引用本文： 趙艷雪, 李理, 袁偉鋒, 郭振輝, 黃文杰. 谷胱甘肽S轉移酶mu5對腫瘤壞死因子α誘導人支氣管上皮細胞氧化損傷的調節作用研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(3): 284-288. doi: 10.7507/1671-6205.2016066 復制
急性肺損傷(ALI)的本質是肺內過度失控的炎癥反應[1-2]。過度炎癥反應引發氧化應激狀態[3]，誘導細胞內源性活性氧(ROS)的生成量劇增，超過機體抗氧化系統的清除能力時，使機體處于氧化應激狀態，直接導致肺結構細胞損傷[4-5]，并且與炎癥損傷協同加重病情[6]。因此，下調炎癥激活的過度氧化應激可能有助于減輕肺結構細胞的損傷。谷胱甘肽S轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)是一組具有多種功能的催化氧化還原反應的酶，與其他抗氧化酶在細胞內共同起到清除活性氧，保護細胞免受氧化損傷的作用[7]。谷胱甘肽S轉移酶mu 5(GSTM5)是GST家族的成員，關于GSTM5在ALI時炎癥誘發的氧化應激過程中的作用研究不多。本研究以代表性的炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激人支氣管上皮16HBE細胞，在細胞上模擬ALI時的炎癥過程，并觀察其氧化應激程度的變化；同時，利用真核細胞表達載體技術增強16HBE細胞的GSTM5基因表達，探討該基因在TNF-α誘導的16HBE細胞氧化損傷中的作用及可能的機制，為ALI綜合治療提供實驗依據。
材料與方法
一 材料
16HBE細胞由廣州軍區總醫院醫學實驗科細胞庫提供；北美胎牛血清購于廣州博仁生物科技有限公司；RPMI-1640培養基、胰酶購于Hyclone公司；重組人TNF-α購自美國Pepro Tech公司；GSTM5-GV230-GFP質粒由上海吉凱基因技術有限公司構建；轉染試劑Lipofectamine2000TM購自Invitrogen公司；總抗氧化能力(T-AOC)活性檢測試劑盒及脂質氧化丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA法蛋白濃度測定試劑盒、MTT試劑盒購自江蘇碧云天公司；逆轉錄試劑購自TaKaRa公司；PCR試劑購自北京康為世紀公司；引物由上海英濰捷基公司合成；NADPH氧化酶(NOX)家族NOX1和NOX2抗體購自美國abcam公司；β-actin抗體購自武漢博士德公司。
二 方法
1．細胞培養：16HBE細胞在含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的培養箱中培養，2~3 d傳代1次，取處于對數生長期的細胞用于實驗。
2．模型構建及實驗分組：將細胞以2×105個/mL接種于6孔板，待貼壁細胞融合度達到70%更換為含GSTM5-GV230-GFP質粒脂質體(1 μg/mL)的無血清、無抗生素培養基培養6 h后，更換為完全培養基，待細胞狀態恢復良好后更換為含TNF-α(10 ng/mL)的無血清、無抗生素培養基繼續培養，24 h后收取培養細胞標本備檢。實驗分為4組：空白對照組(不加干預因素)，TNF-α組(僅用TNF-α刺激)，GSTM5質粒組(預轉染GSTM5-GV230-GFP質粒且用TNF-α刺激)，陰性對照組(預轉染空質粒且用TNF-α刺激)。
3．分光光度法檢測細胞脂質氧化程度(MDA含量)：采用玻璃勻漿器勻漿裂解細胞，BCA法定量蛋白濃度，按試劑盒說明書進行操作，應用酶標儀于532 nm測定各樣本吸光度，測得各樣本的MDA含量后，除以樣本的總蛋白含量，即“nmol/mg pro”來表示MDA水平。
4．分光光度法檢測細胞T-AOC：采用玻璃勻漿器勻漿裂解細胞，BCA法定量蛋白濃度，按試劑盒說明書進行操作，應用酶標儀于520 nm測定各樣本吸光度，測得各個樣本T-AOC后，再除以樣本的總蛋白含量，即“U/mg pro”來表示T-AOC水平。
5．MTT比色法檢測細胞存活率：將細胞以1×104個/mL接種于96孔板，按上述分組進行轉染和TNF-α干預后繼續培養24 h，終止培養前4 h每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，終止培養時加入100 μL Formazan溶解液，待紫色結晶完全溶解，酶標儀測定570 nm下各孔吸光度(A)值。細胞存活率=[實驗組/對照組]×100%。
6．RT-PCR法檢測NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、雙重氧化酶1(DUOX1)、DUOX2 mRNA的表達水平：Trizol法裂解各組細胞并提取細胞總RNA，分光光度計檢測RNA濃度及純度，逆轉錄反應體系(20 μL)：5×酶混合物4 μL，RNA 1 μg，RNAase Free dH2O補足至總體系20 μL。逆轉錄條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。PCR反應體系(25 μL)：2×含染料酶混合物12.5 μL，NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2及β-actin上下游引物各0.5 μL(共1.0 μL)，逆轉錄產物模板2 μL，超純水9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、相應退火溫度30 s、72 ℃ 30 s(循環35輪)，末次72 ℃延伸10 min。取5 μL產物進行1.0%瓊脂糖電泳，應用凝膠成像系統拍照。采用Gel-Pro analyzer 32軟件分析電泳條帶灰度值，計算目的基因與β-actin的比值以表示目的基因mRNA的相對表達量。相關引物序列及退火溫度見表 1。
表1
引物序列及退火溫度
7．蛋白質印跡法(Western blot)檢測NOX1、NOX2蛋白的表達水平：分別提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后，每份樣品取50 μg蛋白與5×SDS上樣緩沖液充分混勻，經95 ℃ 5 min變性后進行10% SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，以TBST洗膜3次，10 min/次，分別取一抗(抗體稀釋濃度：NOX1抗體1 :100，NOX2抗體1 :1 000，胞漿蛋白內參β-actin抗體1 :400)4 ℃孵育過夜，以TBST洗膜3次，10 min/次，辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗(1 :2 000)37 ℃孵育1 h，以TBST洗膜3次，10 min/次，ECL發光，MINICHEMI化學發光儀曝光。采用Gel-Pro analyzer 32軟件進行圖像灰度分析，分別計算NOX1、NOX2蛋白與β-actin的灰度比值，以表示NOX1、NOX2蛋白的相對表達量。
三 統計學處理
應用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料以x±s表示。數據均進行方差齊性檢驗，組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齊時多重比較采用LSD檢驗法，方差不齊時多重比較采用Dunnett′s T3檢驗法。P < 0.05為差異有統計學意義。
結果
一 細胞脂質氧化程度
TNF-α組16HBE細胞MDA水平較空白對照組顯著上調[(1.97±0.26) nmol/mg pro比(0.94±0.17)nmol/mg pro，P < 0.05]，與陰性對照組差異無統計學意義(P > 0.05)。GSTM5質粒組MDA水平較TNF-α組和陰性對照組顯著下調[(1.53±0.17)nmol/mg pro比(1.97±0.26) nmol/mg pro和(2.08±0.07) nmol/mg pro，P < 0.05]，仍高于空白對照組[(1.53±0.17) nmol/mg pro比(0.94±0.17) nmol/mg pro，P < 0.05)。結果見圖 1。
圖1
GSTM5高表達對16HBE細胞MDA和T-AOC水平的影響
與TNF-α組及陰性對照組比較，*
二 細胞內總抗氧化能力
TNF-α組T-AOC較空白對照組降低[(1.30±0.14) U/mg pro比(1.92±0.29) U/mg pro，P < 0.05]，與陰性對照組差異無統計學意義(P > 0.05)。GSTM5質粒組T-AOC較TNF-α組和陰性對照組顯著上調[(3.78±0.42) U/mg pro比(1.30±0.14) U/mg pro和(1.28±0.21) U/mg pro，P < 0.05]。結果見圖 1。
三 細胞存活率測定
TNF-α組細胞存活率較空白對照組顯著下調(56.31%±4.33%比99.20%±3.79%，P < 0.05)，與陰性對照組差異無統計學意義(P > 0.05)。GSTM5質粒組細胞存活率較TNF-α組、陰性對照組顯著升高(69.15%±9.23%比56.31%±4.33%和56.1%±5.22%，P < 0.05)，較空白對照組仍有明顯降低(69.15%±9.23%比99.20%±3.79%，P < 0.05)。結果見圖 2。
圖2
GSTM5高表達對16HBE細胞存活率的影響
與TNF-α組和陰性對照組比較，*
四 氧化相關基因轉錄水平的變化
RT-PCR的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后進行灰度分析，TNF-α組NOX1、NOX2 mRNA表達水平較空白對照組明顯增高(P < 0.05)。GSTM5質粒組較TNF-α組和陰性對照組顯著降低(P < 0.01)，NOX2 mRNA表達水平仍高于空白對照組(P<0.05)，NOX1 mRNA與空白對照組表達水平比較，差異無統計學意義(P > 0.05)。TNF-α組16HBE細胞NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表達水平與空白對照組比較，差異無統計學意義(P > 0.05)，GSTM5質粒組16HBE細胞NOX3，NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表達水平與TNF-α組、陰性對照組、空白對照組比較，差異無統計學意義(P > 0.05)。結果見表 2、圖 3和圖 4。
表2
各組細胞NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表達水平(n=3，x±s)
圖3
GSTM5高表達對NOX1、NOX2 mRNA轉錄水平的影響
與TNF-α組和陰性對照組比較，*
圖4
GSTM5高表達對NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA轉錄水平的影響
與TNF-α組和陰性對照組比較，*
五 NOX1、NOX2蛋白水平的變化
Western blot結果經灰度值分析后顯示：TNF-α組16HBE細胞NOX1、NOX 2蛋白表達較空白對照組明顯上調(0.99±0.05比0.60±0.08，1.03±0.13比0.66±0.12，P均 < 0.05)。GSTM5質粒組16HBE細胞NOX 1、NOX2蛋白表達水平較TNF-α組和陰性對照組降低(0.71±0.10比0.99±0.05、1.00±0.10，0.72±0.11比1.03±0.13、1.04±0.20，P均 < 0.05)，與空白對照組表達水平無顯著差異(0.71±0.10比0.60±0.08，0.72±0.11比0.66±0.12，P均 > 0.05)。結果見圖 5。
圖5
GSTM5高表達對NOX1和NOX2蛋白水平的影響
與TNF-α組和陰性對照組比較，*
討論
炎癥反應往往伴隨氧化應激，并且富含脂質的肺臟是過度氧化應激首先打擊的靶器官[8]。有研究表明，在ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液中檢出肺內皮細胞、肺泡細胞、氣道上皮細胞及肺泡巨噬細胞等產生的大量ROS，這些ROS可以通過改變基因和蛋白表達而影響ALI的發生和發展[9]。因此，針對ALI患者的肺組織保護，需要適當減少ROS的產生，減輕ROS對結構細胞的損傷。GST具有谷胱甘肽過氧化物酶活性，亦被稱為非硒谷胱甘肽過氧化物酶(non-SeGPx)，通過在分子之間轉巰基而發揮抗氧化活性，并因此具有修復遭到氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質等的功能，保護細胞免受氧化損傷[7]。GSTM5是GST家族的一個亞型。本研究小組前期對炎癥誘發的氧化應激調控的研究發現，GSTM5與NOX1啟動子間可能存在著相互作用[10]，這引起了我們對GSTM5的關注。GSTM5的抗氧化作用是其影響病理生理過程的機制之一，但關于GSTM5在ALI時炎癥誘發的氧化應激過程中作用的研究不多。因此，本研究采用TNF-α刺激人支氣管上皮16HBE細胞，在體外模擬ALI時肺結構細胞的炎癥損傷過程；同時應用真核細胞表達載體技術，觀察GSTM5對炎癥誘發的肺結構細胞氧化應激損傷的調節作用。
氧化應激時體內高活性分子如ROS產生過多，造成肺結構細胞氧化損傷，加重急性肺損傷[11]。MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的最終代謝產物，其濃度可反映自由基對組織細胞的損傷程度[5, 12-13]。T-AOC是一個體系內的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總的水平，其水平反映了體系總抗氧化能力。本研究結果顯示，單純以TNF-α刺激16HBE細胞，MDA濃度較空白對照組明顯升高(P < 0.05)，T-AOC能力降低(P < 0.05)，且細胞存活率下降(P < 0.05)。這說明TNF-α在其誘導的細胞炎癥過程中誘發了氧化應激反應和細胞的氧化損傷。GSTM5質粒轉染組的MDA濃度較TNF-α組降低(P < 0.05)，T-AOC能力顯著增高(P < 0.05)，細胞存活率回升(P < 0.05)。這提示增強GSTM5表達可有效下調炎癥反應誘發的氧化應激，減輕肺結構細胞的損傷，起到保護性的調控作用。
產生氧化損傷的關鍵是氧化酶的活化，有研究顯示NOX酶家族在ALI發生發展中發揮了重要作用[14-15]。本研究通過RT-PCR和Western blot檢測，發現TNF-α組NOX酶家族成員中的NOX1、NOX2基因的轉錄強度及蛋白表達水平較空白對照組有不同程度的增高(P < 0.05)，表明其參與了炎癥誘導的氧化損傷；而預轉染GSTM5質粒可有效下調上述基因的轉錄強度及蛋白表達水平(P < 0.05)，而NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2基因表達強度差異無統計學意義(P > 0.05)。以上結果提示GSTM5減輕氧化應激對肺結構細胞的損傷作用可能與下調NOX1、NOX2基因表達密切相關。
綜上所述，繼發于炎癥反應的氧化應激是肺結構細胞破壞的重要因素。GSTM5具有抗氧化能力，對炎癥誘發的支氣管上皮細胞的氧化應激損傷有保護作用，其機制可能與下調NOX1、NOX2基因表達，從而減少氧自由基的生成密切相關。此研究為ALI的綜合治療提供了有益的啟示。
急性肺損傷(ALI)的本質是肺內過度失控的炎癥反應[1-2]。過度炎癥反應引發氧化應激狀態[3]，誘導細胞內源性活性氧(ROS)的生成量劇增，超過機體抗氧化系統的清除能力時，使機體處于氧化應激狀態，直接導致肺結構細胞損傷[4-5]，并且與炎癥損傷協同加重病情[6]。因此，下調炎癥激活的過度氧化應激可能有助于減輕肺結構細胞的損傷。谷胱甘肽S轉移酶(glutathione-S-transferase，GST)是一組具有多種功能的催化氧化還原反應的酶，與其他抗氧化酶在細胞內共同起到清除活性氧，保護細胞免受氧化損傷的作用[7]。谷胱甘肽S轉移酶mu 5(GSTM5)是GST家族的成員，關于GSTM5在ALI時炎癥誘發的氧化應激過程中的作用研究不多。本研究以代表性的炎癥因子腫瘤壞死因子α(TNF-α)刺激人支氣管上皮16HBE細胞，在細胞上模擬ALI時的炎癥過程，并觀察其氧化應激程度的變化；同時，利用真核細胞表達載體技術增強16HBE細胞的GSTM5基因表達，探討該基因在TNF-α誘導的16HBE細胞氧化損傷中的作用及可能的機制，為ALI綜合治療提供實驗依據。
材料與方法
一 材料
16HBE細胞由廣州軍區總醫院醫學實驗科細胞庫提供；北美胎牛血清購于廣州博仁生物科技有限公司；RPMI-1640培養基、胰酶購于Hyclone公司；重組人TNF-α購自美國Pepro Tech公司；GSTM5-GV230-GFP質粒由上海吉凱基因技術有限公司構建；轉染試劑Lipofectamine2000TM購自Invitrogen公司；總抗氧化能力(T-AOC)活性檢測試劑盒及脂質氧化丙二醛(MDA)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所；BCA法蛋白濃度測定試劑盒、MTT試劑盒購自江蘇碧云天公司；逆轉錄試劑購自TaKaRa公司；PCR試劑購自北京康為世紀公司；引物由上海英濰捷基公司合成；NADPH氧化酶(NOX)家族NOX1和NOX2抗體購自美國abcam公司；β-actin抗體購自武漢博士德公司。
二 方法
1．細胞培養：16HBE細胞在含10%滅活胎牛血清的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下的培養箱中培養，2~3 d傳代1次，取處于對數生長期的細胞用于實驗。
2．模型構建及實驗分組：將細胞以2×105個/mL接種于6孔板，待貼壁細胞融合度達到70%更換為含GSTM5-GV230-GFP質粒脂質體(1 μg/mL)的無血清、無抗生素培養基培養6 h后，更換為完全培養基，待細胞狀態恢復良好后更換為含TNF-α(10 ng/mL)的無血清、無抗生素培養基繼續培養，24 h后收取培養細胞標本備檢。實驗分為4組：空白對照組(不加干預因素)，TNF-α組(僅用TNF-α刺激)，GSTM5質粒組(預轉染GSTM5-GV230-GFP質粒且用TNF-α刺激)，陰性對照組(預轉染空質粒且用TNF-α刺激)。
3．分光光度法檢測細胞脂質氧化程度(MDA含量)：采用玻璃勻漿器勻漿裂解細胞，BCA法定量蛋白濃度，按試劑盒說明書進行操作，應用酶標儀于532 nm測定各樣本吸光度，測得各樣本的MDA含量后，除以樣本的總蛋白含量，即“nmol/mg pro”來表示MDA水平。
4．分光光度法檢測細胞T-AOC：采用玻璃勻漿器勻漿裂解細胞，BCA法定量蛋白濃度，按試劑盒說明書進行操作，應用酶標儀于520 nm測定各樣本吸光度，測得各個樣本T-AOC后，再除以樣本的總蛋白含量，即“U/mg pro”來表示T-AOC水平。
5．MTT比色法檢測細胞存活率：將細胞以1×104個/mL接種于96孔板，按上述分組進行轉染和TNF-α干預后繼續培養24 h，終止培養前4 h每孔加入10 μL MTT溶液(5 mg/mL)，終止培養時加入100 μL Formazan溶解液，待紫色結晶完全溶解，酶標儀測定570 nm下各孔吸光度(A)值。細胞存活率=[實驗組/對照組]×100%。
6．RT-PCR法檢測NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、雙重氧化酶1(DUOX1)、DUOX2 mRNA的表達水平：Trizol法裂解各組細胞并提取細胞總RNA，分光光度計檢測RNA濃度及純度，逆轉錄反應體系(20 μL)：5×酶混合物4 μL，RNA 1 μg，RNAase Free dH2O補足至總體系20 μL。逆轉錄條件：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。PCR反應體系(25 μL)：2×含染料酶混合物12.5 μL，NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2及β-actin上下游引物各0.5 μL(共1.0 μL)，逆轉錄產物模板2 μL，超純水9.5 μL。PCR反應條件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、相應退火溫度30 s、72 ℃ 30 s(循環35輪)，末次72 ℃延伸10 min。取5 μL產物進行1.0%瓊脂糖電泳，應用凝膠成像系統拍照。采用Gel-Pro analyzer 32軟件分析電泳條帶灰度值，計算目的基因與β-actin的比值以表示目的基因mRNA的相對表達量。相關引物序列及退火溫度見表 1。
表1
引物序列及退火溫度
7．蛋白質印跡法(Western blot)檢測NOX1、NOX2蛋白的表達水平：分別提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后，每份樣品取50 μg蛋白與5×SDS上樣緩沖液充分混勻，經95 ℃ 5 min變性后進行10% SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉37 ℃封閉1 h，以TBST洗膜3次，10 min/次，分別取一抗(抗體稀釋濃度：NOX1抗體1 :100，NOX2抗體1 :1 000，胞漿蛋白內參β-actin抗體1 :400)4 ℃孵育過夜，以TBST洗膜3次，10 min/次，辣根過氧化物酶標記的抗兔二抗(1 :2 000)37 ℃孵育1 h，以TBST洗膜3次，10 min/次，ECL發光，MINICHEMI化學發光儀曝光。采用Gel-Pro analyzer 32軟件進行圖像灰度分析，分別計算NOX1、NOX2蛋白與β-actin的灰度比值，以表示NOX1、NOX2蛋白的相對表達量。
三 統計學處理
應用SPSS 13.0軟件進行統計學分析，計量資料以x±s表示。數據均進行方差齊性檢驗，組間均數比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)。方差齊時多重比較采用LSD檢驗法，方差不齊時多重比較采用Dunnett′s T3檢驗法。P < 0.05為差異有統計學意義。
結果
一 細胞脂質氧化程度
TNF-α組16HBE細胞MDA水平較空白對照組顯著上調[(1.97±0.26) nmol/mg pro比(0.94±0.17)nmol/mg pro，P < 0.05]，與陰性對照組差異無統計學意義(P > 0.05)。GSTM5質粒組MDA水平較TNF-α組和陰性對照組顯著下調[(1.53±0.17)nmol/mg pro比(1.97±0.26) nmol/mg pro和(2.08±0.07) nmol/mg pro，P < 0.05]，仍高于空白對照組[(1.53±0.17) nmol/mg pro比(0.94±0.17) nmol/mg pro，P < 0.05)。結果見圖 1。
圖1
GSTM5高表達對16HBE細胞MDA和T-AOC水平的影響
與TNF-α組及陰性對照組比較，*
二 細胞內總抗氧化能力
TNF-α組T-AOC較空白對照組降低[(1.30±0.14) U/mg pro比(1.92±0.29) U/mg pro，P < 0.05]，與陰性對照組差異無統計學意義(P > 0.05)。GSTM5質粒組T-AOC較TNF-α組和陰性對照組顯著上調[(3.78±0.42) U/mg pro比(1.30±0.14) U/mg pro和(1.28±0.21) U/mg pro，P < 0.05]。結果見圖 1。
三 細胞存活率測定
TNF-α組細胞存活率較空白對照組顯著下調(56.31%±4.33%比99.20%±3.79%，P < 0.05)，與陰性對照組差異無統計學意義(P > 0.05)。GSTM5質粒組細胞存活率較TNF-α組、陰性對照組顯著升高(69.15%±9.23%比56.31%±4.33%和56.1%±5.22%，P < 0.05)，較空白對照組仍有明顯降低(69.15%±9.23%比99.20%±3.79%，P < 0.05)。結果見圖 2。
圖2
GSTM5高表達對16HBE細胞存活率的影響
與TNF-α組和陰性對照組比較，*
四 氧化相關基因轉錄水平的變化
RT-PCR的擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后進行灰度分析，TNF-α組NOX1、NOX2 mRNA表達水平較空白對照組明顯增高(P < 0.05)。GSTM5質粒組較TNF-α組和陰性對照組顯著降低(P < 0.01)，NOX2 mRNA表達水平仍高于空白對照組(P<0.05)，NOX1 mRNA與空白對照組表達水平比較，差異無統計學意義(P > 0.05)。TNF-α組16HBE細胞NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表達水平與空白對照組比較，差異無統計學意義(P > 0.05)，GSTM5質粒組16HBE細胞NOX3，NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表達水平與TNF-α組、陰性對照組、空白對照組比較，差異無統計學意義(P > 0.05)。結果見表 2、圖 3和圖 4。
表2
各組細胞NOX1、NOX2、NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA表達水平(n=3，x±s)
圖3
GSTM5高表達對NOX1、NOX2 mRNA轉錄水平的影響
與TNF-α組和陰性對照組比較，*
圖4
GSTM5高表達對NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2 mRNA轉錄水平的影響
與TNF-α組和陰性對照組比較，*
五 NOX1、NOX2蛋白水平的變化
Western blot結果經灰度值分析后顯示：TNF-α組16HBE細胞NOX1、NOX 2蛋白表達較空白對照組明顯上調(0.99±0.05比0.60±0.08，1.03±0.13比0.66±0.12，P均 < 0.05)。GSTM5質粒組16HBE細胞NOX 1、NOX2蛋白表達水平較TNF-α組和陰性對照組降低(0.71±0.10比0.99±0.05、1.00±0.10，0.72±0.11比1.03±0.13、1.04±0.20，P均 < 0.05)，與空白對照組表達水平無顯著差異(0.71±0.10比0.60±0.08，0.72±0.11比0.66±0.12，P均 > 0.05)。結果見圖 5。
圖5
GSTM5高表達對NOX1和NOX2蛋白水平的影響
與TNF-α組和陰性對照組比較，*
討論
炎癥反應往往伴隨氧化應激，并且富含脂質的肺臟是過度氧化應激首先打擊的靶器官[8]。有研究表明，在ARDS患者的支氣管肺泡灌洗液中檢出肺內皮細胞、肺泡細胞、氣道上皮細胞及肺泡巨噬細胞等產生的大量ROS，這些ROS可以通過改變基因和蛋白表達而影響ALI的發生和發展[9]。因此，針對ALI患者的肺組織保護，需要適當減少ROS的產生，減輕ROS對結構細胞的損傷。GST具有谷胱甘肽過氧化物酶活性，亦被稱為非硒谷胱甘肽過氧化物酶(non-SeGPx)，通過在分子之間轉巰基而發揮抗氧化活性，并因此具有修復遭到氧化破壞的大分子如DNA、蛋白質等的功能，保護細胞免受氧化損傷[7]。GSTM5是GST家族的一個亞型。本研究小組前期對炎癥誘發的氧化應激調控的研究發現，GSTM5與NOX1啟動子間可能存在著相互作用[10]，這引起了我們對GSTM5的關注。GSTM5的抗氧化作用是其影響病理生理過程的機制之一，但關于GSTM5在ALI時炎癥誘發的氧化應激過程中作用的研究不多。因此，本研究采用TNF-α刺激人支氣管上皮16HBE細胞，在體外模擬ALI時肺結構細胞的炎癥損傷過程；同時應用真核細胞表達載體技術，觀察GSTM5對炎癥誘發的肺結構細胞氧化應激損傷的調節作用。
氧化應激時體內高活性分子如ROS產生過多，造成肺結構細胞氧化損傷，加重急性肺損傷[11]。MDA是自由基作用于脂質發生過氧化反應的最終代謝產物，其濃度可反映自由基對組織細胞的損傷程度[5, 12-13]。T-AOC是一個體系內的各種抗氧化大分子、抗氧化小分子和酶的總的水平，其水平反映了體系總抗氧化能力。本研究結果顯示，單純以TNF-α刺激16HBE細胞，MDA濃度較空白對照組明顯升高(P < 0.05)，T-AOC能力降低(P < 0.05)，且細胞存活率下降(P < 0.05)。這說明TNF-α在其誘導的細胞炎癥過程中誘發了氧化應激反應和細胞的氧化損傷。GSTM5質粒轉染組的MDA濃度較TNF-α組降低(P < 0.05)，T-AOC能力顯著增高(P < 0.05)，細胞存活率回升(P < 0.05)。這提示增強GSTM5表達可有效下調炎癥反應誘發的氧化應激，減輕肺結構細胞的損傷，起到保護性的調控作用。
產生氧化損傷的關鍵是氧化酶的活化，有研究顯示NOX酶家族在ALI發生發展中發揮了重要作用[14-15]。本研究通過RT-PCR和Western blot檢測，發現TNF-α組NOX酶家族成員中的NOX1、NOX2基因的轉錄強度及蛋白表達水平較空白對照組有不同程度的增高(P < 0.05)，表明其參與了炎癥誘導的氧化損傷；而預轉染GSTM5質粒可有效下調上述基因的轉錄強度及蛋白表達水平(P < 0.05)，而NOX3、NOX4、NOX5、DUOX1、DUOX2基因表達強度差異無統計學意義(P > 0.05)。以上結果提示GSTM5減輕氧化應激對肺結構細胞的損傷作用可能與下調NOX1、NOX2基因表達密切相關。
綜上所述，繼發于炎癥反應的氧化應激是肺結構細胞破壞的重要因素。GSTM5具有抗氧化能力，對炎癥誘發的支氣管上皮細胞的氧化應激損傷有保護作用，其機制可能與下調NOX1、NOX2基因表達，從而減少氧自由基的生成密切相關。此研究為ALI的綜合治療提供了有益的啟示。
