引用本文： 吳彩云, 羅群, 王薇, 汪延生, 陳強, 于寶丹, 劉明, 張歡歡, 鄭麗霞, 徐軍. 脾氨肽對結締組織病相關間質性肺疾病的免疫調節治療作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(3): 222-226. doi: 10.7507/1671-6205.2016053 復制
結締組織病相關間質性肺疾病(connective tissue disease-related interstitial lung disease，CTD-ILD)患者常常死于間質性肺炎、肺纖維化的進展，傳統的免疫抑制劑與激素抗炎并不能阻止病情進展[1]。研究表明免疫系統異常激活及免疫耐受缺陷在間質性肺疾病患者體內普遍存在[2-4]。皰疹病毒家族成員的隱匿感染誘導持續性固有免疫炎癥反應[5]，也可能參與了間質性肺疾病的進展[6-7]。脾氨肽是從新鮮豬脾臟中提取的多肽及核苷酸類物質；相對分子質量小于10 000，平均相對分子質量3 500左右。脾氨肽作為一種免疫調節劑，臨床應用于治療細胞免疫功能低下、免疫缺陷和自身免疫功能紊亂性疾病(惡性腫瘤、反復呼吸道感染、支氣管炎、肺炎、哮喘、重癥帶狀皰疹及牛皮癬等)[8-9]。基于此，本研究觀察了常規方案聯合應用脾氨肽對CTD-ILD患者的臨床療效，并從免疫學角度探討其發揮作用的機制，為自身免疫相關間質性肺疾病的治療探索新的有效治療方法。
對象與方法
一 對象
以2014年2月至2015年5月在我科就診的三類CTD-ILD患者為研究對象，包括自身免疫特征間質性肺疾病(autoimmune-featured interstitial lung disease，AIF-ILD)、多發性肌炎相關間質性肺疾病(polymyositis-associated interstitial lung disease，PM-ILD)、類風濕性關節炎相關間質性肺疾病(rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease，RA-ILD)。病例分別符合美國風濕學會AIF、PM、RA的相應診斷標準。肺間質病變的診斷標準：符合2002年歐洲學會制定的肺間質病變病理改變[10]，此為必備條件，除此以外符合以下3項中的至少1項：(1)有咳嗽、胸悶、氣促等癥狀；(2)胸部高分辨率CT(HRCT)顯示1種或以上肺間質病變影像學改變；(3)肺功能為限制性通氣功能障礙或彌散功能減退。排除職業、藥物、遺傳、環境因素、特發性肺間質病變等引起的肺間質病變。無其他器臟的嚴重疾病，無精神病及惡性腫瘤，所有患者在治療前3個月內未使用過激素及免疫調節劑。
符合入選條件并簽署知情同意書的CTD-ILD患者共90例，其中AIF-ILD 20例，PM-ILD 39例，RA-ILD 31例。入選患者隨機分為常規治療組(44例)和脾氨肽治療組(46例)。兩組疾病類型構成、性別、年齡、病程、用藥等方面的差異無統計學意義(P＞0.05)，組間具有可比性。同時選取同期33例健康志愿者作為對照組，對照組年齡、性別同疾病組比較，差異無統計學意義。結果見表 1。
表1
兩組患者一般資料(x±s)
二 方法
1．治療方法：常規治療組給予常規激素抗炎、化痰及氧療等常規治療；脾氨肽治療組在此基礎上給予脾氨肽(大連百利天華制藥公司生產，規格：2 mg×5瓶)治療，4 mg/次，口服，1次/d，以3個月為一療程。
2．觀察指標
(1)肺功能檢測和HRCT影像學評分：肺功能及HRCT檢測由我院專業人員完成。肺功能檢查包括通氣功能指標用力肺活量占預計值百分比(FVC%pred)和彌散功能指標一氧化碳彌散量占預計值百分比(DLCO%pred)。HRCT評分采用Goldin等[11]的方法根據間質性病變在選擇層面所占面積進行半定量評分。
(2)人巨細胞病毒(HCMV)檢測：提取治療前后外周血DNA，采用HCMV熒光定量PCR試劑盒(QIAGEN深圳公司)檢測HCMV DNA，比較各組HCMV病毒DNA的檢出及陰轉率。
(3)免疫亞群和細胞因子：采用美國Beckman-Coulter流式細胞儀對CD4+、CD8+、CD3+CD56+(NKT)、CD4+CD25+Foxp3+(Treg)等免疫細胞亞群進行檢測(Beckman-Coulter USA)，液相芯片(Bio-rad USA，Luminex 200液相芯片檢測儀)檢測治療前后血漿白細胞介素(IL-6)、IL-10、IL-17、γ干擾素(IFN-γ)等細胞因子的變化。
(4)隨訪：隨訪6個月，觀察兩組發生呼吸道感染情況。
(5)不良反應：觀察脾氨肽治療過程中有無不良反應的發生。
三 統計學處理
采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行統計處理，計量資料用x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 肺功能與影像學
治療前兩組FVC%pred、DLCO%pred及HRCT評分差異無統計學意義(P＞0.05)。經過3個月治療后，脾氨肽治療組FVC%pred、DLCO%pred較治療前明顯上升，HRCT評分明顯下降(表 2，圖 1)，差異有統計學意義；而常規治療組上述指標較治療前變化不明顯。脾氨肽治療組治療后FVC%pred較常規治療組升高明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見表 2。
圖1
脾氨肽治療前后HRCT像
a．治療前：兩下肺以胸膜下為主的小葉間隔增厚，內有多發條索狀、小片狀模糊影；b．治療后：病灶較前明顯減少
表2
兩組治療前后臨床指標觀察(x±s)
二 HCMV陰轉率
90例患者治療前經Q-PCR法檢測出40例HCMV陽性患者，其中脾氨肽治療組22例，常規治療組18例；治療后發現脾氨肽組22例HCMV陽性者中有16例轉為陰性，陰轉率為72.7%；常規治療組18例陽性患者僅有5例轉陰，陰轉率為27.8%。兩組HCMV陰轉率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。
三 CTD-ILD患者免疫功能
將治療前90例CTD-ILD患者與33例健康對照者進行免疫功能對比分析，發現CTD-ILD患者的NKT、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ較健康對照組明顯升高(P＜0.05)，而Treg、CD4+/CD8+則明顯低于對照組(P＜0.05)。結果見表 3。
表3
CTD-ILD患者與健康對照組免疫狀態的比較(x±s)
四 兩組治療前后免疫功能變化
治療前脾氨肽治療組與常規治療組在淋巴細胞亞群、細胞因子水平的差異無統計學意義(P＞0.05)。治療3個月后脾氨肽治療組Treg、IFN-γ水平較治療前明顯升高(P＜0.05)；常規治療組NKT、IL-6、IL-10、IL-17水平較治療前上升(P＜0.05)，CD4+/CD8+水平較前降低(P＜0.05)。兩組治療后指標比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見圖 2。
圖2
兩組患者治療前后淋巴亞群和細胞因子變化
*
五 隨訪
治療后隨訪6個月期間，脾氨肽治療組46例中有8例次發生過呼吸道感染，發生率為17.4%，常規治療組44例中17例次發生過呼吸道感染，發生率為38.6%。兩組呼吸道感染率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。
六 不良反應
脾氨肽治療組有1例出現皮膚瘙癢現象，予相應對癥處理后消失。
討論
CTD-ILD臨床上以PM-ILD、RA-ILD及AIF-ILD較多見。目前對結締組織病患者發生肺間質病變的病因及機制尚不清楚，研究表明免疫紊亂與肺纖維化發生有密切關系[2-4]。Bresser等[2]發現在系統性硬化患者發生肺纖維化前肺內已經存在異常的T淋巴細胞亞群的激活，并參與了纖維化的發生。Kotsianidis等[4]發現特發性肺纖維化(IPF)患者外周血Treg比例較正常人減少，這一發現在患者肺泡灌洗液中亦得到證實。本研究通過將CTD-ILD患者與正常健康者對比，再次證實殺傷毒性細胞CD8、NKT過度激活，抑制性Treg水平低下與間質性肺疾病的發展相關。與常規治療比較，我們發現聯合脾氨肽治療能夠提高Treg的水平，與我們對細胞因子表達譜改變的發現是吻合的。Treg的水平升高與功能恢復有助于對抗CD8+ T細胞、NKT的細胞毒作用，阻斷進行性肺損傷的發展[12-13]。脾氨肽在本研究治療CTD-ILD顯示的臨床效果進一步證實了免疫調節在CTD-ILD治療中的意義。
在肺損傷及纖維化發生過程中有多種細胞因子的參與，包括IL-6、IL-17、轉化生長因子β(TGF-β)等促炎促纖維化細胞因子，以及趨化因子10(IP-10)、IFN-γ等抗纖維化細胞因子。IL-6通過Stat3信號促進膠原蛋白沉積、抑制細胞外基質(ECM)分解的作用導致纖維化疾病的發生，阻斷IL-6能改善纖維化[14]。IL-17能增加膠原蛋白的合成與分泌，促進肺泡上皮細胞向間充質細胞轉分化，TGF-β聯合IL-17能促進肺纖維化的發展[15]。Giannopoulou等[16]發現IFN-γ通過調節Erk1/2和Stat3信號通路拮抗TGF-β發揮抗纖維化作用。本試驗結果顯示脾氨肽治療可誘導IFN-γ的分泌，抑制促纖維化細胞因子IL-6、IL-17的生成；而常規治療盡管促進了抗炎細胞因子IL-10釋放，卻顯著增加了IL-6與IL-17等促纖維化因子的水平。這可以清楚解釋臨床上經加用脾氨肽治療后肺功能及HRCT病變能夠明顯改善，而常規治療不能明顯改善肺功能等指標的緣由。
研究發現HCMV能逃避機體的免疫攻擊和免疫監視長期潛伏于體內，當免疫功能異常時潛伏的病毒可重新激活，而激活的HCMV又會干擾宿主的免疫穩態，使機體處于一種慢性炎癥反應狀態[5]。HCMV可擾亂機體的免疫平衡觸發肺纖維化的發生，因此抑制與清除HCMV的激活復制可能是脾氨肽產生療效的另一關鍵因素。本研究發現，與常規治療組相比，聯用脾氨肽治療組HCMV陰轉率顯著提高，血中IFN-γ水平明顯升高。IFN-γ是機體防御病毒感染的主要效應分子，具有抗病毒作用。這提示脾氨肽具有促進IFN-γ的合成釋放，進而發揮抑制HCMV活化與復制的能力。
綜上所述，脾氨肽聯合常規治療能夠有效調節CTD-ILD患者紊亂的免疫微環境，抑制HCMV在體內的激活復制，進而可促進肺內炎癥微環境的消散，抑制纖維化進展。
結締組織病相關間質性肺疾病(connective tissue disease-related interstitial lung disease，CTD-ILD)患者常常死于間質性肺炎、肺纖維化的進展，傳統的免疫抑制劑與激素抗炎并不能阻止病情進展[1]。研究表明免疫系統異常激活及免疫耐受缺陷在間質性肺疾病患者體內普遍存在[2-4]。皰疹病毒家族成員的隱匿感染誘導持續性固有免疫炎癥反應[5]，也可能參與了間質性肺疾病的進展[6-7]。脾氨肽是從新鮮豬脾臟中提取的多肽及核苷酸類物質；相對分子質量小于10 000，平均相對分子質量3 500左右。脾氨肽作為一種免疫調節劑，臨床應用于治療細胞免疫功能低下、免疫缺陷和自身免疫功能紊亂性疾病(惡性腫瘤、反復呼吸道感染、支氣管炎、肺炎、哮喘、重癥帶狀皰疹及牛皮癬等)[8-9]。基于此，本研究觀察了常規方案聯合應用脾氨肽對CTD-ILD患者的臨床療效，并從免疫學角度探討其發揮作用的機制，為自身免疫相關間質性肺疾病的治療探索新的有效治療方法。
對象與方法
一 對象
以2014年2月至2015年5月在我科就診的三類CTD-ILD患者為研究對象，包括自身免疫特征間質性肺疾病(autoimmune-featured interstitial lung disease，AIF-ILD)、多發性肌炎相關間質性肺疾病(polymyositis-associated interstitial lung disease，PM-ILD)、類風濕性關節炎相關間質性肺疾病(rheumatoid arthritis-associated interstitial lung disease，RA-ILD)。病例分別符合美國風濕學會AIF、PM、RA的相應診斷標準。肺間質病變的診斷標準：符合2002年歐洲學會制定的肺間質病變病理改變[10]，此為必備條件，除此以外符合以下3項中的至少1項：(1)有咳嗽、胸悶、氣促等癥狀；(2)胸部高分辨率CT(HRCT)顯示1種或以上肺間質病變影像學改變；(3)肺功能為限制性通氣功能障礙或彌散功能減退。排除職業、藥物、遺傳、環境因素、特發性肺間質病變等引起的肺間質病變。無其他器臟的嚴重疾病，無精神病及惡性腫瘤，所有患者在治療前3個月內未使用過激素及免疫調節劑。
符合入選條件并簽署知情同意書的CTD-ILD患者共90例，其中AIF-ILD 20例，PM-ILD 39例，RA-ILD 31例。入選患者隨機分為常規治療組(44例)和脾氨肽治療組(46例)。兩組疾病類型構成、性別、年齡、病程、用藥等方面的差異無統計學意義(P＞0.05)，組間具有可比性。同時選取同期33例健康志愿者作為對照組，對照組年齡、性別同疾病組比較，差異無統計學意義。結果見表 1。
表1
兩組患者一般資料(x±s)
二 方法
1．治療方法：常規治療組給予常規激素抗炎、化痰及氧療等常規治療；脾氨肽治療組在此基礎上給予脾氨肽(大連百利天華制藥公司生產，規格：2 mg×5瓶)治療，4 mg/次，口服，1次/d，以3個月為一療程。
2．觀察指標
(1)肺功能檢測和HRCT影像學評分：肺功能及HRCT檢測由我院專業人員完成。肺功能檢查包括通氣功能指標用力肺活量占預計值百分比(FVC%pred)和彌散功能指標一氧化碳彌散量占預計值百分比(DLCO%pred)。HRCT評分采用Goldin等[11]的方法根據間質性病變在選擇層面所占面積進行半定量評分。
(2)人巨細胞病毒(HCMV)檢測：提取治療前后外周血DNA，采用HCMV熒光定量PCR試劑盒(QIAGEN深圳公司)檢測HCMV DNA，比較各組HCMV病毒DNA的檢出及陰轉率。
(3)免疫亞群和細胞因子：采用美國Beckman-Coulter流式細胞儀對CD4+、CD8+、CD3+CD56+(NKT)、CD4+CD25+Foxp3+(Treg)等免疫細胞亞群進行檢測(Beckman-Coulter USA)，液相芯片(Bio-rad USA，Luminex 200液相芯片檢測儀)檢測治療前后血漿白細胞介素(IL-6)、IL-10、IL-17、γ干擾素(IFN-γ)等細胞因子的變化。
(4)隨訪：隨訪6個月，觀察兩組發生呼吸道感染情況。
(5)不良反應：觀察脾氨肽治療過程中有無不良反應的發生。
三 統計學處理
采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行統計處理，計量資料用x±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗，組內比較采用配對t檢驗，計數資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 肺功能與影像學
治療前兩組FVC%pred、DLCO%pred及HRCT評分差異無統計學意義(P＞0.05)。經過3個月治療后，脾氨肽治療組FVC%pred、DLCO%pred較治療前明顯上升，HRCT評分明顯下降(表 2，圖 1)，差異有統計學意義；而常規治療組上述指標較治療前變化不明顯。脾氨肽治療組治療后FVC%pred較常規治療組升高明顯，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見表 2。
圖1
脾氨肽治療前后HRCT像
a．治療前：兩下肺以胸膜下為主的小葉間隔增厚，內有多發條索狀、小片狀模糊影；b．治療后：病灶較前明顯減少
表2
兩組治療前后臨床指標觀察(x±s)
二 HCMV陰轉率
90例患者治療前經Q-PCR法檢測出40例HCMV陽性患者，其中脾氨肽治療組22例，常規治療組18例；治療后發現脾氨肽組22例HCMV陽性者中有16例轉為陰性，陰轉率為72.7%；常規治療組18例陽性患者僅有5例轉陰，陰轉率為27.8%。兩組HCMV陰轉率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。
三 CTD-ILD患者免疫功能
將治療前90例CTD-ILD患者與33例健康對照者進行免疫功能對比分析，發現CTD-ILD患者的NKT、IL-6、IL-10、IL-17、IFN-γ較健康對照組明顯升高(P＜0.05)，而Treg、CD4+/CD8+則明顯低于對照組(P＜0.05)。結果見表 3。
表3
CTD-ILD患者與健康對照組免疫狀態的比較(x±s)
四 兩組治療前后免疫功能變化
治療前脾氨肽治療組與常規治療組在淋巴細胞亞群、細胞因子水平的差異無統計學意義(P＞0.05)。治療3個月后脾氨肽治療組Treg、IFN-γ水平較治療前明顯升高(P＜0.05)；常規治療組NKT、IL-6、IL-10、IL-17水平較治療前上升(P＜0.05)，CD4+/CD8+水平較前降低(P＜0.05)。兩組治療后指標比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見圖 2。
圖2
兩組患者治療前后淋巴亞群和細胞因子變化
*
五 隨訪
治療后隨訪6個月期間，脾氨肽治療組46例中有8例次發生過呼吸道感染，發生率為17.4%，常規治療組44例中17例次發生過呼吸道感染，發生率為38.6%。兩組呼吸道感染率比較，差異有統計學意義(P＜0.05)。
六 不良反應
脾氨肽治療組有1例出現皮膚瘙癢現象，予相應對癥處理后消失。
討論
CTD-ILD臨床上以PM-ILD、RA-ILD及AIF-ILD較多見。目前對結締組織病患者發生肺間質病變的病因及機制尚不清楚，研究表明免疫紊亂與肺纖維化發生有密切關系[2-4]。Bresser等[2]發現在系統性硬化患者發生肺纖維化前肺內已經存在異常的T淋巴細胞亞群的激活，并參與了纖維化的發生。Kotsianidis等[4]發現特發性肺纖維化(IPF)患者外周血Treg比例較正常人減少，這一發現在患者肺泡灌洗液中亦得到證實。本研究通過將CTD-ILD患者與正常健康者對比，再次證實殺傷毒性細胞CD8、NKT過度激活，抑制性Treg水平低下與間質性肺疾病的發展相關。與常規治療比較，我們發現聯合脾氨肽治療能夠提高Treg的水平，與我們對細胞因子表達譜改變的發現是吻合的。Treg的水平升高與功能恢復有助于對抗CD8+ T細胞、NKT的細胞毒作用，阻斷進行性肺損傷的發展[12-13]。脾氨肽在本研究治療CTD-ILD顯示的臨床效果進一步證實了免疫調節在CTD-ILD治療中的意義。
在肺損傷及纖維化發生過程中有多種細胞因子的參與，包括IL-6、IL-17、轉化生長因子β(TGF-β)等促炎促纖維化細胞因子，以及趨化因子10(IP-10)、IFN-γ等抗纖維化細胞因子。IL-6通過Stat3信號促進膠原蛋白沉積、抑制細胞外基質(ECM)分解的作用導致纖維化疾病的發生，阻斷IL-6能改善纖維化[14]。IL-17能增加膠原蛋白的合成與分泌，促進肺泡上皮細胞向間充質細胞轉分化，TGF-β聯合IL-17能促進肺纖維化的發展[15]。Giannopoulou等[16]發現IFN-γ通過調節Erk1/2和Stat3信號通路拮抗TGF-β發揮抗纖維化作用。本試驗結果顯示脾氨肽治療可誘導IFN-γ的分泌，抑制促纖維化細胞因子IL-6、IL-17的生成；而常規治療盡管促進了抗炎細胞因子IL-10釋放，卻顯著增加了IL-6與IL-17等促纖維化因子的水平。這可以清楚解釋臨床上經加用脾氨肽治療后肺功能及HRCT病變能夠明顯改善，而常規治療不能明顯改善肺功能等指標的緣由。
研究發現HCMV能逃避機體的免疫攻擊和免疫監視長期潛伏于體內，當免疫功能異常時潛伏的病毒可重新激活，而激活的HCMV又會干擾宿主的免疫穩態，使機體處于一種慢性炎癥反應狀態[5]。HCMV可擾亂機體的免疫平衡觸發肺纖維化的發生，因此抑制與清除HCMV的激活復制可能是脾氨肽產生療效的另一關鍵因素。本研究發現，與常規治療組相比，聯用脾氨肽治療組HCMV陰轉率顯著提高，血中IFN-γ水平明顯升高。IFN-γ是機體防御病毒感染的主要效應分子，具有抗病毒作用。這提示脾氨肽具有促進IFN-γ的合成釋放，進而發揮抑制HCMV活化與復制的能力。
綜上所述，脾氨肽聯合常規治療能夠有效調節CTD-ILD患者紊亂的免疫微環境，抑制HCMV在體內的激活復制，進而可促進肺內炎癥微環境的消散，抑制纖維化進展。
