引用本文： 劉宏, 范曉枝, 田新強, 李冰. 急性呼吸窘迫綜合征大鼠血小板 MKK3磷酸化水平變化初探. 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(1): 60-63. doi: 10.7507/1671-6205.201608019 復制
作為臨床常見急危重病癥之一的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），因嚴重威脅人類健康，近五十年來一直是醫學界研究的熱點之一，但迄今為止其具體的發病機制仍不十分清楚。本課題組在既往研究中發現，ARDS 時血小板被激活并可能在 ARDS 發病中起重要作用[1]。近年來，有關絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路的研究備受關注。本研究在既往研究基礎上，探討 ARDS 時血小板中 MAPKs 信號通路的變化，進而探討 ARDS 時血小板活化的信號通路和 ARDS 發病的分子機制。
1 材料與方法
1.1 ARDS 動物模型制備
取體重 250～400 g 的健康 SD 大鼠 30 只，隨機分為 5 組，每組 6 只。實驗組（OA 組）4 組，尾靜脈注射油酸（分析純，天津市風船化學試劑公司產品）0.25 ml/kg 制備 ARDS 模型。對照組（NS組）1 組，尾靜脈注射等量生理鹽水。在 OA 組注射油酸后 2、6、24、72 h，對照組注射生理鹽水后 2 h，處死動物，取樣檢測。
1.2 檢測指標
1.2.1 大鼠肺濕/干重比值 大鼠處死后，立即開胸取肺做大體觀察，稱肺重并計算肺系數（肺系數=肺重/體重×100%）。右肺稱重后置 80 ℃ 烤箱內烘干至恒重，計算肺濕/干重比值。
1.2.2 肺部病理學檢查 左肺置 10% 福爾馬林溶液中固定 1 周后，按常規病理學方法切片，HE 染色，光鏡觀察。
1.2.3 血小板內 MKK3 磷酸化水平 用 Western blot 技術檢測血小板內絲裂原活化蛋白激酶激酶 3（MKK3）磷酸化水平。在注射油酸后各時間點，從動物腹主動脈采血（10±1）ml，分離血小板，提取血小板蛋白。用考馬斯亮藍測血小板蛋白濃度，按預定的量取制備好的蛋白樣品，加入等量的 5 × 的加樣緩沖液混勻，94 ℃ 加熱 5 min，蛋白每孔加樣 30 μg，行 SDS-PAGE 電泳（5% 濃縮膠/10% 分離膠），然后將蛋白轉移至 PVDF 膜（160 mA，2 h），轉印后的 PVDF 膜用 TBS 漂洗后，置于 10% 脫脂奶粉抗體封閉液室溫搖床封閉 2 h；按 1∶1 000 比例用 TBS 緩沖液稀釋一抗（兔抗鼠），室溫下在搖床上孵育 30 min 后，置于 4 ℃ 冰箱中孵育過夜；次日從 4 ℃ 冰箱拿出后，室溫下搖床上再孵育 30 min；用含 0.05% Tween-20 的緩沖液（TBST）洗膜（10 min×3 次）；按 1∶2 000 比例用 TBS 緩沖液稀釋二抗（羊抗兔），室溫下孵育 2 h；用 TBST 洗膜（10 min×3 次）；用 BIO-RAD GelDocTM XR+成像系統進行化學發光法顯色成像；應用掃描系統的分析軟件（ImageLab，Bio-Rad 公司）測定目標蛋白灰度值。根據蛋白印跡條帶的灰度值，分別計算每個蛋白的磷酸化比值（pJNK 磷酸化灰度/JNK 總蛋白灰度）。
1.3 統計學方法
實驗數據均用均數 ± 標準差（ ）表示，應用 Graphpad Prism 統計學專用軟件對各實驗數據進行分析，各組間比較采用單因素方差分析，對差異顯著者用 Newman-Kuelsq 檢驗進行兩兩比較，同組數據不同時間點的比較采用配對t 檢驗。檢驗水準 α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 動物全身狀況
實驗組大鼠在注射油酸后 2 ～ 3 min 即開始出現呼吸困難，呼吸幅度增大，癱軟無力，活動減少，行走時呈爬行步態，進飲食減少。24 h 后動物一般狀態好轉；至 72 h，活動基本恢復正常。對照組無異常變化。
2.2 動物肺系數和肺濕/干重比值
動物肺系數和肺濕/干重比值變化見表 1。從表中可見，注射油酸后 2～24 h，實驗組動物肺重、肺系數和肺濕/干重比值均有不同程度增加，以 2 h 最嚴重。對照組上述各項均無異常變化。
表1
各組動物肺系數和肺濕/干重比值（n=6，
）
2.3 肺組織病理學
肉眼觀察見對照組大鼠肺臟大小正常，表面光滑，粉紅色，紋理清晰；而 2 ～24 h 實驗組雙肺體積增大且重量增加，表面從鮮紅色逐漸變為深紅色、紫紅色花斑狀；72 h 實驗組肺腫脹消失并有輕度萎縮，彈性差，外觀呈灰白色（圖 1）。
圖1
肺組織肉眼觀察 a. 對照組； b. OA 2 h 組； c. OA 6 h 組； d. OA 24 h 組； e. OA 72 h 組
光鏡下，對照組肺組織結構清晰，肺泡腔內無液體滲出及細胞浸潤（圖 2a）；2～6 h 實驗組肺泡內可見多量染色粉紅均一的液體滲出，輕重不一的肺泡和肺間質出血、炎細胞浸潤、小血管擴張和充血；6 h 實驗組肺泡內有透明膜形成；24 h 實驗組肺泡內液體滲出減輕，肺泡、肺間隔出血和炎細胞浸潤加重，肺組織實變，肺組織正常結構消失；72 h實驗組肺泡腔液體滲出吸收，肺泡腔萎陷；肺泡隔增厚，膠原纖維組織增生，微血栓形成（圖 2b～2f）。
圖2
肺組織病理像 a. 對照組：肺組織結構清晰，肺泡腔內無液體滲出和細胞浸潤（HE ×200）； b. OA 2 h 組：肺泡內有多量粉紅色液體滲出，肺泡隔有出血，小血管充血（HE×200）； c. OA 6 h 組：肺泡腔內大量粉紅色液體滲出，形成透明膜（HE ×200）；d. OA 24 h 組：肺泡腔和肺間質有大量出血和炎細胞浸潤，肺組織實變（HE×200）； e. OA 72 h 組：肺泡腔萎陷，肺泡隔增厚，膠原纖維組織增生（HE ×200）； f. OA 72 h 組：肺泡腔縮小，肺微血栓形成（HE ×400）
2.4 血小板內 MKK3 磷酸化水平
各組動物血小板 MKK3 磷酸化水平見圖 3。與對照組比較，6～72 h 實驗組大鼠血小板內蛋白激酶 MKK3 磷酸化水平明顯增高（P＜0.05），其中 6 h 組為對照組的 2.4 倍（0.50±0.09vs. 0.21±0.05）；24 h 組表達量最高（0.78±0.06），為對照組的 3.7 倍；72 h 組稍有回落（0.75±0.13），但仍明顯高于對照組。
圖3
各組大鼠血小板 MKK3 磷酸化水平
3 討論
ARDS 是臨床各科常見急危重病癥，早期階段或輕癥曾被稱為急性肺損傷（ALI）。在美國，每年發病約 20 萬例，死亡率接近 50%[2]。它可由感染、創傷、有害氣體或液體吸入等多種病因引起，但詳細發病機制尚不清楚。
血小板是血液系統的有形成分之一，主要功能是止血，防止創傷后血液的大量丟失。近年科學界對血小板的功能特性有了不少新的發現，了解到血小板在呼吸系統生理和病理生理的分子和細胞生物學中起重要作用[3]。除參與止血及血栓形成外，血小板還參與免疫、炎癥、動脈硬化、血管生成、淋巴管發育、腫瘤生長及轉移等病理過程[4-7]。血小板能表達多種免疫受體（如 CD14、TLRs、FcR、CD40 等），釋放大量接近活化的細胞因子（如 IL-1β、MCP-1、TGF-β、CD40L、RANTES 等）。這些受體、細胞因子共同參與，使血小板吸引白細胞到血管損傷點，釋放炎性因子，產生微顆粒物質，誘發凝血酶的生成。研究已證明這些過程對膿毒癥、動脈粥樣硬化、肝炎、急性肺損傷、血管再狹窄和移植排斥反應等疾患的發病過程至關重要[5]。
近年研究發現，在生理狀態和在 ARDS 時，血小板、血小板前體與肺有多個級別的交互活動，血小板在 ARDS 時發生活化并可能在 ARDS 發病中起重要作用[3,8-9]，但血小板活化的具體機制和信號傳導通路仍不清楚。MAPKs 信號通路是細胞跨膜信號轉導過程中具有至關重要作用的信號轉導系統，由一大群絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成。該信號通路存在于許多細胞內，在細胞外刺激信號向細胞及其核內轉導并引起細胞發生生物學反應的過程中起重要作用。在高等哺乳類動物的細胞內主要有 3 條并行的三級聯的 MAPKs 信號通路：細胞外調節的蛋白激酶（ERKs）信號通路，c-Jun 氨基末端蛋白激酶（JNKs）信號通路，以及 p38 蛋白激酶（p38 kinase，p38 MAPK）信號通路。不同的細胞外刺激使用的通路不同，通過各條通路的相互調控而介導不同的細胞生物學反應。
MKK3 是 MAPKs 信號轉導通路系統中 p38 MAPK 通路上第二級聯的一個重要蛋白激酶，它是 p38 MAPK 的上游蛋白激酶，可特異性地激活 p38 MAPK[10]。目前有關 ARDS 時血液循環中血小板內 MKK 3 -p38 MAPK 信號轉導通路的研究報道罕見。本研究結果顯示，6 ～72 h 實驗組動物血液循環中血小板內 MKK3 磷酸化水平明顯增高，在 24 h 組表達量最高（P＜0.05）。實驗結果說明，ARDS 時有血小板內 MKK3-p38 MAPK 信號轉導通路的啟動；該信號轉導通路的啟動可能與血小板的活化有關。MAPKs 信號通路是一個十分復雜的信號轉導系統，本研究只是對 ARDS 時血小板中 MAPKs 信號通路變化的初步探索，今后還需要做大量的實驗研究來進行深入探討。
作為臨床常見急危重病癥之一的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），因嚴重威脅人類健康，近五十年來一直是醫學界研究的熱點之一，但迄今為止其具體的發病機制仍不十分清楚。本課題組在既往研究中發現，ARDS 時血小板被激活并可能在 ARDS 發病中起重要作用[1]。近年來，有關絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信號通路的研究備受關注。本研究在既往研究基礎上，探討 ARDS 時血小板中 MAPKs 信號通路的變化，進而探討 ARDS 時血小板活化的信號通路和 ARDS 發病的分子機制。
1 材料與方法
1.1 ARDS 動物模型制備
取體重 250～400 g 的健康 SD 大鼠 30 只，隨機分為 5 組，每組 6 只。實驗組（OA 組）4 組，尾靜脈注射油酸（分析純，天津市風船化學試劑公司產品）0.25 ml/kg 制備 ARDS 模型。對照組（NS組）1 組，尾靜脈注射等量生理鹽水。在 OA 組注射油酸后 2、6、24、72 h，對照組注射生理鹽水后 2 h，處死動物，取樣檢測。
1.2 檢測指標
1.2.1 大鼠肺濕/干重比值 大鼠處死后，立即開胸取肺做大體觀察，稱肺重并計算肺系數（肺系數=肺重/體重×100%）。右肺稱重后置 80 ℃ 烤箱內烘干至恒重，計算肺濕/干重比值。
1.2.2 肺部病理學檢查 左肺置 10% 福爾馬林溶液中固定 1 周后，按常規病理學方法切片，HE 染色，光鏡觀察。
1.2.3 血小板內 MKK3 磷酸化水平 用 Western blot 技術檢測血小板內絲裂原活化蛋白激酶激酶 3（MKK3）磷酸化水平。在注射油酸后各時間點，從動物腹主動脈采血（10±1）ml，分離血小板，提取血小板蛋白。用考馬斯亮藍測血小板蛋白濃度，按預定的量取制備好的蛋白樣品，加入等量的 5 × 的加樣緩沖液混勻，94 ℃ 加熱 5 min，蛋白每孔加樣 30 μg，行 SDS-PAGE 電泳（5% 濃縮膠/10% 分離膠），然后將蛋白轉移至 PVDF 膜（160 mA，2 h），轉印后的 PVDF 膜用 TBS 漂洗后，置于 10% 脫脂奶粉抗體封閉液室溫搖床封閉 2 h；按 1∶1 000 比例用 TBS 緩沖液稀釋一抗（兔抗鼠），室溫下在搖床上孵育 30 min 后，置于 4 ℃ 冰箱中孵育過夜；次日從 4 ℃ 冰箱拿出后，室溫下搖床上再孵育 30 min；用含 0.05% Tween-20 的緩沖液（TBST）洗膜（10 min×3 次）；按 1∶2 000 比例用 TBS 緩沖液稀釋二抗（羊抗兔），室溫下孵育 2 h；用 TBST 洗膜（10 min×3 次）；用 BIO-RAD GelDocTM XR+成像系統進行化學發光法顯色成像；應用掃描系統的分析軟件（ImageLab，Bio-Rad 公司）測定目標蛋白灰度值。根據蛋白印跡條帶的灰度值，分別計算每個蛋白的磷酸化比值（pJNK 磷酸化灰度/JNK 總蛋白灰度）。
1.3 統計學方法
實驗數據均用均數 ± 標準差（ ）表示，應用 Graphpad Prism 統計學專用軟件對各實驗數據進行分析，各組間比較采用單因素方差分析，對差異顯著者用 Newman-Kuelsq 檢驗進行兩兩比較，同組數據不同時間點的比較采用配對t 檢驗。檢驗水準 α=0.05，P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 動物全身狀況
實驗組大鼠在注射油酸后 2 ～ 3 min 即開始出現呼吸困難，呼吸幅度增大，癱軟無力，活動減少，行走時呈爬行步態，進飲食減少。24 h 后動物一般狀態好轉；至 72 h，活動基本恢復正常。對照組無異常變化。
2.2 動物肺系數和肺濕/干重比值
動物肺系數和肺濕/干重比值變化見表 1。從表中可見，注射油酸后 2～24 h，實驗組動物肺重、肺系數和肺濕/干重比值均有不同程度增加，以 2 h 最嚴重。對照組上述各項均無異常變化。
表1
各組動物肺系數和肺濕/干重比值（n=6，
）
2.3 肺組織病理學
肉眼觀察見對照組大鼠肺臟大小正常，表面光滑，粉紅色，紋理清晰；而 2 ～24 h 實驗組雙肺體積增大且重量增加，表面從鮮紅色逐漸變為深紅色、紫紅色花斑狀；72 h 實驗組肺腫脹消失并有輕度萎縮，彈性差，外觀呈灰白色（圖 1）。
圖1
肺組織肉眼觀察 a. 對照組； b. OA 2 h 組； c. OA 6 h 組； d. OA 24 h 組； e. OA 72 h 組
光鏡下，對照組肺組織結構清晰，肺泡腔內無液體滲出及細胞浸潤（圖 2a）；2～6 h 實驗組肺泡內可見多量染色粉紅均一的液體滲出，輕重不一的肺泡和肺間質出血、炎細胞浸潤、小血管擴張和充血；6 h 實驗組肺泡內有透明膜形成；24 h 實驗組肺泡內液體滲出減輕，肺泡、肺間隔出血和炎細胞浸潤加重，肺組織實變，肺組織正常結構消失；72 h實驗組肺泡腔液體滲出吸收，肺泡腔萎陷；肺泡隔增厚，膠原纖維組織增生，微血栓形成（圖 2b～2f）。
圖2
肺組織病理像 a. 對照組：肺組織結構清晰，肺泡腔內無液體滲出和細胞浸潤（HE ×200）； b. OA 2 h 組：肺泡內有多量粉紅色液體滲出，肺泡隔有出血，小血管充血（HE×200）； c. OA 6 h 組：肺泡腔內大量粉紅色液體滲出，形成透明膜（HE ×200）；d. OA 24 h 組：肺泡腔和肺間質有大量出血和炎細胞浸潤，肺組織實變（HE×200）； e. OA 72 h 組：肺泡腔萎陷，肺泡隔增厚，膠原纖維組織增生（HE ×200）； f. OA 72 h 組：肺泡腔縮小，肺微血栓形成（HE ×400）
2.4 血小板內 MKK3 磷酸化水平
各組動物血小板 MKK3 磷酸化水平見圖 3。與對照組比較，6～72 h 實驗組大鼠血小板內蛋白激酶 MKK3 磷酸化水平明顯增高（P＜0.05），其中 6 h 組為對照組的 2.4 倍（0.50±0.09vs. 0.21±0.05）；24 h 組表達量最高（0.78±0.06），為對照組的 3.7 倍；72 h 組稍有回落（0.75±0.13），但仍明顯高于對照組。
圖3
各組大鼠血小板 MKK3 磷酸化水平
3 討論
ARDS 是臨床各科常見急危重病癥，早期階段或輕癥曾被稱為急性肺損傷（ALI）。在美國，每年發病約 20 萬例，死亡率接近 50%[2]。它可由感染、創傷、有害氣體或液體吸入等多種病因引起，但詳細發病機制尚不清楚。
血小板是血液系統的有形成分之一，主要功能是止血，防止創傷后血液的大量丟失。近年科學界對血小板的功能特性有了不少新的發現，了解到血小板在呼吸系統生理和病理生理的分子和細胞生物學中起重要作用[3]。除參與止血及血栓形成外，血小板還參與免疫、炎癥、動脈硬化、血管生成、淋巴管發育、腫瘤生長及轉移等病理過程[4-7]。血小板能表達多種免疫受體（如 CD14、TLRs、FcR、CD40 等），釋放大量接近活化的細胞因子（如 IL-1β、MCP-1、TGF-β、CD40L、RANTES 等）。這些受體、細胞因子共同參與，使血小板吸引白細胞到血管損傷點，釋放炎性因子，產生微顆粒物質，誘發凝血酶的生成。研究已證明這些過程對膿毒癥、動脈粥樣硬化、肝炎、急性肺損傷、血管再狹窄和移植排斥反應等疾患的發病過程至關重要[5]。
近年研究發現，在生理狀態和在 ARDS 時，血小板、血小板前體與肺有多個級別的交互活動，血小板在 ARDS 時發生活化并可能在 ARDS 發病中起重要作用[3,8-9]，但血小板活化的具體機制和信號傳導通路仍不清楚。MAPKs 信號通路是細胞跨膜信號轉導過程中具有至關重要作用的信號轉導系統，由一大群絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶組成。該信號通路存在于許多細胞內，在細胞外刺激信號向細胞及其核內轉導并引起細胞發生生物學反應的過程中起重要作用。在高等哺乳類動物的細胞內主要有 3 條并行的三級聯的 MAPKs 信號通路：細胞外調節的蛋白激酶（ERKs）信號通路，c-Jun 氨基末端蛋白激酶（JNKs）信號通路，以及 p38 蛋白激酶（p38 kinase，p38 MAPK）信號通路。不同的細胞外刺激使用的通路不同，通過各條通路的相互調控而介導不同的細胞生物學反應。
MKK3 是 MAPKs 信號轉導通路系統中 p38 MAPK 通路上第二級聯的一個重要蛋白激酶，它是 p38 MAPK 的上游蛋白激酶，可特異性地激活 p38 MAPK[10]。目前有關 ARDS 時血液循環中血小板內 MKK 3 -p38 MAPK 信號轉導通路的研究報道罕見。本研究結果顯示，6 ～72 h 實驗組動物血液循環中血小板內 MKK3 磷酸化水平明顯增高，在 24 h 組表達量最高（P＜0.05）。實驗結果說明，ARDS 時有血小板內 MKK3-p38 MAPK 信號轉導通路的啟動；該信號轉導通路的啟動可能與血小板的活化有關。MAPKs 信號通路是一個十分復雜的信號轉導系統，本研究只是對 ARDS 時血小板中 MAPKs 信號通路變化的初步探索，今后還需要做大量的實驗研究來進行深入探討。
