引用本文： 胡博, 欒正剛. 普通肝素改善高遷移率族蛋白 1 介導的血管內皮細胞屏障通透性增加的實驗研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(1): 29-33. doi: 10.7507/1671-6205.201607045 復制
膿毒癥（sepsis）是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），涉及失控的全身炎癥反應、凝血功能異常、免疫功能障礙、內皮細胞及組織損傷等。全身炎癥反應是膿毒癥感染性休克的標志之一，血管內皮細胞為炎癥反應的調節和放大提供了重要的場所[1]，是膿毒癥損傷的靶器官之一[2]。高遷移率族蛋白 1（high-mobility group box-1 protein，HMGB1）作為新的潛在晚期炎癥介質，參與了膿毒癥的發病過程，可激活血管內皮細胞，介導內皮細胞屏障功能不全，進而導致毛細血管滲漏，介導肺損傷、急性肺水腫等，是內毒素致死效應的重要晚期因子[3]。普通肝素（unfractionated heparin，UFH）是一種復雜的糖胺聚糖，是最常使用的抗凝藥物。它可以通過抑制白細胞粘附活化，抑制補體的激活，保護血管內皮細胞免受趨化因子、組胺、細菌內毒素及氧自由基等損傷，以及維持內皮細胞屏障的完整性等[4]，但其機制不完全明晰。本研究旨在探討 UFH 改善 HMGB1 介導的血管內皮細胞屏障通透性增加的作用及機制。
1 材料與方法
1.1 材料
人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）株購于南京凱基生物科技發展有限公司。0.25% 胰蛋白酶、DMEM 培養液購于 Gibco 公司。肝素鈉購于南京新百藥業有限公司。人重組 HMGB1（recombinant human high-mobility group box 1，rhHMGB1）購于美國 Proteintech 公司。Transwell 聚碳脂膜購于美國 Costar 公司。ZO-1 抗體（mouse anti-ZO-1 monoclonal antibody），4′, 6- 二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）及異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗鼠 IgG 購于美國 Sigma 公司。核因子 -κB（NF-κB）p65 抗體、BCA 蛋白定量試劑盒、細胞核蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。
1.2 方法
1.2.1 內皮細胞培養 經胰蛋白酶消化后種植于培養瓶內，加入 3～5 ml DMEM 完全培養液置于 5% CO2、37 ℃ 條件下細胞培養箱中培養，約 2～3 d 鋪滿。鏡下融合生長至 80%。細胞傳代，待細胞融合生長至 80% 時用于實驗。
1.2.2 實驗分組 將細胞分為 4 組（n = 5 ）：空白對照組（加入等量PBS）、HMGB1 處理組（100 ng/ml）、UFH 對照組（UFH 10 U/ml）、HMGB1 及 UFH 處理組（100 ng/ml HMGB1 + UFH 10 U/ml）。
1.2.3 細胞存活率的檢測 將內皮細胞以 1 ×104/孔的濃度接種于 96 孔培養板中，置孵育箱 24 h 后內皮細胞呈單層生長，加入以不同濃度 rhHMGB1 刺激因素，分別為 0 、10、50、100、150 ng/ml 繼續孵育 24 h。后每孔加入 20 μl MTT，培養 4 h，加入二甲基亞砜（DMSO）150 ml，充分振蕩 10 min，酶標儀測定 490 nm 處各孔的吸光值（OD）。
1.2.4 內皮細胞通透性實驗 人臍內皮細胞種植 Transwell 上層小室上，培養 24 h，待細胞生長融合成單層內皮細胞后，更換無血清培養液饑餓細胞 4 h 進行滲透性研究。取 24 孔培養的細胞隨機進行分組，每組 3 孔分別加入上述不同刺激因素，同時加入含有 FITC 標記的葡聚糖（FD40）于 DMEM 中總體積共 100 μl，培養 5 min 后從下室抽取 200 μl 培養液做為基礎值，補充下室培養液后繼續培養。分別于刺激后 1 、3 、6 、12 及 24 h 分別從下室取 200 μl 培養液進行 FD40 熒光強度測定，并用 50 μl DMEM 培養基給予補充。用熒光分光光度計檢測 FITC 的熒光發射強度。各實驗組測量值與其基礎值的差值為 FD40 的熒光強度，該實驗每組均重復 3 次并取平均值。
1.2.5 胞質緊密粘連蛋白 -1（ZO-1）免疫熒光染色 細胞貼壁生長至對數生長期，經 0.25% 胰蛋白酶消化，將細胞懸液以 1 ×105 細胞/孔接種于蓋玻片上。至細胞貼壁融合至 80% 后，予不含胎牛血清的 DMEM 液培養 24 h。待細胞同步化后，分別給予 PBS、rhHMGB1、UFH、rhHMGB1+UFH（UFH 提前 15 min）培養 24 h； 4% 多聚甲醛固定 30 min；0.2% Tritonx-100 透化；加入鼠抗人 ZO-1 原代抗體 2 μl 于 0.1% BSA 封閉 1 h；5% 的 BSA 中，4 ℃ 孵育過夜；加入 FITC 標記的羊抗鼠 IgG 100 μl，37 ℃ 避光封閉 1 h，DAPI 染核；50% 甘油封片，熒光顯微鏡下照相。
1.2.6 蛋白印跡法測定 ZO-1 蛋白表達 細胞培養同前，給予分組刺激后提取蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，根據檢測結果，用 RIPA 裂解液調整各標本至相同的蛋白濃度；蛋白變性后經 SDS-PAGE 電泳，轉印于 PVDF 膜上；5% BSA 中 4 ℃ 封閉過夜；加入鼠抗 ZO-l 原代抗體（1∶500），4 ℃ 孵育過夜；加入 HRP 標記的羊抗鼠 IgG（1∶5 000） 二抗孵育 2 h；顯色后應用 Image J 圖像分析軟件進行分析，測定每條蛋白電泳帶的灰度值，分析蛋白表達情況。
1.2.7 蛋白印跡法測定細胞核內 NF-κB 的含量 細胞予不同刺激培養后，嚴格按照細胞核蛋白抽提試劑盒說明書操作，提取胞核蛋白；按照 BCA 法定量蛋白濃度；蛋白變性后，經 SDS-PAGE 電泳，轉印記于 PVDF 膜；5%BSA 中 4 ℃ 封閉過夜；加入抗 NF-κB p65 抗體 4 ℃ 孵育過夜；次日用 TBST 洗滌后加入相應辣根酶標記的二抗，室溫孵育 2 h；洗滌后顯色，分析蛋白表達情況。
1.3 統計學方法
使用 SPSS 13.0 專業統計軟件進行統計學分析，實驗結果用均數 ± 標準差（ ±s）表示，經參數或者非參數方差檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度 HMGB1 刺激下細胞存活率變化
與空白組比較，不同濃度的 rhHMGB1 對內皮細胞存活率均無顯著影響（P＞0.05），結果見圖 1。
圖1
不同濃度 HMGB1 對內皮細胞存活率的影響
2.2 Transwell 法測定內皮細胞通透性
經 rhHMGB1（100 ng/ml）刺激 3 h、6 h，內皮細胞通透性無明顯變化（P＞0.05）。但隨著刺激時間的延長，rhHMGB1 組內皮細胞屏障通透性開始明顯增高，并隨著時間的增加而增加，其中第 12 h 及 24 h 與空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。經肝素預處理后與 rhHMGB1 共同培養，于 12 h 及 24 h 內皮細胞通透性低于 HMGB1 處理組（P＜0.05）。結果見表 1。
表1
不同刺激因素對內皮細胞通透性影響
2.3 免疫熒光法測定 ZO-1 表達分布
正常內皮細胞 ZO-1 存在于細胞周邊呈環狀，線條清晰、連續、光滑、流暢，細胞間連接緊密無明顯間隙。100 ng/ml rhHMGB1 刺激 24 h 后，ZO-1 表達呈環線模糊、斷裂狀、邊緣粗糙，細胞間出現了明顯的裂隙；密閉環出現明顯中斷，邊緣也變得十分模糊。給予 UFH 預處理后，ZO-1 熒光表達強度較 HMGB1 處理組明顯增強，ZO-1 密閉環更連續，線條斷裂減少。結果見圖 2。
圖2
免疫熒光法緊密連接蛋白 ZO-1 表達（IF×400） a．空白對照組； b．HMGB1 處理組； c．UFH 對照組； d．HMGB1 及 UFH 處理組
2.4 Western blot 檢測 ZO-1 表達
經 rhHMGB1 處理后，ZO-1 蛋白表達較肝素組及空白對照組減少。經肝素預處理后，ZO-1 表達較 HMGB1 處理組有所增加。結果見圖 3。
圖3
不同因素刺激 24 h 內皮細胞 ZO-1 蛋白的表達
2.5 Western blot 檢測核內 NF-κB 的表達
經 rhHMGB1 處理后，核內 NF-κB p65 蛋白表達較空白對照組增加。經肝素預處理后，核內 NF-κB p65 的含量明顯降低，肝素可抑制 HMGB1 介導的 NF-κB 核易位。結果見圖 4。
圖4
不同因素刺激 24 h 內皮細胞核內 NF-κB p65 的表達
3 討論
內皮細胞在許多生理功能中發揮重要作用，包括血管張力控制、細胞轉運、凝血平衡、水電解質滲透擴散、先天免疫和適應性免疫等[5]。血管內皮細胞間的連接主要有四種類型：緊密連接、粘附連接、縫隙連接和粘合體[6]。膿毒癥時，損傷的內皮細胞可大量釋放 HMGB1，釋放的 HMGB1 可活化內皮細胞中的 NF-κB 并促進其核易位，進而加重全身炎癥反應[7]。同時釋放的 HMGB1 通過誘導內皮細胞骨架肌動蛋白（F-actin）重組以及 ZO-1 和黏附連接蛋白（VE-cadherin）結構改變和表達變化，導致內皮細胞收縮、細胞間裂隙形成，引發內皮細胞通透性增高。其機制之一是通過糖基化終末產物受體（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）和 Src- 家族酪氨酸激酶通路發生作用，通過抑制其活性可減輕內皮形態結構損傷并改善其通透性[8]。因此，抑制 HMGB1 的活性并保護血管內皮屏障的完整性對膿毒癥來說是一個極具吸引力的治療策略。近年來對膿毒癥的研究表明，人血漿蛋白 Kallistatin、葒草素等均顯示出抗 HMGB1 活性，從而抑制膿毒癥時一系列炎癥反應，提高膿毒癥小鼠存活率[4,9]。而 HMGB1 最初是作為肝素結合蛋白而分離出來的，在其氨基末端有肝素結合的共有序列，表現出肝素結合活性[10]；動物及人體試驗均證實肝素可抑制膿毒癥時凝血級聯反應[11]，并具有廣泛的抗炎作用[12]。肝素與 HMGB1 結合后，可改變 HMGB1 的構象從而干擾 RAGE/HMGB1 的相互作用，降低 HMGB1 與 RAGE 的親和力[13-14]，從而抑制 NF-κB 核異位[15]，減輕炎癥反應，保護內皮細胞通透性等。
本研究運用 Transwell 細胞滲透性試驗測定內皮細胞屏障通透性。實驗觀察到，隨著 rhHMGB1 刺激時間的增加，FD40 滲透的熒光強度逐漸增加，于 12 h 和 24 h 時 HMGB1 處理組與 UFH 對照組和空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），證實了 HMGB1 可誘導內皮細胞屏障通透性增加；而經 UFH 預處理后與 rhHMGB1 共同孵育，12 h 和 24 h 時 FD40 滲透的熒光強度較 UFH 對照組及空白對照組明顯降低（P＜0.05），表明經 UFH 預處理后內皮細胞屏障通透性得到了改善，UFH 可改善 HMGB1 所致的內皮細胞屏障通透性增加。
內皮細胞間緊密連接表達和分布的改變可導致內皮細胞屏障通透性的增加。細胞間的緊密連接可調節細胞旁擴散，是內皮細胞屏障形成的關鍵[16]。內皮細胞之間的緊密連接還控制著血管內外物質的交換，防止血管內血液和其他成分的外漏。其中，緊密連接蛋白 ZO-1 可維持細胞與細胞間張力，是血管內皮屏障形成的重要蛋白之一[17]。本研究顯示，空白對照組緊密連接蛋白 ZO-1 呈圓環狀，完整，線條清晰。經 rhHMGB1（100 ng/ml） 處理后，ZO-1 環明顯不連續，密閉環減少及熒光強度明顯減弱。而 UFH 預處理組 ZO-1 熒光強度較 HMGB1 處理組明顯增強，密閉環明顯增多，線條更加清晰連續。運用 Western blot 法檢測 ZO-1 蛋白表達時也發現經 UFH 處理后，內皮細胞 ZO-1 的表達較單純 HMGB1 處理組明顯增多（P＜0.05），說明 UFH 可保護 HMGB1 所致的緊密連接蛋白 ZO-1 的破壞，使 ZO-1 表達增多。
NF-κB 是與炎癥反應密切相關的核轉錄因子[18]。現有證據表明 HMGB1 通過 RAGE 可激活 NF-κB、纖溶酶原激活抑制物、Rho 蛋白等，可引起內皮屏障損害而導致通透性增高[19]。UFH 對膿毒癥時內皮細胞屏障具有保護作用，其對血管系統的影響的具體機制并未完全明了。我們的研究顯示，rhHMGB1 刺激內皮細胞后，NF-κB 發生明顯的核易位，細胞核內 NF-κB 表達明顯增加；而 UFH 與 rhHMGB1 共同孵育后可抑制 rhHMGB1 的活性，抑制 NF-κB 的核易位，改善內皮細胞緊密連接蛋白 ZO-1 的分布和表達，從而保護內皮細胞屏障通透性。總之，本實驗為 UFH 治療膿毒癥微循環障礙的有效性提供了理論依據。
膿毒癥（sepsis）是指由感染引起的全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），涉及失控的全身炎癥反應、凝血功能異常、免疫功能障礙、內皮細胞及組織損傷等。全身炎癥反應是膿毒癥感染性休克的標志之一，血管內皮細胞為炎癥反應的調節和放大提供了重要的場所[1]，是膿毒癥損傷的靶器官之一[2]。高遷移率族蛋白 1（high-mobility group box-1 protein，HMGB1）作為新的潛在晚期炎癥介質，參與了膿毒癥的發病過程，可激活血管內皮細胞，介導內皮細胞屏障功能不全，進而導致毛細血管滲漏，介導肺損傷、急性肺水腫等，是內毒素致死效應的重要晚期因子[3]。普通肝素（unfractionated heparin，UFH）是一種復雜的糖胺聚糖，是最常使用的抗凝藥物。它可以通過抑制白細胞粘附活化，抑制補體的激活，保護血管內皮細胞免受趨化因子、組胺、細菌內毒素及氧自由基等損傷，以及維持內皮細胞屏障的完整性等[4]，但其機制不完全明晰。本研究旨在探討 UFH 改善 HMGB1 介導的血管內皮細胞屏障通透性增加的作用及機制。
1 材料與方法
1.1 材料
人臍靜脈內皮細胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）株購于南京凱基生物科技發展有限公司。0.25% 胰蛋白酶、DMEM 培養液購于 Gibco 公司。肝素鈉購于南京新百藥業有限公司。人重組 HMGB1（recombinant human high-mobility group box 1，rhHMGB1）購于美國 Proteintech 公司。Transwell 聚碳脂膜購于美國 Costar 公司。ZO-1 抗體（mouse anti-ZO-1 monoclonal antibody），4′, 6- 二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）及異硫氰酸熒光素（FITC）標記的羊抗鼠 IgG 購于美國 Sigma 公司。核因子 -κB（NF-κB）p65 抗體、BCA 蛋白定量試劑盒、細胞核蛋白抽提試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。
1.2 方法
1.2.1 內皮細胞培養 經胰蛋白酶消化后種植于培養瓶內，加入 3～5 ml DMEM 完全培養液置于 5% CO2、37 ℃ 條件下細胞培養箱中培養，約 2～3 d 鋪滿。鏡下融合生長至 80%。細胞傳代，待細胞融合生長至 80% 時用于實驗。
1.2.2 實驗分組 將細胞分為 4 組（n = 5 ）：空白對照組（加入等量PBS）、HMGB1 處理組（100 ng/ml）、UFH 對照組（UFH 10 U/ml）、HMGB1 及 UFH 處理組（100 ng/ml HMGB1 + UFH 10 U/ml）。
1.2.3 細胞存活率的檢測 將內皮細胞以 1 ×104/孔的濃度接種于 96 孔培養板中，置孵育箱 24 h 后內皮細胞呈單層生長，加入以不同濃度 rhHMGB1 刺激因素，分別為 0 、10、50、100、150 ng/ml 繼續孵育 24 h。后每孔加入 20 μl MTT，培養 4 h，加入二甲基亞砜（DMSO）150 ml，充分振蕩 10 min，酶標儀測定 490 nm 處各孔的吸光值（OD）。
1.2.4 內皮細胞通透性實驗 人臍內皮細胞種植 Transwell 上層小室上，培養 24 h，待細胞生長融合成單層內皮細胞后，更換無血清培養液饑餓細胞 4 h 進行滲透性研究。取 24 孔培養的細胞隨機進行分組，每組 3 孔分別加入上述不同刺激因素，同時加入含有 FITC 標記的葡聚糖（FD40）于 DMEM 中總體積共 100 μl，培養 5 min 后從下室抽取 200 μl 培養液做為基礎值，補充下室培養液后繼續培養。分別于刺激后 1 、3 、6 、12 及 24 h 分別從下室取 200 μl 培養液進行 FD40 熒光強度測定，并用 50 μl DMEM 培養基給予補充。用熒光分光光度計檢測 FITC 的熒光發射強度。各實驗組測量值與其基礎值的差值為 FD40 的熒光強度，該實驗每組均重復 3 次并取平均值。
1.2.5 胞質緊密粘連蛋白 -1（ZO-1）免疫熒光染色 細胞貼壁生長至對數生長期，經 0.25% 胰蛋白酶消化，將細胞懸液以 1 ×105 細胞/孔接種于蓋玻片上。至細胞貼壁融合至 80% 后，予不含胎牛血清的 DMEM 液培養 24 h。待細胞同步化后，分別給予 PBS、rhHMGB1、UFH、rhHMGB1+UFH（UFH 提前 15 min）培養 24 h； 4% 多聚甲醛固定 30 min；0.2% Tritonx-100 透化；加入鼠抗人 ZO-1 原代抗體 2 μl 于 0.1% BSA 封閉 1 h；5% 的 BSA 中，4 ℃ 孵育過夜；加入 FITC 標記的羊抗鼠 IgG 100 μl，37 ℃ 避光封閉 1 h，DAPI 染核；50% 甘油封片，熒光顯微鏡下照相。
1.2.6 蛋白印跡法測定 ZO-1 蛋白表達 細胞培養同前，給予分組刺激后提取蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度，根據檢測結果，用 RIPA 裂解液調整各標本至相同的蛋白濃度；蛋白變性后經 SDS-PAGE 電泳，轉印于 PVDF 膜上；5% BSA 中 4 ℃ 封閉過夜；加入鼠抗 ZO-l 原代抗體（1∶500），4 ℃ 孵育過夜；加入 HRP 標記的羊抗鼠 IgG（1∶5 000） 二抗孵育 2 h；顯色后應用 Image J 圖像分析軟件進行分析，測定每條蛋白電泳帶的灰度值，分析蛋白表達情況。
1.2.7 蛋白印跡法測定細胞核內 NF-κB 的含量 細胞予不同刺激培養后，嚴格按照細胞核蛋白抽提試劑盒說明書操作，提取胞核蛋白；按照 BCA 法定量蛋白濃度；蛋白變性后，經 SDS-PAGE 電泳，轉印記于 PVDF 膜；5%BSA 中 4 ℃ 封閉過夜；加入抗 NF-κB p65 抗體 4 ℃ 孵育過夜；次日用 TBST 洗滌后加入相應辣根酶標記的二抗，室溫孵育 2 h；洗滌后顯色，分析蛋白表達情況。
1.3 統計學方法
使用 SPSS 13.0 專業統計軟件進行統計學分析，實驗結果用均數 ± 標準差（ ±s）表示，經參數或者非參數方差檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 不同濃度 HMGB1 刺激下細胞存活率變化
與空白組比較，不同濃度的 rhHMGB1 對內皮細胞存活率均無顯著影響（P＞0.05），結果見圖 1。
圖1
不同濃度 HMGB1 對內皮細胞存活率的影響
2.2 Transwell 法測定內皮細胞通透性
經 rhHMGB1（100 ng/ml）刺激 3 h、6 h，內皮細胞通透性無明顯變化（P＞0.05）。但隨著刺激時間的延長，rhHMGB1 組內皮細胞屏障通透性開始明顯增高，并隨著時間的增加而增加，其中第 12 h 及 24 h 與空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。經肝素預處理后與 rhHMGB1 共同培養，于 12 h 及 24 h 內皮細胞通透性低于 HMGB1 處理組（P＜0.05）。結果見表 1。
表1
不同刺激因素對內皮細胞通透性影響
2.3 免疫熒光法測定 ZO-1 表達分布
正常內皮細胞 ZO-1 存在于細胞周邊呈環狀，線條清晰、連續、光滑、流暢，細胞間連接緊密無明顯間隙。100 ng/ml rhHMGB1 刺激 24 h 后，ZO-1 表達呈環線模糊、斷裂狀、邊緣粗糙，細胞間出現了明顯的裂隙；密閉環出現明顯中斷，邊緣也變得十分模糊。給予 UFH 預處理后，ZO-1 熒光表達強度較 HMGB1 處理組明顯增強，ZO-1 密閉環更連續，線條斷裂減少。結果見圖 2。
圖2
免疫熒光法緊密連接蛋白 ZO-1 表達（IF×400） a．空白對照組； b．HMGB1 處理組； c．UFH 對照組； d．HMGB1 及 UFH 處理組
2.4 Western blot 檢測 ZO-1 表達
經 rhHMGB1 處理后，ZO-1 蛋白表達較肝素組及空白對照組減少。經肝素預處理后，ZO-1 表達較 HMGB1 處理組有所增加。結果見圖 3。
圖3
不同因素刺激 24 h 內皮細胞 ZO-1 蛋白的表達
2.5 Western blot 檢測核內 NF-κB 的表達
經 rhHMGB1 處理后，核內 NF-κB p65 蛋白表達較空白對照組增加。經肝素預處理后，核內 NF-κB p65 的含量明顯降低，肝素可抑制 HMGB1 介導的 NF-κB 核易位。結果見圖 4。
圖4
不同因素刺激 24 h 內皮細胞核內 NF-κB p65 的表達
3 討論
內皮細胞在許多生理功能中發揮重要作用，包括血管張力控制、細胞轉運、凝血平衡、水電解質滲透擴散、先天免疫和適應性免疫等[5]。血管內皮細胞間的連接主要有四種類型：緊密連接、粘附連接、縫隙連接和粘合體[6]。膿毒癥時，損傷的內皮細胞可大量釋放 HMGB1，釋放的 HMGB1 可活化內皮細胞中的 NF-κB 并促進其核易位，進而加重全身炎癥反應[7]。同時釋放的 HMGB1 通過誘導內皮細胞骨架肌動蛋白（F-actin）重組以及 ZO-1 和黏附連接蛋白（VE-cadherin）結構改變和表達變化，導致內皮細胞收縮、細胞間裂隙形成，引發內皮細胞通透性增高。其機制之一是通過糖基化終末產物受體（receptor of advanced glycation endproducts，RAGE）和 Src- 家族酪氨酸激酶通路發生作用，通過抑制其活性可減輕內皮形態結構損傷并改善其通透性[8]。因此，抑制 HMGB1 的活性并保護血管內皮屏障的完整性對膿毒癥來說是一個極具吸引力的治療策略。近年來對膿毒癥的研究表明，人血漿蛋白 Kallistatin、葒草素等均顯示出抗 HMGB1 活性，從而抑制膿毒癥時一系列炎癥反應，提高膿毒癥小鼠存活率[4,9]。而 HMGB1 最初是作為肝素結合蛋白而分離出來的，在其氨基末端有肝素結合的共有序列，表現出肝素結合活性[10]；動物及人體試驗均證實肝素可抑制膿毒癥時凝血級聯反應[11]，并具有廣泛的抗炎作用[12]。肝素與 HMGB1 結合后，可改變 HMGB1 的構象從而干擾 RAGE/HMGB1 的相互作用，降低 HMGB1 與 RAGE 的親和力[13-14]，從而抑制 NF-κB 核異位[15]，減輕炎癥反應，保護內皮細胞通透性等。
本研究運用 Transwell 細胞滲透性試驗測定內皮細胞屏障通透性。實驗觀察到，隨著 rhHMGB1 刺激時間的增加，FD40 滲透的熒光強度逐漸增加，于 12 h 和 24 h 時 HMGB1 處理組與 UFH 對照組和空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.05），證實了 HMGB1 可誘導內皮細胞屏障通透性增加；而經 UFH 預處理后與 rhHMGB1 共同孵育，12 h 和 24 h 時 FD40 滲透的熒光強度較 UFH 對照組及空白對照組明顯降低（P＜0.05），表明經 UFH 預處理后內皮細胞屏障通透性得到了改善，UFH 可改善 HMGB1 所致的內皮細胞屏障通透性增加。
內皮細胞間緊密連接表達和分布的改變可導致內皮細胞屏障通透性的增加。細胞間的緊密連接可調節細胞旁擴散，是內皮細胞屏障形成的關鍵[16]。內皮細胞之間的緊密連接還控制著血管內外物質的交換，防止血管內血液和其他成分的外漏。其中，緊密連接蛋白 ZO-1 可維持細胞與細胞間張力，是血管內皮屏障形成的重要蛋白之一[17]。本研究顯示，空白對照組緊密連接蛋白 ZO-1 呈圓環狀，完整，線條清晰。經 rhHMGB1（100 ng/ml） 處理后，ZO-1 環明顯不連續，密閉環減少及熒光強度明顯減弱。而 UFH 預處理組 ZO-1 熒光強度較 HMGB1 處理組明顯增強，密閉環明顯增多，線條更加清晰連續。運用 Western blot 法檢測 ZO-1 蛋白表達時也發現經 UFH 處理后，內皮細胞 ZO-1 的表達較單純 HMGB1 處理組明顯增多（P＜0.05），說明 UFH 可保護 HMGB1 所致的緊密連接蛋白 ZO-1 的破壞，使 ZO-1 表達增多。
NF-κB 是與炎癥反應密切相關的核轉錄因子[18]。現有證據表明 HMGB1 通過 RAGE 可激活 NF-κB、纖溶酶原激活抑制物、Rho 蛋白等，可引起內皮屏障損害而導致通透性增高[19]。UFH 對膿毒癥時內皮細胞屏障具有保護作用，其對血管系統的影響的具體機制并未完全明了。我們的研究顯示，rhHMGB1 刺激內皮細胞后，NF-κB 發生明顯的核易位，細胞核內 NF-κB 表達明顯增加；而 UFH 與 rhHMGB1 共同孵育后可抑制 rhHMGB1 的活性，抑制 NF-κB 的核易位，改善內皮細胞緊密連接蛋白 ZO-1 的分布和表達，從而保護內皮細胞屏障通透性。總之，本實驗為 UFH 治療膿毒癥微循環障礙的有效性提供了理論依據。
