引用本文： 鮑文華, 王瑾, 李樹民, 楊曉東, 馬雪梅. Th9細胞相關因子在肺纖維化大鼠中的作用. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(3): 227-231. doi: 10.7507/1671-6205.2016054 復制
肺纖維化是一種病因不明的彌漫性肺間質性疾病，以肺泡炎癥、成纖維細胞增殖、細胞外基質沉積為特點的疾病。研究表明，純化的T細胞可以刺激成纖維細胞增殖，進一步導致細胞外基質沉積[1]。Th9細胞是一種炎癥細胞，目前認為Th9細胞功能具有雙向性，既可以促進炎癥，亦可以抑制炎癥發生。PU.1和干擾素調節因子4(IRF4)是目前公認的Th9細胞相對特異性的轉錄因子[2]，白細胞介素4(IL-4)是Th9細胞的誘導因子之一。Th9細胞作為輔助性T細胞的一個新亞群，已有實驗表明細胞在支氣管哮喘和潰瘍性結腸炎等炎癥和免疫性疾病中起作用，但在肺纖維化疾病中鮮少研究。本實驗觀察肺纖維化大鼠PU.1、IRF4的表達量，探討IRF4和IL-4的關系，旨在闡明Th9細胞相關因子在肺纖維化中的作用。
材料與方法
一 材料
博來霉素購自Sigma公司，大鼠IL-4 ELISA試劑盒由上海勁馬公司提供，Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒由哈爾濱海基生物公司提供。光學顯微鏡為奧林巴斯公司產品，酶標儀為Bio-Rad公司產品，PCR儀為Bio-Rad Min-Opticon2。
二 方法
1.模型建立：90只SPF級SD大鼠(佳木斯大學動物實驗中心)，6~8周齡，體重200~230 g，適應性飼養10 d，按隨機數字表法分為3組：健康對照組、肺纖維化組和地塞米松干預組，各組30只大鼠。肺纖維化組處理方案參照文獻[3]的方法并在此方案上改進，將5 mg/kg博來霉素氣管內注入制作肺纖維化模型，地塞米松干預組在肺纖維化模型基礎上第8 d開始每天腹腔注入3 mg/kg地塞米松，健康對照組用生理鹽水替代博來霉素，三組分別在第7 d、第14 d、第28 d各處死10只大鼠。
2.支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集：切開胸部，暴露氣管和主支氣管，結扎右主支氣管，用14號針頭插入氣管中，結扎，經氣管注入生理鹽水2 mL，抽吸混勻，反復灌洗3次，共收集BALF 4 mL，1 500 r/min，離心15 min，上清液置于－80 ℃保存。
3.肺組織標本的留取：暴露氣管與雙肺，分離肺組織，用止血鉗夾閉右肺門并結扎，立即取下右肺，PBS沖洗肺臟表面，用濾紙拭干，將肺組織給予4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋、切片，用于蘇木精-伊紅(HE)染色。
4.PU.1和IRF4 mRNA測定：離心處理BALF，留取沉淀，采用Trizol法抽提RNA，逆轉錄為cDNA，實時熒光PCR檢測PU.1 mRNA、IRF4 mRNA表達水平，引物由Primer 5.0軟件自行設計，引物由南京Genscript公司合成，引物序列分別為PU.1：5′-TGC TTCCCTTATCCACCCTTG-3′(上游)，5′-TCTTCTTGC TGCCTGTCTCC-3′(下游)；IRF4：5′-AGAATGCCAGG ACCACAGAG-3′(上游)，5′-CTTAGTCAGTCACCAA TCTCAGC-3′(下游)；內參照GAPDH：5′-AACTCC CATTCTTCCACCTTT-3′(上游)，5′-CTCTTGCTCTC AGTATCCTTG-3′(下游)。通過檢測模板梯度稀釋時的CT值的變化來評價目的基因和內參基因的擴增效率，采用相對定量法，以2-△△Ct表示樣本中目的基因相對表達含量。
5.IL-4測定：采用ELISA法檢測外周血IL-4含量，嚴格按照試劑盒說明書操作，采用全自動酶標儀依序測量450 nm處各孔的吸光度，通過標準曲線計算IL-4含量。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析，計量資料以x±s描述，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，若數據符合方差齊性，采用LSD-t檢驗進行多重比較；若數據方差不齊，采用非參數秩和檢驗。相關性分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 肺組織病理學變化
健康對照組在各時間點肺組織結構完整，肺泡間隔無增厚，無明顯炎癥反應和纖維化改變。肺纖維化組大鼠肺組織早期為肺泡炎表現，肺間質和肺泡腔內可見大量巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，此后肺泡炎隨時間推移逐漸減輕，第14 d部分肺泡結構消失，炎癥細胞浸潤稍減少，肺泡間隔增寬，成纖維細胞增生；第28 d肺泡結構破壞，肺泡結構紊亂，部分肺泡壁塌陷，肺泡間隔明顯增寬，細胞外基質增生，纖維沉積明顯，肺組織呈廣泛纖維化改變。地塞米松干預組肺泡結構存在，炎癥細胞浸潤減少，肺泡間隔增厚明顯減輕，肺纖維化程度明顯輕于肺纖維化組。結果見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理像(HE×100)
a.健康對照組：肺組織結構完整，肺泡間隔無增厚，無明顯炎癥反應和纖維化改變；b.地塞米松干預組第14 d，c.地塞米松干預組第28 d：肺泡結構存在，炎癥細胞浸潤減少，肺泡間隔輕微增厚；d.肺纖維化組第7 d，e.肺纖維化組第14 d，f.肺纖維化組第28 d：早期表現為肺間質和肺泡腔內大量巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，第14 d時部分肺泡結構消失，炎癥細胞浸潤稍減少，肺泡間隔增寬，成纖維細胞增生，第28 d時肺組織呈廣泛纖維化改變
二 大鼠BALF中PU.1、IRF4 mRNA含量比較
肺纖維化組各時間點BALF中PU.1 mRNA含量明顯高于健康對照組，與肺纖維化組比較，地塞米松干預組PU.1 mRNA含量第14 d和第28 d明顯減低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。肺纖維化組PU.1 mRNA在第7 d表達增加，第14 d達到高峰，第28 d有所下降。
肺纖維化組各時間點BALF中IRF4 mRNA含量明顯高于健康對照組，與肺纖維化組比較，地塞米松干預組第28dIRF4 mRNA含量明顯減低，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見表 1。
表1
大鼠BALF中PU.1、IRF4 mRNA含量比較(n=10, x±s)
三 大鼠外周血IL-4含量比較
肺纖維化組IL-4含量在第7 d和第14 d明顯高于健康對照組，與肺纖維化組比較，地塞米松干預組第14 d含量明顯減低，差異有統計學意義(P＜0.05)，外周血IL-4含量第28 d三組差異未見明顯統計學意義。肺纖維化組IL-4在第7 d表達為增加趨勢，第14 d達到高峰，第28 d有所下降。結果見表 2。
表2
大鼠外周血IL-4含量比較(n=10, x±s, pg/mL)
四 相關性分析
肺纖維化組第14 d的IRF4 mRNA含量與IL-4含量呈正相關(r=0.044，P＜0.05)。
3 討論
Th9細胞是新近發現的一種CD4+輔助性T細胞，于2008年由Kuchroo實驗室和Stockinger實驗室最先報道，體外實驗研究表明Th9細胞在IL-4和轉化生長因子β(TGF-β)聯合誘導條件下由初始CD4+T細胞分化而來[4]，或TGF-β單獨存在下由Th2細胞轉化而來[5]。PU.1和IRF4是Th9細胞相對特應性的轉錄因子，PU.1是ETS轉錄因子家族成員，由Sfpi1基因編碼，PU.1促進幼稚淋巴細胞發育和增殖分化，參與未成熟淋巴細胞向T細胞方向分化；IRF4是干擾素調節因子家族成員，是分子量為52 kD的一種轉錄因子，它參與免疫細胞的分化成熟及免疫球蛋白的類型轉換[6-7]。
Th9細胞參與機體炎癥反應及多種免疫性疾病[8]。在呼吸系統疾病中Th9細胞在過敏性鼻炎、支氣管哮喘等疾病中均有表達。Hoppenot等[9]納入過敏性哮喘患者、過敏性鼻炎患者和正常人對照，分別測定血清Th9細胞、凋亡嗜酸粒細胞、IL-9和IL-5，發現過敏性哮喘患者Th9細胞表達量明顯高于其他兩組，而凋亡嗜酸粒細胞含量明顯減少，Th9細胞及其因子IL-9與氣道炎癥有關。Jones等[10]研究發現Th9細胞可以通過向肺部募集并激活肥大細胞導致肺部過敏性損傷。肺纖維化雖然病因未明，但損傷的肺泡上皮細胞、單核-巨噬細胞和淋巴細胞浸潤及其分泌的炎癥介質促進肺纖維化的發生發展。本研究旨在探討Th9細胞相關因子在肺纖維化中的炎癥作用。
本研究發現，大鼠BALF中PU.1 mRNA、IRF4 mRNA及IL-4在肺纖維化過程中尤其是早期肺泡炎階段表達量明顯升高，推測主要是因為Th9細胞及其相關因子作為炎癥細胞因子在肺纖維化過程中發揮炎癥損傷作用。有觀點認為肺纖維化是經過單一的炎癥反應階段之后快速出現異常的損傷修復[11]，肺纖維化主要包括肺泡炎癥階段和肺纖維化兩個階段，其中肺泡炎癥階段是肺纖維化發病的中心環節，它的持續存在與肺組織結構和功能不可逆損傷密切相關。活化巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、損傷的肺泡上皮細胞及其釋放的多種蛋白酶、趨化因子、IL-1、IL-2、IL-8、膠原酶等均參與肺組織損傷及其修復的過程。PU.1綁定在IL-9基因位點上，通過促進IL-9基因組蛋白乙酰化促進Th9細胞的表達[12]。IRF4同樣與其他轉錄因子形成復合物共同調節Th9細胞基因的活性[13]。IL-4作為一種炎癥介質，參與多種疾病過程的炎癥反應。Th9細胞本身及通過分泌效應因子IL-9、IL-10[5]，主要在肺泡炎階段起作用，繼而促進肺纖維化發生發展。與肺纖維化組比較，地塞米松干預組PU.1、IRF、IL-4的含量不同程度的減低，表明地塞米松干預下肺組織的炎癥反應減輕。地塞米松作為糖皮質激素，通常認為其抗纖維化作用與抑制中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，抑制巨噬細胞增殖和分泌等有關[14-15]。
本研究結果還表明，大鼠肺纖維化早期IRF4 mRNA與IL-4的表達量呈明顯正相關。Goswami等[16]認為IL-4可能通過STAT途徑激活IRF4轉錄因子，促進Th9細胞的表達。IL-4通過STAT6途徑激活B細胞激活轉錄因子(B cell activating transcription factor，BATF)，BATF可以作為IRF4的上游因子調節IRF4，并且與IRF4協同作用促進Th9細胞的表達[17]。
肺纖維化的發病機制目前尚未完全闡明，本研究結果初步顯示Th9細胞在致大鼠肺纖維化中起作用，這可能與轉錄因子PU.1和IRF4有關，并且IL-4可能通過激活轉錄因子IRF4起作用，具體機制仍需進一步研究。
肺纖維化是一種病因不明的彌漫性肺間質性疾病，以肺泡炎癥、成纖維細胞增殖、細胞外基質沉積為特點的疾病。研究表明，純化的T細胞可以刺激成纖維細胞增殖，進一步導致細胞外基質沉積[1]。Th9細胞是一種炎癥細胞，目前認為Th9細胞功能具有雙向性，既可以促進炎癥，亦可以抑制炎癥發生。PU.1和干擾素調節因子4(IRF4)是目前公認的Th9細胞相對特異性的轉錄因子[2]，白細胞介素4(IL-4)是Th9細胞的誘導因子之一。Th9細胞作為輔助性T細胞的一個新亞群，已有實驗表明細胞在支氣管哮喘和潰瘍性結腸炎等炎癥和免疫性疾病中起作用，但在肺纖維化疾病中鮮少研究。本實驗觀察肺纖維化大鼠PU.1、IRF4的表達量，探討IRF4和IL-4的關系，旨在闡明Th9細胞相關因子在肺纖維化中的作用。
材料與方法
一 材料
博來霉素購自Sigma公司，大鼠IL-4 ELISA試劑盒由上海勁馬公司提供，Trizol試劑、逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒由哈爾濱海基生物公司提供。光學顯微鏡為奧林巴斯公司產品，酶標儀為Bio-Rad公司產品，PCR儀為Bio-Rad Min-Opticon2。
二 方法
1.模型建立：90只SPF級SD大鼠(佳木斯大學動物實驗中心)，6~8周齡，體重200~230 g，適應性飼養10 d，按隨機數字表法分為3組：健康對照組、肺纖維化組和地塞米松干預組，各組30只大鼠。肺纖維化組處理方案參照文獻[3]的方法并在此方案上改進，將5 mg/kg博來霉素氣管內注入制作肺纖維化模型，地塞米松干預組在肺纖維化模型基礎上第8 d開始每天腹腔注入3 mg/kg地塞米松，健康對照組用生理鹽水替代博來霉素，三組分別在第7 d、第14 d、第28 d各處死10只大鼠。
2.支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集：切開胸部，暴露氣管和主支氣管，結扎右主支氣管，用14號針頭插入氣管中，結扎，經氣管注入生理鹽水2 mL，抽吸混勻，反復灌洗3次，共收集BALF 4 mL，1 500 r/min，離心15 min，上清液置于－80 ℃保存。
3.肺組織標本的留取：暴露氣管與雙肺，分離肺組織，用止血鉗夾閉右肺門并結扎，立即取下右肺，PBS沖洗肺臟表面，用濾紙拭干，將肺組織給予4%多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋、切片，用于蘇木精-伊紅(HE)染色。
4.PU.1和IRF4 mRNA測定：離心處理BALF，留取沉淀，采用Trizol法抽提RNA，逆轉錄為cDNA，實時熒光PCR檢測PU.1 mRNA、IRF4 mRNA表達水平，引物由Primer 5.0軟件自行設計，引物由南京Genscript公司合成，引物序列分別為PU.1：5′-TGC TTCCCTTATCCACCCTTG-3′(上游)，5′-TCTTCTTGC TGCCTGTCTCC-3′(下游)；IRF4：5′-AGAATGCCAGG ACCACAGAG-3′(上游)，5′-CTTAGTCAGTCACCAA TCTCAGC-3′(下游)；內參照GAPDH：5′-AACTCC CATTCTTCCACCTTT-3′(上游)，5′-CTCTTGCTCTC AGTATCCTTG-3′(下游)。通過檢測模板梯度稀釋時的CT值的變化來評價目的基因和內參基因的擴增效率，采用相對定量法，以2-△△Ct表示樣本中目的基因相對表達含量。
5.IL-4測定：采用ELISA法檢測外周血IL-4含量，嚴格按照試劑盒說明書操作，采用全自動酶標儀依序測量450 nm處各孔的吸光度，通過標準曲線計算IL-4含量。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0軟件對數據進行分析，計量資料以x±s描述，組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，若數據符合方差齊性，采用LSD-t檢驗進行多重比較；若數據方差不齊，采用非參數秩和檢驗。相關性分析采用Pearson法。P＜0.05為差異有統計學意義。
結果
一 肺組織病理學變化
健康對照組在各時間點肺組織結構完整，肺泡間隔無增厚，無明顯炎癥反應和纖維化改變。肺纖維化組大鼠肺組織早期為肺泡炎表現，肺間質和肺泡腔內可見大量巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，此后肺泡炎隨時間推移逐漸減輕，第14 d部分肺泡結構消失，炎癥細胞浸潤稍減少，肺泡間隔增寬，成纖維細胞增生；第28 d肺泡結構破壞，肺泡結構紊亂，部分肺泡壁塌陷，肺泡間隔明顯增寬，細胞外基質增生，纖維沉積明顯，肺組織呈廣泛纖維化改變。地塞米松干預組肺泡結構存在，炎癥細胞浸潤減少，肺泡間隔增厚明顯減輕，肺纖維化程度明顯輕于肺纖維化組。結果見圖 1。
圖1
各組大鼠肺組織病理像(HE×100)
a.健康對照組：肺組織結構完整，肺泡間隔無增厚，無明顯炎癥反應和纖維化改變；b.地塞米松干預組第14 d，c.地塞米松干預組第28 d：肺泡結構存在，炎癥細胞浸潤減少，肺泡間隔輕微增厚；d.肺纖維化組第7 d，e.肺纖維化組第14 d，f.肺纖維化組第28 d：早期表現為肺間質和肺泡腔內大量巨噬細胞等炎癥細胞浸潤，第14 d時部分肺泡結構消失，炎癥細胞浸潤稍減少，肺泡間隔增寬，成纖維細胞增生，第28 d時肺組織呈廣泛纖維化改變
二 大鼠BALF中PU.1、IRF4 mRNA含量比較
肺纖維化組各時間點BALF中PU.1 mRNA含量明顯高于健康對照組，與肺纖維化組比較，地塞米松干預組PU.1 mRNA含量第14 d和第28 d明顯減低，差異均有統計學意義(P＜0.05)。肺纖維化組PU.1 mRNA在第7 d表達增加，第14 d達到高峰，第28 d有所下降。
肺纖維化組各時間點BALF中IRF4 mRNA含量明顯高于健康對照組，與肺纖維化組比較，地塞米松干預組第28dIRF4 mRNA含量明顯減低，差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見表 1。
表1
大鼠BALF中PU.1、IRF4 mRNA含量比較(n=10, x±s)
三 大鼠外周血IL-4含量比較
肺纖維化組IL-4含量在第7 d和第14 d明顯高于健康對照組，與肺纖維化組比較，地塞米松干預組第14 d含量明顯減低，差異有統計學意義(P＜0.05)，外周血IL-4含量第28 d三組差異未見明顯統計學意義。肺纖維化組IL-4在第7 d表達為增加趨勢，第14 d達到高峰，第28 d有所下降。結果見表 2。
表2
大鼠外周血IL-4含量比較(n=10, x±s, pg/mL)
四 相關性分析
肺纖維化組第14 d的IRF4 mRNA含量與IL-4含量呈正相關(r=0.044，P＜0.05)。
3 討論
Th9細胞是新近發現的一種CD4+輔助性T細胞，于2008年由Kuchroo實驗室和Stockinger實驗室最先報道，體外實驗研究表明Th9細胞在IL-4和轉化生長因子β(TGF-β)聯合誘導條件下由初始CD4+T細胞分化而來[4]，或TGF-β單獨存在下由Th2細胞轉化而來[5]。PU.1和IRF4是Th9細胞相對特應性的轉錄因子，PU.1是ETS轉錄因子家族成員，由Sfpi1基因編碼，PU.1促進幼稚淋巴細胞發育和增殖分化，參與未成熟淋巴細胞向T細胞方向分化；IRF4是干擾素調節因子家族成員，是分子量為52 kD的一種轉錄因子，它參與免疫細胞的分化成熟及免疫球蛋白的類型轉換[6-7]。
Th9細胞參與機體炎癥反應及多種免疫性疾病[8]。在呼吸系統疾病中Th9細胞在過敏性鼻炎、支氣管哮喘等疾病中均有表達。Hoppenot等[9]納入過敏性哮喘患者、過敏性鼻炎患者和正常人對照，分別測定血清Th9細胞、凋亡嗜酸粒細胞、IL-9和IL-5，發現過敏性哮喘患者Th9細胞表達量明顯高于其他兩組，而凋亡嗜酸粒細胞含量明顯減少，Th9細胞及其因子IL-9與氣道炎癥有關。Jones等[10]研究發現Th9細胞可以通過向肺部募集并激活肥大細胞導致肺部過敏性損傷。肺纖維化雖然病因未明，但損傷的肺泡上皮細胞、單核-巨噬細胞和淋巴細胞浸潤及其分泌的炎癥介質促進肺纖維化的發生發展。本研究旨在探討Th9細胞相關因子在肺纖維化中的炎癥作用。
本研究發現，大鼠BALF中PU.1 mRNA、IRF4 mRNA及IL-4在肺纖維化過程中尤其是早期肺泡炎階段表達量明顯升高，推測主要是因為Th9細胞及其相關因子作為炎癥細胞因子在肺纖維化過程中發揮炎癥損傷作用。有觀點認為肺纖維化是經過單一的炎癥反應階段之后快速出現異常的損傷修復[11]，肺纖維化主要包括肺泡炎癥階段和肺纖維化兩個階段，其中肺泡炎癥階段是肺纖維化發病的中心環節，它的持續存在與肺組織結構和功能不可逆損傷密切相關。活化巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞、損傷的肺泡上皮細胞及其釋放的多種蛋白酶、趨化因子、IL-1、IL-2、IL-8、膠原酶等均參與肺組織損傷及其修復的過程。PU.1綁定在IL-9基因位點上，通過促進IL-9基因組蛋白乙酰化促進Th9細胞的表達[12]。IRF4同樣與其他轉錄因子形成復合物共同調節Th9細胞基因的活性[13]。IL-4作為一種炎癥介質，參與多種疾病過程的炎癥反應。Th9細胞本身及通過分泌效應因子IL-9、IL-10[5]，主要在肺泡炎階段起作用，繼而促進肺纖維化發生發展。與肺纖維化組比較，地塞米松干預組PU.1、IRF、IL-4的含量不同程度的減低，表明地塞米松干預下肺組織的炎癥反應減輕。地塞米松作為糖皮質激素，通常認為其抗纖維化作用與抑制中性粒細胞、淋巴細胞浸潤，抑制巨噬細胞增殖和分泌等有關[14-15]。
本研究結果還表明，大鼠肺纖維化早期IRF4 mRNA與IL-4的表達量呈明顯正相關。Goswami等[16]認為IL-4可能通過STAT途徑激活IRF4轉錄因子，促進Th9細胞的表達。IL-4通過STAT6途徑激活B細胞激活轉錄因子(B cell activating transcription factor，BATF)，BATF可以作為IRF4的上游因子調節IRF4，并且與IRF4協同作用促進Th9細胞的表達[17]。
肺纖維化的發病機制目前尚未完全闡明，本研究結果初步顯示Th9細胞在致大鼠肺纖維化中起作用，這可能與轉錄因子PU.1和IRF4有關，并且IL-4可能通過激活轉錄因子IRF4起作用，具體機制仍需進一步研究。
