作圖分析核苷酸序列的測定，證實含有完整的開放讀碼框，序列準確無誤。
二 總RNA及mRNA的定性、定量分析
實驗組和對照組總RNA的吸光度比值A260/A280分別為2.030和2.015，熱穩定實驗70 ℃保溫1 h與-20 ℃ 1 h電泳條帶比較，顯示28S條帶無明顯降解，電泳結果證實已抽提高純度的總RNA。mRNA主要集中于0.9~4.0 kb的連續條帶。
三 芯片雜交體系驗證及結果分析
RNA質量控制(RNA QC)驗證結果通過，見圖 4和表 1。
圖4
RNA質量控制結果2
表1
RNA質量控制結果1
對于某一點的兩種疊加熒光信號，如果Cy3信號強，該點多顯綠色(下調趨勢)；如果Cy5信號強，該點多顯紅色(上調趨勢)；如果強度相似，即顯黃色。結果見圖 5。
圖5
雙色熒光標記疊加圖
經基因芯片篩選轉染FOXO1基因后A549細胞差異表達基因554個，其中上調基因317個，下調基因237個。對芯片結果進行功能分類，發現差異基因涉及細胞增殖、分化、凋亡和信號轉導、蛋白酶活性等方面。部分差異表達基因見表 2和表 3。
表2
部分表達顯著增強的基因
表3
部分表達顯著減弱的基因
討論
以TNF-α為代表的細胞因子大量釋放為特征的全身過度炎癥反應是ALI的主要發病基礎。臨床研究及動物實驗研究發現ALI患者肺泡灌洗液和小鼠血清中TNF-α明顯升高，ALI的嚴重程度與TNF-α的濃度呈正相關[6-7]。本實驗室袁偉鋒等[8]通過脂多糖(LPS)小鼠氣管內霧化模擬建立ALI動物模型，并預先在小鼠腹腔內注射依那西普以中和過量的TNF-α，結果發現小鼠肺組織細胞損傷減輕，氧化應激水平及細胞炎癥因子顯著降低，提示TNF-α是ALI發病過程中的關鍵因子。本實驗室黃建華等[9]通過研究肺泡Ⅱ型上皮細胞A549對TNF-α和LPS刺激的反應效果來探討ALI體外細胞模型最佳造模方法，實驗結果證明TNF-α可以有效刺激A549產生過度炎癥反應，而LPS不能刺激A549細胞產生炎癥損傷。因此，本實驗使用TNF-α代替LPS刺激建立ALI體外細胞模型。
直接參與基因轉錄調節以及協同其他轉錄因子進行轉錄調節的轉錄因子，在哺乳動物細胞的凋亡、氧化應激、細胞周期阻滯、DNA損傷/修復、腫瘤發生及糖代謝調節中起著重要作用。有研究證實予以TNF-α刺激血管外膜細胞，FOXO1的表達明顯增加，同時細胞凋亡增加[10]，提示FOXO1可能參與了TNF-α誘導的細胞凋亡過程。本實驗室李理等[11]通過轉染FOXO1真核表達載體入ALI細胞炎癥模型，研究發現細胞凋亡水平上調，細胞內促凋亡蛋白Bim表達增多，說明FOXO1在ALI的炎癥細胞中可能起到促進細胞凋亡的作用。這與在研究原發性縱隔B淋巴細胞瘤某些細胞表型，增強FOXO1的表達可引起細胞生長停滯及凋亡[12]相一致。但其具體的作用機制尚不清楚，有待進一步探討。
基因芯片技術是在分子生物學、人類基因組計劃的基礎上產生和發展起來的，擁有高度并行性、高通量、微型化等顯著特點。目前，基因芯片技術可用于檢測炎癥氧化、應激相關基因表達等，是ALI分子水平研究的重要工具。該研究建立于FOXO1基因在炎癥狀態下A549細胞高表達的基礎上，應用人類表達譜芯片成功篩選出FOXO1轉染TNF-α誘導A549細胞后差異表達的基因，RNA QC驗證芯片結果可靠。基因芯片篩選出表達差異基因共554個，其中上調基因317個，下調基因237個。這些差異表達基因在細胞增殖、分化、凋亡以及細胞粘附和細胞周期等細胞生理過程中發揮重要調控作用，參與細胞的信號轉導、侵襲和轉移等過程。
表達上調的基因中，CDK1、PLK5、CASP1、FAS、BAD等與細胞周期調控、增殖、凋亡等有密切關系。周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK1是細胞周期調控中的重要因子，Jacquot等[13]通過上調CDK1的表達發現可導致非小細胞肺癌細胞株增殖抑制。PLK5是PLK激酶家族成員，可抑制神經細胞的分化與膠質母細胞瘤的形成[14]。CASP1也可稱為白細胞介素1β(IL-1β)轉換酶，通過促進炎癥因子的加工和釋放而調控細胞的炎癥反應，同時還能介導程序性細胞凋亡[15]。死亡受體FAS是腫瘤壞死因子受體家族重要成員，經FAS/FASL通路轉導死亡信號誘導細胞凋亡[16]。BAD是Bcl-2家族中與Bcl-2和Bcl-xL相關的促凋亡基因，主要通過線粒體途徑促進細胞凋亡[17]。
表達下調的基因中，BCL2、CAT、SOD1、APC、CDK5等與細胞凋亡、抗氧化、信號轉導、增殖等密切相關。BCL2作為BCL2家族的主要代表，主要存在于線粒體外膜和胞質中，在外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑中均有重要作用。CAT基因編碼的蛋白是過氧化氫酶，是人體內很重要的一種抗氧化酶，可通過催化超氧陰離子自由基的自身氧化還原反應，清除氧自由基，避免損傷機體組織細胞。SOD1是超氧化物歧化酶SOD家族的成員之一，是SOD的主要形式，是生物體內重要的抗氧化酶。腫瘤抑制基因APC是WNT信號轉導組分，可調節細胞增殖、遷移等[18]。細胞周期素依賴蛋白激酶CDK5作為一種多功能激酶，其主要功能是參與神經細胞生長發育和信號傳導調控[19]。
與其他研究方法相比，應用基因芯片技術可以快速準確地獲取增強FOXO1表達后TNF-α誘導的A549細胞中的差異表達基因的信息，從而預測這些基因間的相互關系及功能，以及與FOXO1基因的調控關系。然而基因芯片的結果局限在基因的轉錄水平變化，不具有廣泛性。
綜上所述，本研究通過體外模擬建立ALI細胞炎癥性損傷模型，并增強FOXO1基因的表達，利用基因芯片技術獲取了差異表達基因，并分析了許多FOXO1可能作用的候選基因作為預測FOXO1在ALI細胞炎癥反應中發生作用的靶點，為深入探討FOXO1在ALI中的作用機制提供了線索。
急性肺損傷(ALI)及其更嚴重階段急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是臨床危重癥發生急性呼吸衰竭的主要原因，病死率高達50%[1]。ALI發病機制錯綜復雜，迄今為止尚未闡明清楚，其實質是過度放大的炎癥反應及氧化應激反應共同作用的結果。叉頭蛋白O1(FOXO1)是叉頭蛋白(Forkhead box protein，FOX)蛋白家族在哺乳動物中的一個亞型，可直接參與基因轉錄的調節以及協同其他轉錄因子進行轉錄調節[2]，在哺乳動物細胞的凋亡、氧化應激、細胞周期阻滯、DNA損傷/修復、腫瘤發生及糖代謝調節中起重要作用。關于FOXO1基因在ALI氧化應激過程中作用的研究不多。研究發現FOXO1高表達時，細胞的生長受到抑制，當FOXO1從細胞漿轉位至細胞核時，將促進細胞的凋亡[3-5]。因此，本研究以腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激Ⅱ型肺泡上皮細胞來源的A549細胞，模擬ALI時的細胞炎癥損傷過程；同時，運用基因芯片技術篩選轉染FOXO1基因后A549細胞差異表達基因并進行分析，深入探討FOXO1在ALI肺泡上皮細胞凋亡中的作用。
材料與方法
一 材料
A549細胞由廣州軍區總醫院醫學實驗科細胞庫提供，胎牛血清購于美國Gibco公司，RPMI-1640培養液購于美國Theomo公司，胰蛋白酶購于美國Life公司，重組人TNF-α購于美國Pepro Tech公司，GV230-FOXO1真核表達載體和GV230空載體由吉凱基因公司提供，轉染試劑脂質體lipofectamine?LTX&Plus Reagent購于美國Invitrogen公司，總RNA提取試劑Trizol購于美國Invitrogen公司。基因芯片為A10502-1-2 RiboArrayTM Human Apoptosis Array 1×2K購自廣州銳博公司。
二 方法
1．實驗分組：細胞分為對照組、TNF-α組、FOXO1質粒+TNF-α組、陰性對照組質粒+TNF-α組。FOXO1質粒+TNF-α組、陰性對照組質粒+TNF-α組分別轉染相應質粒(轉染方法詳見下文)，轉染10 h后，這兩組和TNF-α組均采用不含血清10 ng/mL TNF-α培養基刺激24 h，收集細胞。
2．真核表達載體與細胞轉染：設計并合成FOXO1基因編碼區特異性對寡聚核苷酸引物(上游5′-TCCGCTCGAGATGGCCGAGGCGCCTCAGGT-3′，下游5′-ATGGGGTACCGTGCCTGACACCCAGCTATG TG-3′)。本實驗所用載體為GV230(吉凱基因公司提供)，其元件順序：CMV-MCS-EGFP-SV40-Neomycin，克隆位點為XhoⅠ和 KpnⅠ，真核抗性為Kanamycin，見圖 1。以A549細胞cDNA作為模板，放入PCR擴增儀中進行擴增。0.9%瓊脂糖凝膠電泳鑒定擴增結果。擴增FOXO1編碼基因到真核表達載體GV230-FOXO1，見圖 2。用Lipofectamine?LTX&Plus Reagent轉染試劑將2 μg GV230-FOXO1及GV230空載體分別轉染35 mm平皿A549細胞，轉染24 h后熒光顯微鏡下觀察細胞轉染效率，見圖 3。48 h后收獲細胞。
圖1
GV230載體
圖2
GV230-FOXO1
圖3
轉染質粒及空載體24 h后熒光顯微鏡照片(×10)
3．總RNA提取及mRNA純化：Trizol試劑一步法提取正常A549細胞、TNF-α誘導細胞以及轉染GV230-FOXO1及GV230空載體的TNF-α誘導A549細胞的總RNA，分別標記為對照組、TNF-α組、FOXO1質粒+TNF-α組、陰性對照質粒+TNF-α組。FOXO1質粒+TNF-α組和陰性對照質粒+TNF-α組樣品經分光光度計檢測吸光度A值，并行熱穩定實驗，于-20 ℃和170 ℃保存1 h后，經瓊脂糖凝膠電泳檢測28S、18S條帶變化。純化mRNA并行電泳檢測。RNA質檢合格后進行分裝-80 ℃保存。
4．芯片雜交及洗滌：取0.5~2 μg的Total RNA使用ULS標記法標記上Cy3，通過紫外分光光度計測得A260、A550，根據實驗報告所列公式計算標記率DOL(DOL最佳范圍是1.0~3.6)；進行預雜交，芯片在無菌去離子水中65 ℃孵育10 min，換預雜交液37 ℃孵育1 h；將Cy3標記的RNA全部用于配置雜交液，雜交液95 ℃變性3 min，冰上孵育20 s；將芯片預雜交液吸出，換雜交液，37 ℃雜交16 h；芯片取出依次用6×SSPET，3×SSPET，0.5×SSPET，0.5×SSPET洗1遍，去除非特異性雜交背景；加顯影液及蓋玻片于雜交區域，進行掃描；掃描后所得圖片提取數據，進行生物信息學分析。
5．檢測與分析：應用廣州市銳博生物科技有限公司的GenePix4000B激光掃描儀掃描芯片。用預先選定的內參照基因對Cy3和Cy5的原始提取信號進行均衡和修正。采用50% scaling的校正方法，分析Cy3、Cy5兩種熒光信號的強度，計算Cy5/Cy3比值。陽性結果判斷：Cy5/Cy3＞2.0，紅色熒光，顯示表達增強；Cy5/Cy3＜0.5，為綠色熒光，顯示表達減弱。
結果
一 FOXO1表達載體的構建
真核表達質粒GV230-FOXO1經過限制性內切酶作圖分析核苷酸序列的測定，證實含有完整的開放讀碼框，序列準確無誤。
二 總RNA及mRNA的定性、定量分析
實驗組和對照組總RNA的吸光度比值A260/A280分別為2.030和2.015，熱穩定實驗70 ℃保溫1 h與-20 ℃ 1 h電泳條帶比較，顯示28S條帶無明顯降解，電泳結果證實已抽提高純度的總RNA。mRNA主要集中于0.9~4.0 kb的連續條帶。
三 芯片雜交體系驗證及結果分析
RNA質量控制(RNA QC)驗證結果通過，見圖 4和表 1。
圖4
RNA質量控制結果2
表1
RNA質量控制結果1
對于某一點的兩種疊加熒光信號，如果Cy3信號強，該點多顯綠色(下調趨勢)；如果Cy5信號強，該點多顯紅色(上調趨勢)；如果強度相似，即顯黃色。結果見圖 5。
圖5
雙色熒光標記疊加圖
經基因芯片篩選轉染FOXO1基因后A549細胞差異表達基因554個，其中上調基因317個，下調基因237個。對芯片結果進行功能分類，發現差異基因涉及細胞增殖、分化、凋亡和信號轉導、蛋白酶活性等方面。部分差異表達基因見表 2和表 3。
表2
部分表達顯著增強的基因
表3
部分表達顯著減弱的基因
討論
以TNF-α為代表的細胞因子大量釋放為特征的全身過度炎癥反應是ALI的主要發病基礎。臨床研究及動物實驗研究發現ALI患者肺泡灌洗液和小鼠血清中TNF-α明顯升高，ALI的嚴重程度與TNF-α的濃度呈正相關[6-7]。本實驗室袁偉鋒等[8]通過脂多糖(LPS)小鼠氣管內霧化模擬建立ALI動物模型，并預先在小鼠腹腔內注射依那西普以中和過量的TNF-α，結果發現小鼠肺組織細胞損傷減輕，氧化應激水平及細胞炎癥因子顯著降低，提示TNF-α是ALI發病過程中的關鍵因子。本實驗室黃建華等[9]通過研究肺泡Ⅱ型上皮細胞A549對TNF-α和LPS刺激的反應效果來探討ALI體外細胞模型最佳造模方法，實驗結果證明TNF-α可以有效刺激A549產生過度炎癥反應，而LPS不能刺激A549細胞產生炎癥損傷。因此，本實驗使用TNF-α代替LPS刺激建立ALI體外細胞模型。
直接參與基因轉錄調節以及協同其他轉錄因子進行轉錄調節的轉錄因子，在哺乳動物細胞的凋亡、氧化應激、細胞周期阻滯、DNA損傷/修復、腫瘤發生及糖代謝調節中起著重要作用。有研究證實予以TNF-α刺激血管外膜細胞，FOXO1的表達明顯增加，同時細胞凋亡增加[10]，提示FOXO1可能參與了TNF-α誘導的細胞凋亡過程。本實驗室李理等[11]通過轉染FOXO1真核表達載體入ALI細胞炎癥模型，研究發現細胞凋亡水平上調，細胞內促凋亡蛋白Bim表達增多，說明FOXO1在ALI的炎癥細胞中可能起到促進細胞凋亡的作用。這與在研究原發性縱隔B淋巴細胞瘤某些細胞表型，增強FOXO1的表達可引起細胞生長停滯及凋亡[12]相一致。但其具體的作用機制尚不清楚，有待進一步探討。
基因芯片技術是在分子生物學、人類基因組計劃的基礎上產生和發展起來的，擁有高度并行性、高通量、微型化等顯著特點。目前，基因芯片技術可用于檢測炎癥氧化、應激相關基因表達等，是ALI分子水平研究的重要工具。該研究建立于FOXO1基因在炎癥狀態下A549細胞高表達的基礎上，應用人類表達譜芯片成功篩選出FOXO1轉染TNF-α誘導A549細胞后差異表達的基因，RNA QC驗證芯片結果可靠。基因芯片篩選出表達差異基因共554個，其中上調基因317個，下調基因237個。這些差異表達基因在細胞增殖、分化、凋亡以及細胞粘附和細胞周期等細胞生理過程中發揮重要調控作用，參與細胞的信號轉導、侵襲和轉移等過程。
表達上調的基因中，CDK1、PLK5、CASP1、FAS、BAD等與細胞周期調控、增殖、凋亡等有密切關系。周期蛋白依賴性蛋白激酶CDK1是細胞周期調控中的重要因子，Jacquot等[13]通過上調CDK1的表達發現可導致非小細胞肺癌細胞株增殖抑制。PLK5是PLK激酶家族成員，可抑制神經細胞的分化與膠質母細胞瘤的形成[14]。CASP1也可稱為白細胞介素1β(IL-1β)轉換酶，通過促進炎癥因子的加工和釋放而調控細胞的炎癥反應，同時還能介導程序性細胞凋亡[15]。死亡受體FAS是腫瘤壞死因子受體家族重要成員，經FAS/FASL通路轉導死亡信號誘導細胞凋亡[16]。BAD是Bcl-2家族中與Bcl-2和Bcl-xL相關的促凋亡基因，主要通過線粒體途徑促進細胞凋亡[17]。
表達下調的基因中，BCL2、CAT、SOD1、APC、CDK5等與細胞凋亡、抗氧化、信號轉導、增殖等密切相關。BCL2作為BCL2家族的主要代表，主要存在于線粒體外膜和胞質中，在外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑中均有重要作用。CAT基因編碼的蛋白是過氧化氫酶，是人體內很重要的一種抗氧化酶，可通過催化超氧陰離子自由基的自身氧化還原反應，清除氧自由基，避免損傷機體組織細胞。SOD1是超氧化物歧化酶SOD家族的成員之一，是SOD的主要形式，是生物體內重要的抗氧化酶。腫瘤抑制基因APC是WNT信號轉導組分，可調節細胞增殖、遷移等[18]。細胞周期素依賴蛋白激酶CDK5作為一種多功能激酶，其主要功能是參與神經細胞生長發育和信號傳導調控[19]。
與其他研究方法相比，應用基因芯片技術可以快速準確地獲取增強FOXO1表達后TNF-α誘導的A549細胞中的差異表達基因的信息，從而預測這些基因間的相互關系及功能，以及與FOXO1基因的調控關系。然而基因芯片的結果局限在基因的轉錄水平變化，不具有廣泛性。
綜上所述，本研究通過體外模擬建立ALI細胞炎癥性損傷模型，并增強FOXO1基因的表達，利用基因芯片技術獲取了差異表達基因，并分析了許多FOXO1可能作用的候選基因作為預測FOXO1在ALI細胞炎癥反應中發生作用的靶點，為深入探討FOXO1在ALI中的作用機制提供了線索。
