引用本文： 丁永杰, 張本炎, 李敏. 辛伐他汀早期與后期干預野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(1): 64-70. doi: 10.7507/1671-6205.201606049 復制
肺動脈高壓是一類以各種肺內或肺外疾病引起的，以肺動脈壓力和肺血管阻力進行性升高為特征，最終導致右心功能受損、甚至死亡的嚴重疾病，對人類健康造成了嚴重危害[1]。動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是肺動脈高壓最常見的類型。據美國國立衛生研究院登記資料顯示，特發性肺動脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者平均生存年限僅 2.8 年，而結締組織相關 PAH 則更差[2]。目前雖已有多種 PAH 靶向藥物及聯合治療模式先后問世，但相關藥物價格昂貴，使用不便，預后仍不盡理想[3]，3 年病死率仍維持在 20%～40%[4]。越來越多的研究發現，嚴重 PAH 具有類似腫瘤的不可逆的生長特征[5–6]，治療非常棘手。PAH 發病機制目前尚不明確，但血管收縮、血管重構和原位血栓形成被認為是 PAH 發生、發展的重要病理生理基礎；血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和血小板等細胞均參與其病理過程[7]。這些結果促使我們考慮目前 PAH 治療“時機”是否恰當，當前藥物選擇的“靶點”是否正確。推測如在血管內皮細胞發生破壞之前對血管內皮細胞實施干預保護，可能阻斷 PAH 的病理進程，延緩、減輕、甚至避免肺血管重構的發生。
他汀類藥物目前被廣泛用于調脂治療。由于其具有的抗炎、抗氧化、抗增殖、促凋亡等藥理作用，被認為具有內皮保護功能。動物實驗研究發現他汀類藥物可改善 PAH 動物模型的血流動力學狀態，并減輕血管重構[8–9]。臨床研究也發現在西地那非基礎上聯合他汀類藥物較西地那非單藥治療可獲得更明顯的臨床療效，且使用相當安全，預示著他汀類藥物在 PAH 中良好的應用前景[10]。但在上述所有研究中，他汀類均作為治療性藥物，在已經存在肺動脈高壓的動物或患者上使用。而他汀類是否可作為預防性藥物，在發生血管內皮細胞破壞之初即血管重構前應用，是否可獲得更大的效果，目前所完成的研究不能很好地回答。因此，我們設計此實驗，在野百合堿（MCT）誘導 PAH（MCT-PAH）大鼠模型的兩個階段，即血管重構形成前后，給予他汀類藥物，觀察大鼠一般情況、血流動力學參數及肺血管病理形態學變化，為今后制訂更合理的給藥方式提供依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 6 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠，體重 174～202 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，在上海瑞金醫院動物實驗室寄養，室溫保持在（23±1）℃，明暗 12 h 交替，飼料及飲水由動物實驗室提供。動物飼養符合《上海市實驗動物管理辦法》。
1.1.2 主要儀器 PE-50 聚乙烯導管（美國健康醫療器械國際公司）、三通旋塞（上海百特醫療用品貿易有限公司）、PowerLab 8/30 多導生理記錄儀及其配套的壓力換能器（澳大利亞埃德儀器國際貿易公司）、Image-pro plus 6.0 圖像分析系統（美國 Media Cybernetics 公司）
1.1.3 主要試劑 MCT（上海純優生物科技有限公司）、辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司）。
1.2 實驗分組和處理
SD 大鼠 24 只，隨機分成 4 個實驗組：對照組、PAH 組、早期干預組和后期干預組。每組 6 只。PAH 組、早期干預組、后期干預組大鼠予 MCT 50 mg/kg 一次性腹腔注射誘導大鼠形成 PAH，對照組一次性腹腔注射同等體積生理鹽水。早期干預組：將辛伐他汀研碎后，生理鹽水溶解配制成4 mg/ml 懸液，于 MCT 腹腔注射前 7 d 起每日予辛伐他汀（20 mg/kg）灌胃，造模當日暫停 1 次，造模次日起繼續灌胃至第 14 d（d–7～d–1，d1～d14），第15 d 起予以同等體積生理鹽水灌胃至第 35 d，共 21 d（d15～d35）。后期干預組：于 MCT 腹腔注射前7 d 起，予同等體積生理鹽水灌胃，造模當日暫停1 次，造模次日起繼續灌胃至第 14 d（d–7~d–1，d1～d14），造模第 15 d 起，每日予辛伐他汀（20 mg/kg）灌胃至第 35 d，共 14 d（d15～d35）。每日固定時間測量體重，按體重精確計量給藥。對照組：于造模前 7 d 天（d–7）起，每日給予同等體積生理鹽水灌胃，造模當日暫停灌胃 1 次，造模次日起繼續灌胃至第 35 d，共 42 d（d–7～d–1，d1～d35）。
1.3 檢測指標
1.3.1 血液動力學 大鼠以 10% 水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術臺上，常規氣管插管后，于大鼠頸部做正中切口，暴露右側頸外靜脈和頸總靜脈，右頸總靜脈下穿入 2 根 2–0 手術線備用，遠心端絲線結扎，近心端絲線用止血鉗夾持，并使右頸總靜脈近心端保持一定張力，以眼科剪于絲線結扎點近心 4 mm 處，向近心端 45° 角斜行剪開血管直徑的 1/3，迅速插入 PE-50 導管，緩慢向前推進導管，同時觀察生理記錄儀顯示屏上波形、壓力值及導管進入長度，以判斷是否進入右心室及肺動脈，如遇阻力，不可硬推，緩慢旋轉進入。當出現典型肺動脈壓力波形后，穩定 5 min 后記錄。
1.3.2 右心室肥厚指數（RVHI） 將完整心肺一同取出，游離心臟，沿房室溝剪去心房及大血管根部，沿后室壁溝將右心室游離壁分離，濾紙吸干水分，用電子天平稱量右心室游離壁質量（RV）及左心室加室間隔質量（LV+S），RV/（LV+S）作為 RVHI。
1.3.3 肺組織病理學 右肺中下部肺小動脈近乎上下垂直走向，沿水平面即垂直于肺小動脈走形方向，橫斷切下厚約 3 mm 肺組織，置入包埋盒，備 HE 染色用。邀請病理科醫師，顯微鏡下雙盲閱片，光鏡下（×400）觀察 HE 染色切片切片，隨機選取直徑 50～150 μm 范圍的肺小動脈 15 支，采用 Image-pro plus 6.0 圖像采集處理系統，計算肺小動脈中膜厚度（WT）和血管的外徑（ED）。根據公式（WT×2/ED×100%），計算出中膜厚度百分比（WT%）。每張 HE 染色切片隨機選取直徑 50～150 μm 肺小動脈 10 根，觀察小動脈周圍炎性細胞浸潤情況，按浸潤程度記分：0 分（無炎性細胞浸潤），1 分（炎性細胞浸潤血管壁周圍不超過 25%），2 分（炎性細胞浸潤血管壁周圍 25%～50%），3 分（炎性細胞浸潤血管壁周圍 50%～75%，4 分（炎性細胞浸潤血管壁周圍 75% 以上）。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差（ ）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠一般情況
各組所有動物均存活至第 5 周末，無自發性死亡。入組時（0 周）各組大鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）。從造模后第 7 d 起，PAH 組、后期干預組大鼠出現活動遲緩，毛色晦暗，進食減少，呼吸急促，體重增加不明顯。在 1、4、5 周時，早期干預組體重較對照組低，差異有統計學意義（P＜0.05），而在 2、3 周時差異無統計學意義（P＞0.05）。早期干預與 PAH 組比較，在 1～5 周時體重差異有統計學意義（P＜0.01）。早期干預組大鼠體重 1 周時高于后期干預組（P＜0.05），在 2～5 周時均顯著高于后期干預組大鼠（P＜0.01）。結果見表 1。提示辛伐他汀早期干預較后期干預能更顯著地改善 PAH 大鼠呼吸困難相關癥狀，更接近正常體重增加速度。
表1
各組大鼠不同時點體重變化比較（n=6，g，
）
2.2 mPAP、RVSP 及 RVHI 的改變
PAH 組大鼠與對照組大鼠比較，mPAP、RVSP、RVHI 均顯著升高，差異均具有顯著統計學意義（P＜0.01），提示造模成功；早期干預組大鼠與 PAH 組大鼠比較，mPAP、RVSP、RVHI 顯著降低（P＜0.01）。早期干預組大鼠與對照組大鼠比較，mPAP、RVSP 差異無統計學意義（P＞0.05），而 RVHI 差異有統計學意義（P＜0.05）。早期干預組與后期干預組間比較，mPAP、RVSP 均顯著降低（P＜0.05），而 RVHI 差異無統計學意義（P＞0.05）。后期干預組大鼠與 PAH 組大鼠比較，mPAP、RVSP、RVHI均有顯著變化（P均＜0.01）；后期干預組與對照組比較，mPAP、RVSP、RVHI均顯著升高（P＜0.01）。結果見表 2和圖 1。
表2
各組大鼠 RVSP、mPAP、RVHI、WT%、肺小動脈周圍炎癥評分的比較（n=6，
）
圖1
大鼠 mPAP 的變化 a. 對照組； b. PAH 組； c. 早期干預組； d. 后期干預組
2.3 肺小動脈 WT%
PAH 組肺小動脈中膜明顯增厚，WT% 較對照組明顯增加（P＜0.01）。早期干預組、后期干預組較對照組 WT% 顯著增加（P＜0.01），但較 PAH 組明顯降低（P＜0.01）。早期干預組與后期干預組間比較，WT% 顯著下降（P＜0.01）。結果見表 2和圖 2。
圖2
各組大鼠肺小動脈 HE 染色（×400） a. 對照組； b. PAH 組； c. 早期干預組； d. 后期干預組
2.4 肺小動脈周圍炎癥評分
對照組大鼠肺組織切片 HE 染色發現，肺小動脈周圍無明顯炎性細胞浸潤，血管周圍炎癥評分低。 PAH 組大鼠肺組織切片可見肺小動脈周圍有明顯的炎性細胞浸潤，血管周圍炎癥評分高于對照組（P＜0.05）。早期干預與后期干預組肺小動脈周圍可見較多炎性細胞浸潤，炎癥評分高于對照組（P＜0.05），但低于 PAH 組（P＜0.05）。早期干預組與后期干預組間比較，炎癥評分差異無統計學意義（P＜0.05）。結果見表 2。
3 討論
PAH 是由多種病因引起的、預后極差的一類疾病，臨床并不少見。以結締組織疾病為例，PAH 在混合型結締組織疾病和系統性硬化癥中的發病率分別可達到 23%～53% 和 12%～40%，在系統性紅斑狼瘡中為 4.3%～5.8%，而且隨著臨床檢測技術的提高，其檢出率有升高的趨勢[11]。PAH起病隱匿，早期易漏診或誤診，診斷時往往已發生了嚴重的血管重構，預后不佳。目前研究熱點主要集中在對肺血管重構形成后的干預，如臨床上使用的前列環素及其類似物、內皮肽 1 拮抗劑、5-酸二酯酶抑制劑等 PAH 靶向藥物。這些藥物雖可部分改善血流動力學狀態，甚至延長生存時間，但仍無法抑制和逆轉肺血管重構，致使疾病后期藥物效果不佳。另外 PAH 靶向藥物價格昂貴，給藥方式復雜，使得長期用藥及聯合用藥受到限制。截止目前，PAH 仍是一種無法治愈的“絕癥”。近期研究顯示，一旦肺血管發生明顯的血管重構，相關肺血管細胞往往具有類似腫瘤的生長特征[5–6]，使得治療非常棘手。因此，預防或減輕血管重構可能改變 PAH 的病理進程，是改善 PAH 患者預后的關鍵。致病因素，如缺氧、機械剪切力、炎癥、毒物等均可使肺血管內皮細胞結構、功能、代謝發生改變，導致血管舒張/收縮因子、促凝/抗凝因子、增殖/凋亡因子等多種血管活性物質失衡，成為肺血管重構的始動因素[12]。若早期通過保護血管內皮細胞，減輕各種致病因素對內皮細胞的影響，理論上可以延緩 PAH 的病理進程。
MCT-PAH 大鼠模型的嚴重程度及病理過程與人類 PAH 相似，目前被認為是 PAH 經典的動物模型[13]。雖然迄今尚不清楚其確切的機制，但血管內皮細胞損傷被認為起著關鍵作用[14]。MCT 進入體內后，代謝成為具有生物毒性的吡咯野百合堿，隨血流流經肺循環時可直接損傷肺血管內皮細胞。大量動物研究證實，MCT 給藥數小時后，肺血管內皮細胞即出現空泡變性，通透性增加，進而發生肺水腫；1 周時非肌型動脈發生肌化，肌型動脈血管平滑肌細胞（VSMC）明顯增生肥厚；第 14 d 時可形成 PAH，并持續進展，其嚴重程度與中膜肌層增生相一致[15–16]，進而出現右心肥大，最終死亡。內皮損傷破壞了內皮細胞的屏障作用以及內皮細胞和平滑肌細胞之間的肌-內皮連接，也破壞了血管內皮和肺循環所產生的血管活性物質之間的平衡以及內皮細胞對平滑肌細胞的調節，從而促使肺血管平滑肌細胞增殖，引起肺血管重構[17]。本研究采用 50 mg/kg MCT 一次性腹腔注射，給藥 7 d 后，PAH 組大鼠飲食、活動減少，體重上升緩慢，呼吸急促，提示肺動脈壓力可能此時發生改變；而給藥 35 d 后，PAH 組大鼠 mPAP、RVSP 及 RVHI 均較對照組顯著升高（P＜0.01），證實 MCT 注射 35 d 已產生嚴重 PAH，造模成功。
先前的動物研究已發現他汀類藥物具有的抗炎、抗氧化、介導細胞凋亡、抑制細胞過度增殖等生物學效應[18]，顯示了其在治療 PAH 方面具有一定的可行性。在抗炎層面，他汀類藥物通過抑制細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）、E-選擇素，抑制炎性細胞滲出、粘附、聚集；并可降低 γ 干擾素介導的 CD40 表達，調節內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和巨噬細胞的炎癥反應[18–20]。在血管內皮細胞層面，他汀類藥物通過抑制 Rho/ROCK 信號途徑，增加內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）mRNA 的穩定性[21]；同時可通過上調 PI3K 信號，快速活化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶 Akt，促進 eNOS 的表達和活化[22]；此外，他汀類藥物還可以解除小窩蛋白-1對eNOS的抑制作用[23]，增加 eNOS 的活性。上述途徑使得血管內皮細胞產生的 L-精氨酸在 eNOS 作用下產生 NO，彌散到平滑肌細胞，激活鳥苷酸環化酶，維護正常的血管內皮依賴性的舒縮調控功能，保護血管內膜結構完整性，避免原位血栓形成，維持血管內膜的非增殖狀態。他汀類藥物可部分上調環氧化酶-2（COX-2）表達，增加前列環素（PGI2）的產生[24]，而 PGI2 具有強大的擴張血管、抑制平滑肌細胞增殖和抑制血小板聚集的作用；他汀類藥物也可通過抑制氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）介導的內皮素-1（ET-1）的表達[25]，并影響血管緊張素Ⅱ和其Ⅰ型受體的功能，限制肺血管過度收縮[26]，并抑制肺動脈平滑肌細胞（PASMC）DNA 的合成及增殖。此外，他汀類藥物可通過下調血管內皮生長因子（VEGF）或其受體表達[27]，抑或通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK 通路）而抑制血管內皮細胞增殖[28–39]；或可誘導 Rac1 表達，進而增加應激活化蛋白激酶磷酸化，誘導各種細胞凋亡[30]。在血管平滑肌層面，除內皮細胞介導的間接影響外，他汀類藥物主要通過 Rho/ROCK 途徑直接調節 PASMC 的增生：他汀類藥物抑制 Rho GTPase，增加 p27Kipl 的表達，并通過類異戊二烯顯著抑制血小板源性生長因子（PDGF）誘導的 VSMC DNA 合成，使細胞周期停滯于 G0～G1 期，從而抑制 VSMC 的增殖和遷徙[31–33]；另外，他汀類藥物通過抑制 PASMC 的 GTP-RhoA 合成，抑制由 5-羥色胺介導的有絲分裂和遷移[34]。此外，可通過下調 bcl-2 和 Rho 異戊烯化誘導病態的 VSMC 凋亡[35]，或通過細胞外液鈣內流增加細胞溶質的游離 Ca2+ 濃度，隨后通過鈣依賴的 Caspase-3 誘導 VSMC 凋亡[36]。而在成纖維細胞層面，他汀類藥物減少 ET-1 和 PDGF 的生成，抑制成纖維細胞的有絲分裂，阻斷外膜的成纖維細胞向內皮細胞移行并轉變成類似平滑肌細胞，形成小動脈肌化，并通過降低 MAPK 活性，減少細胞外基質蛋白、彈性蛋白的合成及Ⅰ型膠原的沉積[37]。他汀類藥物還可通過抗氧化途徑減輕心肌肥厚[38]。他汀類藥物可影響 PAH 發生、形成、加重的各個階段，以及參與血管重構的各類細胞。
綜上所述，對于易發生肺血管內皮細胞破壞的 PAH 高危人群（如結締組織疾病、感染、藥物損害、IPAH 家族史等患者），可考慮早期預防性使用辛伐他汀，改善、延緩、甚至避免 PAH 的發生，但這一結論必須通過更大規模的臨床研究去進一步證實。
肺動脈高壓是一類以各種肺內或肺外疾病引起的，以肺動脈壓力和肺血管阻力進行性升高為特征，最終導致右心功能受損、甚至死亡的嚴重疾病，對人類健康造成了嚴重危害[1]。動脈型肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是肺動脈高壓最常見的類型。據美國國立衛生研究院登記資料顯示，特發性肺動脈高壓（idiopathic pulmonary arterial hypertension，IPAH）患者平均生存年限僅 2.8 年，而結締組織相關 PAH 則更差[2]。目前雖已有多種 PAH 靶向藥物及聯合治療模式先后問世，但相關藥物價格昂貴，使用不便，預后仍不盡理想[3]，3 年病死率仍維持在 20%～40%[4]。越來越多的研究發現，嚴重 PAH 具有類似腫瘤的不可逆的生長特征[5–6]，治療非常棘手。PAH 發病機制目前尚不明確，但血管收縮、血管重構和原位血栓形成被認為是 PAH 發生、發展的重要病理生理基礎；血管內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和血小板等細胞均參與其病理過程[7]。這些結果促使我們考慮目前 PAH 治療“時機”是否恰當，當前藥物選擇的“靶點”是否正確。推測如在血管內皮細胞發生破壞之前對血管內皮細胞實施干預保護，可能阻斷 PAH 的病理進程，延緩、減輕、甚至避免肺血管重構的發生。
他汀類藥物目前被廣泛用于調脂治療。由于其具有的抗炎、抗氧化、抗增殖、促凋亡等藥理作用，被認為具有內皮保護功能。動物實驗研究發現他汀類藥物可改善 PAH 動物模型的血流動力學狀態，并減輕血管重構[8–9]。臨床研究也發現在西地那非基礎上聯合他汀類藥物較西地那非單藥治療可獲得更明顯的臨床療效，且使用相當安全，預示著他汀類藥物在 PAH 中良好的應用前景[10]。但在上述所有研究中，他汀類均作為治療性藥物，在已經存在肺動脈高壓的動物或患者上使用。而他汀類是否可作為預防性藥物，在發生血管內皮細胞破壞之初即血管重構前應用，是否可獲得更大的效果，目前所完成的研究不能很好地回答。因此，我們設計此實驗，在野百合堿（MCT）誘導 PAH（MCT-PAH）大鼠模型的兩個階段，即血管重構形成前后，給予他汀類藥物，觀察大鼠一般情況、血流動力學參數及肺血管病理形態學變化，為今后制訂更合理的給藥方式提供依據。
1 材料與方法
1.1 材料
1.1.1 實驗動物 6 周齡 SPF 級雄性 SD 大鼠，體重 174～202 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供，在上海瑞金醫院動物實驗室寄養，室溫保持在（23±1）℃，明暗 12 h 交替，飼料及飲水由動物實驗室提供。動物飼養符合《上海市實驗動物管理辦法》。
1.1.2 主要儀器 PE-50 聚乙烯導管（美國健康醫療器械國際公司）、三通旋塞（上海百特醫療用品貿易有限公司）、PowerLab 8/30 多導生理記錄儀及其配套的壓力換能器（澳大利亞埃德儀器國際貿易公司）、Image-pro plus 6.0 圖像分析系統（美國 Media Cybernetics 公司）
1.1.3 主要試劑 MCT（上海純優生物科技有限公司）、辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司）。
1.2 實驗分組和處理
SD 大鼠 24 只，隨機分成 4 個實驗組：對照組、PAH 組、早期干預組和后期干預組。每組 6 只。PAH 組、早期干預組、后期干預組大鼠予 MCT 50 mg/kg 一次性腹腔注射誘導大鼠形成 PAH，對照組一次性腹腔注射同等體積生理鹽水。早期干預組：將辛伐他汀研碎后，生理鹽水溶解配制成4 mg/ml 懸液，于 MCT 腹腔注射前 7 d 起每日予辛伐他汀（20 mg/kg）灌胃，造模當日暫停 1 次，造模次日起繼續灌胃至第 14 d（d–7～d–1，d1～d14），第15 d 起予以同等體積生理鹽水灌胃至第 35 d，共 21 d（d15～d35）。后期干預組：于 MCT 腹腔注射前7 d 起，予同等體積生理鹽水灌胃，造模當日暫停1 次，造模次日起繼續灌胃至第 14 d（d–7~d–1，d1～d14），造模第 15 d 起，每日予辛伐他汀（20 mg/kg）灌胃至第 35 d，共 14 d（d15～d35）。每日固定時間測量體重，按體重精確計量給藥。對照組：于造模前 7 d 天（d–7）起，每日給予同等體積生理鹽水灌胃，造模當日暫停灌胃 1 次，造模次日起繼續灌胃至第 35 d，共 42 d（d–7～d–1，d1～d35）。
1.3 檢測指標
1.3.1 血液動力學 大鼠以 10% 水合氯醛（4 ml/kg）腹腔注射麻醉后，固定于手術臺上，常規氣管插管后，于大鼠頸部做正中切口，暴露右側頸外靜脈和頸總靜脈，右頸總靜脈下穿入 2 根 2–0 手術線備用，遠心端絲線結扎，近心端絲線用止血鉗夾持，并使右頸總靜脈近心端保持一定張力，以眼科剪于絲線結扎點近心 4 mm 處，向近心端 45° 角斜行剪開血管直徑的 1/3，迅速插入 PE-50 導管，緩慢向前推進導管，同時觀察生理記錄儀顯示屏上波形、壓力值及導管進入長度，以判斷是否進入右心室及肺動脈，如遇阻力，不可硬推，緩慢旋轉進入。當出現典型肺動脈壓力波形后，穩定 5 min 后記錄。
1.3.2 右心室肥厚指數（RVHI） 將完整心肺一同取出，游離心臟，沿房室溝剪去心房及大血管根部，沿后室壁溝將右心室游離壁分離，濾紙吸干水分，用電子天平稱量右心室游離壁質量（RV）及左心室加室間隔質量（LV+S），RV/（LV+S）作為 RVHI。
1.3.3 肺組織病理學 右肺中下部肺小動脈近乎上下垂直走向，沿水平面即垂直于肺小動脈走形方向，橫斷切下厚約 3 mm 肺組織，置入包埋盒，備 HE 染色用。邀請病理科醫師，顯微鏡下雙盲閱片，光鏡下（×400）觀察 HE 染色切片切片，隨機選取直徑 50～150 μm 范圍的肺小動脈 15 支，采用 Image-pro plus 6.0 圖像采集處理系統，計算肺小動脈中膜厚度（WT）和血管的外徑（ED）。根據公式（WT×2/ED×100%），計算出中膜厚度百分比（WT%）。每張 HE 染色切片隨機選取直徑 50～150 μm 肺小動脈 10 根，觀察小動脈周圍炎性細胞浸潤情況，按浸潤程度記分：0 分（無炎性細胞浸潤），1 分（炎性細胞浸潤血管壁周圍不超過 25%），2 分（炎性細胞浸潤血管壁周圍 25%～50%），3 分（炎性細胞浸潤血管壁周圍 50%～75%，4 分（炎性細胞浸潤血管壁周圍 75% 以上）。
1.4 統計學方法
采用 SPSS 17.0 軟件進行統計學分析，數據以均數±標準差（ ）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 大鼠一般情況
各組所有動物均存活至第 5 周末，無自發性死亡。入組時（0 周）各組大鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）。從造模后第 7 d 起，PAH 組、后期干預組大鼠出現活動遲緩，毛色晦暗，進食減少，呼吸急促，體重增加不明顯。在 1、4、5 周時，早期干預組體重較對照組低，差異有統計學意義（P＜0.05），而在 2、3 周時差異無統計學意義（P＞0.05）。早期干預與 PAH 組比較，在 1～5 周時體重差異有統計學意義（P＜0.01）。早期干預組大鼠體重 1 周時高于后期干預組（P＜0.05），在 2～5 周時均顯著高于后期干預組大鼠（P＜0.01）。結果見表 1。提示辛伐他汀早期干預較后期干預能更顯著地改善 PAH 大鼠呼吸困難相關癥狀，更接近正常體重增加速度。
表1
各組大鼠不同時點體重變化比較（n=6，g，
）
2.2 mPAP、RVSP 及 RVHI 的改變
PAH 組大鼠與對照組大鼠比較，mPAP、RVSP、RVHI 均顯著升高，差異均具有顯著統計學意義（P＜0.01），提示造模成功；早期干預組大鼠與 PAH 組大鼠比較，mPAP、RVSP、RVHI 顯著降低（P＜0.01）。早期干預組大鼠與對照組大鼠比較，mPAP、RVSP 差異無統計學意義（P＞0.05），而 RVHI 差異有統計學意義（P＜0.05）。早期干預組與后期干預組間比較，mPAP、RVSP 均顯著降低（P＜0.05），而 RVHI 差異無統計學意義（P＞0.05）。后期干預組大鼠與 PAH 組大鼠比較，mPAP、RVSP、RVHI均有顯著變化（P均＜0.01）；后期干預組與對照組比較，mPAP、RVSP、RVHI均顯著升高（P＜0.01）。結果見表 2和圖 1。
表2
各組大鼠 RVSP、mPAP、RVHI、WT%、肺小動脈周圍炎癥評分的比較（n=6，
）
圖1
大鼠 mPAP 的變化 a. 對照組； b. PAH 組； c. 早期干預組； d. 后期干預組
2.3 肺小動脈 WT%
PAH 組肺小動脈中膜明顯增厚，WT% 較對照組明顯增加（P＜0.01）。早期干預組、后期干預組較對照組 WT% 顯著增加（P＜0.01），但較 PAH 組明顯降低（P＜0.01）。早期干預組與后期干預組間比較，WT% 顯著下降（P＜0.01）。結果見表 2和圖 2。
圖2
各組大鼠肺小動脈 HE 染色（×400） a. 對照組； b. PAH 組； c. 早期干預組； d. 后期干預組
2.4 肺小動脈周圍炎癥評分
對照組大鼠肺組織切片 HE 染色發現，肺小動脈周圍無明顯炎性細胞浸潤，血管周圍炎癥評分低。 PAH 組大鼠肺組織切片可見肺小動脈周圍有明顯的炎性細胞浸潤，血管周圍炎癥評分高于對照組（P＜0.05）。早期干預與后期干預組肺小動脈周圍可見較多炎性細胞浸潤，炎癥評分高于對照組（P＜0.05），但低于 PAH 組（P＜0.05）。早期干預組與后期干預組間比較，炎癥評分差異無統計學意義（P＜0.05）。結果見表 2。
3 討論
PAH 是由多種病因引起的、預后極差的一類疾病，臨床并不少見。以結締組織疾病為例，PAH 在混合型結締組織疾病和系統性硬化癥中的發病率分別可達到 23%～53% 和 12%～40%，在系統性紅斑狼瘡中為 4.3%～5.8%，而且隨著臨床檢測技術的提高，其檢出率有升高的趨勢[11]。PAH起病隱匿，早期易漏診或誤診，診斷時往往已發生了嚴重的血管重構，預后不佳。目前研究熱點主要集中在對肺血管重構形成后的干預，如臨床上使用的前列環素及其類似物、內皮肽 1 拮抗劑、5-酸二酯酶抑制劑等 PAH 靶向藥物。這些藥物雖可部分改善血流動力學狀態，甚至延長生存時間，但仍無法抑制和逆轉肺血管重構，致使疾病后期藥物效果不佳。另外 PAH 靶向藥物價格昂貴，給藥方式復雜，使得長期用藥及聯合用藥受到限制。截止目前，PAH 仍是一種無法治愈的“絕癥”。近期研究顯示，一旦肺血管發生明顯的血管重構，相關肺血管細胞往往具有類似腫瘤的生長特征[5–6]，使得治療非常棘手。因此，預防或減輕血管重構可能改變 PAH 的病理進程，是改善 PAH 患者預后的關鍵。致病因素，如缺氧、機械剪切力、炎癥、毒物等均可使肺血管內皮細胞結構、功能、代謝發生改變，導致血管舒張/收縮因子、促凝/抗凝因子、增殖/凋亡因子等多種血管活性物質失衡，成為肺血管重構的始動因素[12]。若早期通過保護血管內皮細胞，減輕各種致病因素對內皮細胞的影響，理論上可以延緩 PAH 的病理進程。
MCT-PAH 大鼠模型的嚴重程度及病理過程與人類 PAH 相似，目前被認為是 PAH 經典的動物模型[13]。雖然迄今尚不清楚其確切的機制，但血管內皮細胞損傷被認為起著關鍵作用[14]。MCT 進入體內后，代謝成為具有生物毒性的吡咯野百合堿，隨血流流經肺循環時可直接損傷肺血管內皮細胞。大量動物研究證實，MCT 給藥數小時后，肺血管內皮細胞即出現空泡變性，通透性增加，進而發生肺水腫；1 周時非肌型動脈發生肌化，肌型動脈血管平滑肌細胞（VSMC）明顯增生肥厚；第 14 d 時可形成 PAH，并持續進展，其嚴重程度與中膜肌層增生相一致[15–16]，進而出現右心肥大，最終死亡。內皮損傷破壞了內皮細胞的屏障作用以及內皮細胞和平滑肌細胞之間的肌-內皮連接，也破壞了血管內皮和肺循環所產生的血管活性物質之間的平衡以及內皮細胞對平滑肌細胞的調節，從而促使肺血管平滑肌細胞增殖，引起肺血管重構[17]。本研究采用 50 mg/kg MCT 一次性腹腔注射，給藥 7 d 后，PAH 組大鼠飲食、活動減少，體重上升緩慢，呼吸急促，提示肺動脈壓力可能此時發生改變；而給藥 35 d 后，PAH 組大鼠 mPAP、RVSP 及 RVHI 均較對照組顯著升高（P＜0.01），證實 MCT 注射 35 d 已產生嚴重 PAH，造模成功。
先前的動物研究已發現他汀類藥物具有的抗炎、抗氧化、介導細胞凋亡、抑制細胞過度增殖等生物學效應[18]，顯示了其在治療 PAH 方面具有一定的可行性。在抗炎層面，他汀類藥物通過抑制細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、血管細胞粘附分子-1（VCAM-1）、E-選擇素，抑制炎性細胞滲出、粘附、聚集；并可降低 γ 干擾素介導的 CD40 表達，調節內皮細胞、平滑肌細胞、成纖維細胞和巨噬細胞的炎癥反應[18–20]。在血管內皮細胞層面，他汀類藥物通過抑制 Rho/ROCK 信號途徑，增加內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）mRNA 的穩定性[21]；同時可通過上調 PI3K 信號，快速活化絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶 Akt，促進 eNOS 的表達和活化[22]；此外，他汀類藥物還可以解除小窩蛋白-1對eNOS的抑制作用[23]，增加 eNOS 的活性。上述途徑使得血管內皮細胞產生的 L-精氨酸在 eNOS 作用下產生 NO，彌散到平滑肌細胞，激活鳥苷酸環化酶，維護正常的血管內皮依賴性的舒縮調控功能，保護血管內膜結構完整性，避免原位血栓形成，維持血管內膜的非增殖狀態。他汀類藥物可部分上調環氧化酶-2（COX-2）表達，增加前列環素（PGI2）的產生[24]，而 PGI2 具有強大的擴張血管、抑制平滑肌細胞增殖和抑制血小板聚集的作用；他汀類藥物也可通過抑制氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）介導的內皮素-1（ET-1）的表達[25]，并影響血管緊張素Ⅱ和其Ⅰ型受體的功能，限制肺血管過度收縮[26]，并抑制肺動脈平滑肌細胞（PASMC）DNA 的合成及增殖。此外，他汀類藥物可通過下調血管內皮生長因子（VEGF）或其受體表達[27]，抑或通過抑制絲裂原活化蛋白激酶（MAPK 通路）而抑制血管內皮細胞增殖[28–39]；或可誘導 Rac1 表達，進而增加應激活化蛋白激酶磷酸化，誘導各種細胞凋亡[30]。在血管平滑肌層面，除內皮細胞介導的間接影響外，他汀類藥物主要通過 Rho/ROCK 途徑直接調節 PASMC 的增生：他汀類藥物抑制 Rho GTPase，增加 p27Kipl 的表達，并通過類異戊二烯顯著抑制血小板源性生長因子（PDGF）誘導的 VSMC DNA 合成，使細胞周期停滯于 G0～G1 期，從而抑制 VSMC 的增殖和遷徙[31–33]；另外，他汀類藥物通過抑制 PASMC 的 GTP-RhoA 合成，抑制由 5-羥色胺介導的有絲分裂和遷移[34]。此外，可通過下調 bcl-2 和 Rho 異戊烯化誘導病態的 VSMC 凋亡[35]，或通過細胞外液鈣內流增加細胞溶質的游離 Ca2+ 濃度，隨后通過鈣依賴的 Caspase-3 誘導 VSMC 凋亡[36]。而在成纖維細胞層面，他汀類藥物減少 ET-1 和 PDGF 的生成，抑制成纖維細胞的有絲分裂，阻斷外膜的成纖維細胞向內皮細胞移行并轉變成類似平滑肌細胞，形成小動脈肌化，并通過降低 MAPK 活性，減少細胞外基質蛋白、彈性蛋白的合成及Ⅰ型膠原的沉積[37]。他汀類藥物還可通過抗氧化途徑減輕心肌肥厚[38]。他汀類藥物可影響 PAH 發生、形成、加重的各個階段，以及參與血管重構的各類細胞。
綜上所述，對于易發生肺血管內皮細胞破壞的 PAH 高危人群（如結締組織疾病、感染、藥物損害、IPAH 家族史等患者），可考慮早期預防性使用辛伐他汀，改善、延緩、甚至避免 PAH 的發生，但這一結論必須通過更大規模的臨床研究去進一步證實。
