引用本文： 王小軍, 劉華. 紅芪多糖-1 對人肺腺癌 A549 細胞氧化應激的影響. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(2): 127-131. doi: 10.7507/1671-6205.201608025 復制
肺癌的發病率近年來明顯增高，尤其是女性肺癌發病率增長迅速，甚至超過了男性，臨床工作中發現女性患者的病理類型以腺癌為主[1]。細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種。腫瘤的發生，一方面認為可能與細胞增殖的失控相關，而另一方面認為與細胞凋亡受到抑制相關。研究發現，誘導腫瘤細胞的凋亡是防治腫瘤的有效手段[2-5]。氧自由基（ROS）對細胞的損傷作用不僅與它在細胞內的濃度相關，還與細胞內 ROS/ 內源性的抗氧化物質的平衡相關。細胞內的抗氧化酶保護系統主要包括谷胱甘肽（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）等。氧化/還原平衡失調對細胞增殖、凋亡的調控影響重大。紅芪多糖（hedysarum polysaccharides，HPS）是中藥豆科植物多序巖黃芪的干燥根的主要提取成分，主產于甘肅地區[6]。研究發現，HPS 有著特殊的生物活性，具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、增強免疫力等功效[7]。前期研究發現 HPS 作用于肺腺癌 A549 細胞，可抑制其增殖，誘導凋亡[8]，但具體機制尚未完全闡明。本課題組在既往研究的基礎上，以人肺腺癌 A549 細胞為研究對象，通過 MTT 法、流式細胞術（FCM）法、比色法、化學熒光法探討紅芪多糖 HPS-1 抗腫瘤的可能機制。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
1.1.1 儀器 CO2 孵育箱（HERAcell150, Thermo 公司），超凈工作臺（中國 sw-cj-2f）；光學倒置顯微鏡（日本OLYMPUS CKX41+DP21），酶標儀（美國 Bio-rad），流式細胞儀（BD FACSVerse），低溫離心機（Centrifuge 5427R）。
1.1.2 試劑 DMEM 低糖培養基（Sigma 公司），胎牛血清（杭州四季青公司 141010），胰蛋白酶（HyClone 公司 J130020），噻唑藍（MTT，Sigma 公司 303H0531），二甲基亞砜（DMSO，100 ml，Sigma 公司，302A0327），十二烷基磺酸鈉（SDS，Sigma 公司，325E037）。Annexin V-FITC/PI 試劑盒為 BD Pharmingen 公司產品。ROS、GSH、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、T-AOC、TrxR 以及脂肪酸過氧化代謝產物丙二醛（MDA）活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。人肺腺癌 A549 細胞為本實驗室保存。
1.2 細胞培養及細胞克隆形成實驗
胎牛血清（10%）與青鏈霉素（100 U/ml）混合適量 DMEM 低糖培養液，在 37.0 ℃、CO2 體積分數為 5% 的恒溫、恒濕培養箱中培養，隔天換液。貼壁生長良好的人肺腺癌 A549 細胞經 0.25% 胰蛋白酶消化、傳代。細胞實驗均選用對數增長期且狀態良好的 A549 細胞。參照王亞麗等[9] 的實驗方法，將增長旺盛的 A549 細胞消化后，接種于 60 mm×15 mm 培養皿中，接種數為 40 萬/皿，不同時間點消化細胞，通過細胞計數法，統計克隆形成細胞數，描繪 A549 細胞生長曲線。
空白組為無細胞接種組，對照組培養基中無藥物干預，其余處理步驟同實驗組。
1.3 MTT 法檢測 HPS-1 對 A549 細胞增殖的抑制作用
少量高濃度 HPS-1 加入低糖 DMEM 完全培養基中并及時混勻，終濃度分別為 50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。實驗在 4 塊 96 孔板進行，每組設 5 個復孔，每孔加入的完全培養基為 100 μl，每孔細胞數控制在 8×103 個，實驗重復 3 次。細胞貼壁 16 h 后給藥，24 h、48 h 兩個時間點分別加入 20 μL（5 g/L）MTT，6 h 后每孔加入 SDS（10%，mol/V）150 μl 每孔，37 ℃ 過夜，取出 96 孔板用酶標儀于 570 nm 波長處檢測每孔的吸光度（OD）值。細胞增殖抑制率= [1–（實驗藥物組OD 值/正常對照組OD 值） ]%。
1.4 FCM 法檢測 HPS-1 對 A549 細胞的細胞周期分布及凋亡的影響
培養細胞至培養皿約 80% 時消化，以 4×105 個/培養皿的密度接種于培養皿（60 mm×15 mm）中，細胞貼壁后（16 h）換液，加入含有不同劑量藥物的完全培養液，作用 48 h 后消化細胞，1 500 r/min 離心 5 min（離心半徑為29.9 cm），棄掉上清液，PBS 緩沖液洗滌 2 次。1 500 r/min 再次離心 5 min，后收集細胞，緩緩加入適量 –20 ℃ 提前預冷的 70% 酒精溶液，1 500 r/min 離心 5 min 后，PBS 緩沖液洗滌 2 次，收集細胞，按 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒操作步驟操作，30 min 后上流式細胞儀檢測細胞周期分布及細胞凋亡率情況。
1.5 化學熒光法檢測 HPS-1 對 A549 細胞 ROS 的影響
ROS 包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產物過氧化物和羥化物，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。本實驗采用 DCFH-DA 探針檢測細胞內 ROS 水平。DCFH-DA 進入細胞后被酯酶水解為 DCFH，活性氧存在時 DCFH 被氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質 DCF，在 530 nm 波長處有強大波峰，其強度與細胞內活性氧水平成正比。
培養細胞至培養皿約 80% 時消化，以 1×105 個/培養皿的密度接種于培養皿 24 孔板中，細胞貼壁后（16 h）換液，加入含有不同劑量藥物的完全培養液，作用 12 h、24 h 后，加入終濃度 10 μmol/L 的 DCFH-DA 于培養基，37 ℃ 孵育 60 min 后消化細胞，PBS 洗滌 2 次，制成單細胞懸液，于 530 nm 波長處檢測各孔OD 值。
1.6 比色法檢測 HPS-1 干預 A549 細胞后上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 的表達量
培養細胞至培養皿約 80% 時消化，以 4×105 個/培養皿的密度接種于培養皿（60 mm×15 mm） 中，細胞貼壁后（16 h）換液，加入含有不同劑量藥物的完全培養液，作用 12 h、24 h 后，收集各組標本上清液，按照各試劑盒說明進行后續操作，依次加入各試劑，震蕩混勻后，靜置 10 min，雙蒸水調零，1 cm 光徑，不同波長 [MDA（532 nm），T-AOC（520 nm），T-SOD（550 nm），GSH（420 nm），TrxR（490 nm） ] 處測各組上清液OD 值。
1.7 統計學方法
采用 IBM 公司 SPSS 21.0 統計學軟件進行后續統計分析，計量資料符合正態分布及方差齊性時，數據結果以均數±標準差（ ）表示，兩個樣本均數的比較采用t 檢驗，多樣本均數的比較采用方差分析，以 α=0.05 為檢驗水準，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 A549 細胞生長曲線
采用細胞計數法，接種等量細胞數于 4 個培養皿中，分別于 15、24、48、64 h 時間點各隨機消化 1 個培養皿中細胞，計數后繪制 A549 細胞生長曲線，為后續增殖及凋亡實驗藥物干預時間的選取提供參考。克隆形成實驗結果見圖 1。
圖1
正常人肺腺癌 A549 細胞生長曲線
2.2 MTT 實驗結果
選取低、中、高濃度 HPS-1（50、100、200 mg/L）作用于 A549 細胞，藥物干預 24 h、48 h 后各組細胞依據OD 數據可知，各實驗組與對照組比較表現為增殖抑制作用（P<0.05），各組細胞活力與時間、HPS-1 劑量相關（P<0.05），而與時間劑量無交互作用（P>0.05）。結果見表 1。
表1
MTT 實驗結果（n=5，
）
2.3 HPS-1 對 A549 細胞凋亡的影響
選取低、中、高劑量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 細胞 24 h、48 h 后收集細胞，按照 Annexin Ⅴ-FITC/PI 試劑盒說明上機檢測。FCM 法檢測結果顯示，HPS-1 作用于各組細胞 48 h 后，實驗組細胞凋亡率（早期+晚期）均較對照組高（P<0.05），說明 HPS-1 對 A549 細胞具有凋亡誘導作用，結果見表 2。
表2
細胞周期及細胞凋亡率結果（n=3，%，
）
2.4 HPS-1 對 A549 細胞 ROS 表達的影響果
選取低、中、高劑量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 細胞 12 h、24 h 后加入（終濃度 10 μmol/L）DCFH-DA 后孵育 60 min，收集細胞后上機檢測。檢測結果顯示，HPS-1 作用于各組細胞 12 h 后，實驗組細胞 ROS 含量均較對照組高（P<0.05），且 HPS-1 高劑量組 ROS 較低、中劑量組高（P<0.05）；在 24 h 時間點，HPS-1 高劑量組細胞內 ROS 含量較 12 h 時間點減低（P<0.05），且高于對照組及低、中劑量 HPS-1 組（P<0.05）。說明 HPS-1 對 A549 細胞內 ROS 具有調節作用，且與時間劑量相關。結果見表 3。
表3
各組細胞不同時間點細胞內 ROS 檢測結果（n=3，
）
2.5 細胞上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 含量
選取低、中、高劑量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 細胞 12 h、24 h 后，收集各實驗組細胞上清液，嚴格按照 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 活力檢測試劑盒說明操作，各OD 值結果見表 4。高、中、低劑量 HPS-1 對 A549 細胞 T-SOD、T-AOC、GSH、MDA、TrxR 具有調控作用，其中各實驗組上清液中 T-SOD、T-AOC、GSH、TrxR 在 HPS-1 干預 A549 細胞 12 h、24 h 后表達出現明顯下調（P<0.05），且隨著時間推移，下調比例減 低。上清液中 MDA 在 HPS-1 干預 A549 細胞 12 h、24 h 后表達出現明顯上調（P<0.05），且隨著時間推移上調比例減低。大劑量（200 mg/L）組 T-SOD、T-AOC、GSH、TrxR 表達較低、中劑量組不同時間點下調，差異有統計學意義（P<0.05）。大劑量（200 mg/L）組 MDA 表達較低、中劑量組不同時間點上調，差異有統計學意義（P<0.05）。說明 HPS-1 具有調控 A549 細胞氧化應激的作用，且大劑量 HPS-1 介導作用更明顯。
表4
各組上清液氧化應激指標（n=3，
）
3 討論
中藥紅芪是多序巖黃芪的干燥根，是甘肅省道地藥材。研究發現紅芪中提取出的生物活性物質 HPS 具有抗腫瘤作用[9-12]，但其機制目前尚不十分清楚，同時目前尚無關于 HPS-1 對人肺癌 A549 細胞氧化應激的相關研究。課題組前期研究發現紅芪多糖作用于人肺腺癌 A549 細胞，通過 HPS 誘導腫瘤細胞凋亡以及促使腫瘤細胞中 Bcl-2/Bax 比例下降，進而可以抑制其增殖，誘導凋亡[9]，但具體機制尚未完全闡明。本課題組在既往研究的基礎上，通過細胞分子生物學方法，研究 HPS-1 對人肺腺癌 A549 細胞活力、凋亡、ROS、抗氧化能力以及氧化過程中間代謝產物表達的影響，進一步研究 HPS-1 抗腫瘤的可能機制，為中藥抗腫瘤治療及篩選新的抗癌藥物提供理論基礎和實驗數據支持。
細胞增殖是生物體的重要生命特征，細胞以分裂的方式進行增殖，單細胞生物以細胞分裂的方式產生新的個體。細胞增殖是指細胞在周期調控因子的作用下，嚴格通過 DNA 復制、RNA 轉錄和蛋白質合成等復雜反應而進行的分裂系列過程，其中核 DNA 的復制倍增是整個過程的重要特征。本實驗通過 MTT 法檢測高、中、低劑量 HPS-1 對 A549 細胞增殖的影響，發現 HPS-1 具有抑制 A549 增殖的作用，與李世剛等[12]研究結果一致。
細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種，是細胞一種生理性、主動性的自殺行為。細胞凋亡的信號傳遞途徑及調控機制復雜。目前認為細胞凋亡的發生主要有兩條信號傳導途徑，一條為死亡受體通路，另一條途徑為線粒體信號通路。研究證實細胞內存在復雜的氧化/還原平衡，它對細胞的正常代謝功能、細胞增殖、分化、凋亡的調控具有重要的作用[9,13]。對于需氧的有機生物體而言，ROS 的暴露是連續的不可避免的事件。ROS 的產生和細胞抗氧化能力之間嚴重的失衡就會導致各種類型的生物大分子的損失，包括 DNA、RNA、蛋白質和脂類，高活性的 ROS 對 DNA、RNA、蛋白質、脂類組分的損傷最終導致細胞凋亡。但是，在生物進化的過程中，細胞為了對抗氧化應激，形成了重要的防御機制。一種是細胞酶系統，包括 SOD、催化酶、谷胱甘肽過氧化物酶，這些酶能直接解除 ROS 對細胞的攻擊；另外一種是具有氧化還原活性的氧化還原體系，包括 GST 和硫氧還蛋白（Trx）氧化還原體系。Trx 在細胞凋亡調節中發揮著重要的作用。Trx 及其相關的 TrxR 能顯著抑制細胞的凋亡，但其如何調節細胞的凋亡分子機制尚不能清楚，需進一步探究。
ROS 是人體正常的代謝產物，其來源于兩方面，一是外源性自由基，二是內源性自由基。正常情況下，人體內的自由基處于不斷產生與消除的動態平衡中。細胞膜脂質過氧化被認為是細胞內最主要的氧化損傷，MDA 是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，氧化損傷引起 MDA 生成量的增加，而 MDA 又可進一步激發細胞多方面的損傷。細胞內的抗氧化酶保護系統主要包括 GST、SOD、T-AOC、TrxR 等。我們通過 FCM 法檢測 HPS-1 對 A549 細胞凋亡的影響，發現高、中、低劑量 HPS-1 均可誘導 A549 細胞凋亡（P<0.05），且具有濃度、時間依賴性。進一步通過熒光探針植入 A549 細胞、免疫比色法檢測 HPS-1 干預后細胞上清液，發現 HPS-1 可促進人肺腺癌 A549 細胞 ROS、MDA 的上調（P<0.05），隨著作用時間的延長，上調作用減低；促進 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR 的下調（P<0.05），隨著 HPS-1 干預時間的延長，下調作用減低。本實驗研究證實了 HPS-1 的抗氧化能力，結果與惠和平等[14] 和劉靜等[15] 研究一致；同時通過研究 HPS-1 對肺腺癌 A549 細胞的干預結果發現其抗腫瘤活性作用，提示其抑制 A549 細胞增殖、誘導凋亡可能與調控細胞內氧化/抗氧化平衡機制有關。然而腫瘤細胞凋亡病理生理機制復雜，關于 HPS-1 具體抗腫瘤機制有待進一步研究證實。
肺癌的發病率近年來明顯增高，尤其是女性肺癌發病率增長迅速，甚至超過了男性，臨床工作中發現女性患者的病理類型以腺癌為主[1]。細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種。腫瘤的發生，一方面認為可能與細胞增殖的失控相關，而另一方面認為與細胞凋亡受到抑制相關。研究發現，誘導腫瘤細胞的凋亡是防治腫瘤的有效手段[2-5]。氧自由基（ROS）對細胞的損傷作用不僅與它在細胞內的濃度相關，還與細胞內 ROS/ 內源性的抗氧化物質的平衡相關。細胞內的抗氧化酶保護系統主要包括谷胱甘肽（GST）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（T-AOC）、硫氧還蛋白還原酶（TrxR）等。氧化/還原平衡失調對細胞增殖、凋亡的調控影響重大。紅芪多糖（hedysarum polysaccharides，HPS）是中藥豆科植物多序巖黃芪的干燥根的主要提取成分，主產于甘肅地區[6]。研究發現，HPS 有著特殊的生物活性，具有抗癌、抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、降血脂、增強免疫力等功效[7]。前期研究發現 HPS 作用于肺腺癌 A549 細胞，可抑制其增殖，誘導凋亡[8]，但具體機制尚未完全闡明。本課題組在既往研究的基礎上，以人肺腺癌 A549 細胞為研究對象，通過 MTT 法、流式細胞術（FCM）法、比色法、化學熒光法探討紅芪多糖 HPS-1 抗腫瘤的可能機制。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑
1.1.1 儀器 CO2 孵育箱（HERAcell150, Thermo 公司），超凈工作臺（中國 sw-cj-2f）；光學倒置顯微鏡（日本OLYMPUS CKX41+DP21），酶標儀（美國 Bio-rad），流式細胞儀（BD FACSVerse），低溫離心機（Centrifuge 5427R）。
1.1.2 試劑 DMEM 低糖培養基（Sigma 公司），胎牛血清（杭州四季青公司 141010），胰蛋白酶（HyClone 公司 J130020），噻唑藍（MTT，Sigma 公司 303H0531），二甲基亞砜（DMSO，100 ml，Sigma 公司，302A0327），十二烷基磺酸鈉（SDS，Sigma 公司，325E037）。Annexin V-FITC/PI 試劑盒為 BD Pharmingen 公司產品。ROS、GSH、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、T-AOC、TrxR 以及脂肪酸過氧化代謝產物丙二醛（MDA）活性檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。人肺腺癌 A549 細胞為本實驗室保存。
1.2 細胞培養及細胞克隆形成實驗
胎牛血清（10%）與青鏈霉素（100 U/ml）混合適量 DMEM 低糖培養液，在 37.0 ℃、CO2 體積分數為 5% 的恒溫、恒濕培養箱中培養，隔天換液。貼壁生長良好的人肺腺癌 A549 細胞經 0.25% 胰蛋白酶消化、傳代。細胞實驗均選用對數增長期且狀態良好的 A549 細胞。參照王亞麗等[9] 的實驗方法，將增長旺盛的 A549 細胞消化后，接種于 60 mm×15 mm 培養皿中，接種數為 40 萬/皿，不同時間點消化細胞，通過細胞計數法，統計克隆形成細胞數，描繪 A549 細胞生長曲線。
空白組為無細胞接種組，對照組培養基中無藥物干預，其余處理步驟同實驗組。
1.3 MTT 法檢測 HPS-1 對 A549 細胞增殖的抑制作用
少量高濃度 HPS-1 加入低糖 DMEM 完全培養基中并及時混勻，終濃度分別為 50 mg/L、100 mg/L、200 mg/L。實驗在 4 塊 96 孔板進行，每組設 5 個復孔，每孔加入的完全培養基為 100 μl，每孔細胞數控制在 8×103 個，實驗重復 3 次。細胞貼壁 16 h 后給藥，24 h、48 h 兩個時間點分別加入 20 μL（5 g/L）MTT，6 h 后每孔加入 SDS（10%，mol/V）150 μl 每孔，37 ℃ 過夜，取出 96 孔板用酶標儀于 570 nm 波長處檢測每孔的吸光度（OD）值。細胞增殖抑制率= [1–（實驗藥物組OD 值/正常對照組OD 值） ]%。
1.4 FCM 法檢測 HPS-1 對 A549 細胞的細胞周期分布及凋亡的影響
培養細胞至培養皿約 80% 時消化，以 4×105 個/培養皿的密度接種于培養皿（60 mm×15 mm）中，細胞貼壁后（16 h）換液，加入含有不同劑量藥物的完全培養液，作用 48 h 后消化細胞，1 500 r/min 離心 5 min（離心半徑為29.9 cm），棄掉上清液，PBS 緩沖液洗滌 2 次。1 500 r/min 再次離心 5 min，后收集細胞，緩緩加入適量 –20 ℃ 提前預冷的 70% 酒精溶液，1 500 r/min 離心 5 min 后，PBS 緩沖液洗滌 2 次，收集細胞，按 Annexin Ⅴ-FITC/PI 凋亡檢測試劑盒操作步驟操作，30 min 后上流式細胞儀檢測細胞周期分布及細胞凋亡率情況。
1.5 化學熒光法檢測 HPS-1 對 A549 細胞 ROS 的影響
ROS 包括超氧自由基、過氧化氫及其下游產物過氧化物和羥化物，參與細胞生長增殖、發育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。本實驗采用 DCFH-DA 探針檢測細胞內 ROS 水平。DCFH-DA 進入細胞后被酯酶水解為 DCFH，活性氧存在時 DCFH 被氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質 DCF，在 530 nm 波長處有強大波峰，其強度與細胞內活性氧水平成正比。
培養細胞至培養皿約 80% 時消化，以 1×105 個/培養皿的密度接種于培養皿 24 孔板中，細胞貼壁后（16 h）換液，加入含有不同劑量藥物的完全培養液，作用 12 h、24 h 后，加入終濃度 10 μmol/L 的 DCFH-DA 于培養基，37 ℃ 孵育 60 min 后消化細胞，PBS 洗滌 2 次，制成單細胞懸液，于 530 nm 波長處檢測各孔OD 值。
1.6 比色法檢測 HPS-1 干預 A549 細胞后上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 的表達量
培養細胞至培養皿約 80% 時消化，以 4×105 個/培養皿的密度接種于培養皿（60 mm×15 mm） 中，細胞貼壁后（16 h）換液，加入含有不同劑量藥物的完全培養液，作用 12 h、24 h 后，收集各組標本上清液，按照各試劑盒說明進行后續操作，依次加入各試劑，震蕩混勻后，靜置 10 min，雙蒸水調零，1 cm 光徑，不同波長 [MDA（532 nm），T-AOC（520 nm），T-SOD（550 nm），GSH（420 nm），TrxR（490 nm） ] 處測各組上清液OD 值。
1.7 統計學方法
采用 IBM 公司 SPSS 21.0 統計學軟件進行后續統計分析，計量資料符合正態分布及方差齊性時，數據結果以均數±標準差（ ）表示，兩個樣本均數的比較采用t 檢驗，多樣本均數的比較采用方差分析，以 α=0.05 為檢驗水準，P<0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 A549 細胞生長曲線
采用細胞計數法，接種等量細胞數于 4 個培養皿中，分別于 15、24、48、64 h 時間點各隨機消化 1 個培養皿中細胞，計數后繪制 A549 細胞生長曲線，為后續增殖及凋亡實驗藥物干預時間的選取提供參考。克隆形成實驗結果見圖 1。
圖1
正常人肺腺癌 A549 細胞生長曲線
2.2 MTT 實驗結果
選取低、中、高濃度 HPS-1（50、100、200 mg/L）作用于 A549 細胞，藥物干預 24 h、48 h 后各組細胞依據OD 數據可知，各實驗組與對照組比較表現為增殖抑制作用（P<0.05），各組細胞活力與時間、HPS-1 劑量相關（P<0.05），而與時間劑量無交互作用（P>0.05）。結果見表 1。
表1
MTT 實驗結果（n=5，
）
2.3 HPS-1 對 A549 細胞凋亡的影響
選取低、中、高劑量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 細胞 24 h、48 h 后收集細胞，按照 Annexin Ⅴ-FITC/PI 試劑盒說明上機檢測。FCM 法檢測結果顯示，HPS-1 作用于各組細胞 48 h 后，實驗組細胞凋亡率（早期+晚期）均較對照組高（P<0.05），說明 HPS-1 對 A549 細胞具有凋亡誘導作用，結果見表 2。
表2
細胞周期及細胞凋亡率結果（n=3，%，
）
2.4 HPS-1 對 A549 細胞 ROS 表達的影響果
選取低、中、高劑量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 細胞 12 h、24 h 后加入（終濃度 10 μmol/L）DCFH-DA 后孵育 60 min，收集細胞后上機檢測。檢測結果顯示，HPS-1 作用于各組細胞 12 h 后，實驗組細胞 ROS 含量均較對照組高（P<0.05），且 HPS-1 高劑量組 ROS 較低、中劑量組高（P<0.05）；在 24 h 時間點，HPS-1 高劑量組細胞內 ROS 含量較 12 h 時間點減低（P<0.05），且高于對照組及低、中劑量 HPS-1 組（P<0.05）。說明 HPS-1 對 A549 細胞內 ROS 具有調節作用，且與時間劑量相關。結果見表 3。
表3
各組細胞不同時間點細胞內 ROS 檢測結果（n=3，
）
2.5 細胞上清液中 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 含量
選取低、中、高劑量 HPS-1 作用于人肺腺癌 A549 細胞 12 h、24 h 后，收集各實驗組細胞上清液，嚴格按照 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR、MDA 活力檢測試劑盒說明操作，各OD 值結果見表 4。高、中、低劑量 HPS-1 對 A549 細胞 T-SOD、T-AOC、GSH、MDA、TrxR 具有調控作用，其中各實驗組上清液中 T-SOD、T-AOC、GSH、TrxR 在 HPS-1 干預 A549 細胞 12 h、24 h 后表達出現明顯下調（P<0.05），且隨著時間推移，下調比例減 低。上清液中 MDA 在 HPS-1 干預 A549 細胞 12 h、24 h 后表達出現明顯上調（P<0.05），且隨著時間推移上調比例減低。大劑量（200 mg/L）組 T-SOD、T-AOC、GSH、TrxR 表達較低、中劑量組不同時間點下調，差異有統計學意義（P<0.05）。大劑量（200 mg/L）組 MDA 表達較低、中劑量組不同時間點上調，差異有統計學意義（P<0.05）。說明 HPS-1 具有調控 A549 細胞氧化應激的作用，且大劑量 HPS-1 介導作用更明顯。
表4
各組上清液氧化應激指標（n=3，
）
3 討論
中藥紅芪是多序巖黃芪的干燥根，是甘肅省道地藥材。研究發現紅芪中提取出的生物活性物質 HPS 具有抗腫瘤作用[9-12]，但其機制目前尚不十分清楚，同時目前尚無關于 HPS-1 對人肺癌 A549 細胞氧化應激的相關研究。課題組前期研究發現紅芪多糖作用于人肺腺癌 A549 細胞，通過 HPS 誘導腫瘤細胞凋亡以及促使腫瘤細胞中 Bcl-2/Bax 比例下降，進而可以抑制其增殖，誘導凋亡[9]，但具體機制尚未完全闡明。本課題組在既往研究的基礎上，通過細胞分子生物學方法，研究 HPS-1 對人肺腺癌 A549 細胞活力、凋亡、ROS、抗氧化能力以及氧化過程中間代謝產物表達的影響，進一步研究 HPS-1 抗腫瘤的可能機制，為中藥抗腫瘤治療及篩選新的抗癌藥物提供理論基礎和實驗數據支持。
細胞增殖是生物體的重要生命特征，細胞以分裂的方式進行增殖，單細胞生物以細胞分裂的方式產生新的個體。細胞增殖是指細胞在周期調控因子的作用下，嚴格通過 DNA 復制、RNA 轉錄和蛋白質合成等復雜反應而進行的分裂系列過程，其中核 DNA 的復制倍增是整個過程的重要特征。本實驗通過 MTT 法檢測高、中、低劑量 HPS-1 對 A549 細胞增殖的影響，發現 HPS-1 具有抑制 A549 增殖的作用，與李世剛等[12]研究結果一致。
細胞凋亡是程序性細胞死亡的一種，是細胞一種生理性、主動性的自殺行為。細胞凋亡的信號傳遞途徑及調控機制復雜。目前認為細胞凋亡的發生主要有兩條信號傳導途徑，一條為死亡受體通路，另一條途徑為線粒體信號通路。研究證實細胞內存在復雜的氧化/還原平衡，它對細胞的正常代謝功能、細胞增殖、分化、凋亡的調控具有重要的作用[9,13]。對于需氧的有機生物體而言，ROS 的暴露是連續的不可避免的事件。ROS 的產生和細胞抗氧化能力之間嚴重的失衡就會導致各種類型的生物大分子的損失，包括 DNA、RNA、蛋白質和脂類，高活性的 ROS 對 DNA、RNA、蛋白質、脂類組分的損傷最終導致細胞凋亡。但是，在生物進化的過程中，細胞為了對抗氧化應激，形成了重要的防御機制。一種是細胞酶系統，包括 SOD、催化酶、谷胱甘肽過氧化物酶，這些酶能直接解除 ROS 對細胞的攻擊；另外一種是具有氧化還原活性的氧化還原體系，包括 GST 和硫氧還蛋白（Trx）氧化還原體系。Trx 在細胞凋亡調節中發揮著重要的作用。Trx 及其相關的 TrxR 能顯著抑制細胞的凋亡，但其如何調節細胞的凋亡分子機制尚不能清楚，需進一步探究。
ROS 是人體正常的代謝產物，其來源于兩方面，一是外源性自由基，二是內源性自由基。正常情況下，人體內的自由基處于不斷產生與消除的動態平衡中。細胞膜脂質過氧化被認為是細胞內最主要的氧化損傷，MDA 是細胞膜脂質過氧化的終產物之一，氧化損傷引起 MDA 生成量的增加，而 MDA 又可進一步激發細胞多方面的損傷。細胞內的抗氧化酶保護系統主要包括 GST、SOD、T-AOC、TrxR 等。我們通過 FCM 法檢測 HPS-1 對 A549 細胞凋亡的影響，發現高、中、低劑量 HPS-1 均可誘導 A549 細胞凋亡（P<0.05），且具有濃度、時間依賴性。進一步通過熒光探針植入 A549 細胞、免疫比色法檢測 HPS-1 干預后細胞上清液，發現 HPS-1 可促進人肺腺癌 A549 細胞 ROS、MDA 的上調（P<0.05），隨著作用時間的延長，上調作用減低；促進 GSH、T-SOD、T-AOC、TrxR 的下調（P<0.05），隨著 HPS-1 干預時間的延長，下調作用減低。本實驗研究證實了 HPS-1 的抗氧化能力，結果與惠和平等[14] 和劉靜等[15] 研究一致；同時通過研究 HPS-1 對肺腺癌 A549 細胞的干預結果發現其抗腫瘤活性作用，提示其抑制 A549 細胞增殖、誘導凋亡可能與調控細胞內氧化/抗氧化平衡機制有關。然而腫瘤細胞凋亡病理生理機制復雜，關于 HPS-1 具體抗腫瘤機制有待進一步研究證實。
