引用本文： 康小文, 孔凡武, 張薇, 王欣燕, 黃坤, 李兆國, 吳曉梅. 高糖經由 ROS 或 TGF-β1/PI3K/Akt 信號途徑促進肺腺癌 A549 細胞 HO-1 表達增加 . 中國呼吸與危重監護雜志, 2017, 16(1): 40-45. doi: 10.7507/1671-6205.201605052 復制
血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）是一種微粒體酶，在人和哺乳動物體內廣泛存在，參與多種生理和病理過程，是血紅素代謝的起始酶和限速酶，在細胞抗氧化應激、炎癥反應、增殖中起著重要作用。近年研究發現在多種腫瘤組織中 HO-1 表達增多，并已在人腺癌、前列腺癌、口腔鱗狀細胞癌、食管癌、黑色素瘤和胰腺癌等多種實體腫瘤研究中得到證實[1–2]。研究發現高糖增加腫瘤細胞的侵襲能力如 MCF-7 乳腺癌細胞[3–4]、胰腺癌細胞[5]。而且 HO-1 與腫瘤細胞的淋巴結轉移相關，與肺癌的進展相關[6]。非小細胞肺癌患者 HO-1 表達增多，有著更差的預后以及更高的轉移發生率[7]。糖尿病患者 HO-1 的表達上調[8]，然而在糖尿病合并肺癌的人群中 HO-1 表達情況尚不清楚。因此在本實驗中，我們在體外用高糖作用于肺腺癌上皮細胞系 A549 細胞，觀察高糖對 HO-1 蛋白和 mRNA 的表達及 HO-1 活性的影響及其潛在機制，為肺癌合并糖尿病人群臨床治療提供新的靶點。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
人 A549 細胞系（中科院上海細胞庫），DMEM高糖培養基（Hyclone 公司），DMEM 低糖培養基（Hyclone 公司），胎牛血清 FBS（Gibco 公司），胰酶 TRYPSIN（Invitrogen 公司），2′, 7′-dichloro- dihydrofluorescin diacetate（DCFH-DA，Sigma），活性氧（ROS）抑制劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC），人血紅素加氧酶 1（HO-1）酶聯免疫試劑盒，HO-1 引物；GAPDH 引物；高容量 cDNA 反轉錄試劑盒；SYBR Green PCR Master Mix（ABI Applied Biosystems 公司）。
1.2 實驗方法和檢測指標
1.2.1 細胞培養 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入 37 ℃ 的水浴鍋中復溫。在離心管中，加入約 5 ml低糖培養液培養液，將凍存管中解凍后的懸液吸出，加入離心管內的培養液中，吹打幾下，密封離心（1 000 r/min，5 min），棄上清，用 RPMI1640+10% FBS適當稀釋后，移入培養瓶中，置于培養箱中，37 ℃ 5% CO2常規培養。細胞生長至 80% 融合時，用胰蛋白酶消化傳代，繼續培養。為研究 A549 細胞功能，選擇第 3～15 代的 A549 細胞用于進一步實驗操作。
1.2.2 Western blot 檢測 HO-1 表達 Western blot 按照試劑盒說明進行，A549 細胞給予不同預處理后提取蛋白，然后測濃度、煮樣，在10% 的凝膠上電泳，300 mA 轉膜 50 min，在 5% 的脫脂牛奶中室溫封閉 2 h，在 4 ℃ 搖床孵育過夜，然后洗膜掃膜。β-actin 為內參照。
1.2.3 逆轉錄 PCR 技術 為觀察高糖等處理對 A549 細胞 HO-1 mRNA 表達水平的影響，進行 Real-time RT-PCR 的實驗研究。提取 A549 細胞 RNA，根據 Applied Biosystems 高通量 cDNA Reverse Transcription Kit 操作步驟完成，并放置于逆轉錄系統（Eppendorf Mastercycler公司）中進行 cDNA 合成。參照 ABI Applied Biosystems 公司的 SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒操作步驟進行。將 cDNA 樣本取出，用 Real-time PCR 實驗進行定量分析。總量 20 μl的Real-time PCR 反應體系主要由10 μl SYBR Green PCR Master Mix（ABI Applied Biosystems公司），1 μl 上游引物，1 μl 下游引物，1 μl cDNA 模板和去離子水 7 μl，組成 20 μl 總體系。將混合好的溶液加入 96 孔板中（冰上操作），瞬時離心。Realtime PCR反應主要在 ABI Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 7500 Real-time PCR 系統運行此實驗。反應條件為：95 ℃ 10 min 預變性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 個循環。溶解曲線為：95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min。所用引物均由 Primer 5 設計軟件進行設計。HO-1 基因的引物序列如下：HO-1 sense，5′-TTC TTC ACC TTC CCC AAC TA-3′；antisense，5′-GCA TAA AGC CCT ACA GCA AC-3′。
1.2.4 細胞 ROS 檢測 通過檢測 DCFH-DA 來檢測細胞內 ROS 的含量。其基本原理是 DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由通過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解后形成不能通過細胞膜的 DCFH，從而使探針很容易被裝載到細胞內，細胞內的 ROS 可以氧化無熒光的 DCFH 生成有熒光的 DCF，檢測 DCF 的熒光間接判斷細胞內活性氧的水平。將 A549 細胞根據實驗要求進行分組，分組處理后的 A549 細胞用于 ROS 檢測。用 PBS 輕輕的洗細胞 2 次，棄去 PBS，加入 10 μmol/L 的 DCFH-DA，避光 37 ℃，染色 45 min，然后用 PBS 清洗細胞，1 000g 離心。然后加入黑板內，在酶標儀下檢測OD 值。
1.2.5 HO-1 活性及 TGF-β1 檢測 A549 細胞給予不同預處理后，留取上清，用人 HO-1 酶聯免疫試劑盒和 TGF-β1 試劑盒，按照說明書操作，酶標儀檢測確定 HO-1 活性及高糖誘導細胞分泌 TGF-β1水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計分析軟件，計量數據以均數±標準差（ ）表示。使用非配對t 檢驗進行統計。P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 高糖增加 A549 細胞 HO-1 的表達
為了判斷高糖對 A549 細胞 HO-1 表達的影響，采用 25 mmol/L 高糖分別處理 A549 細胞 0、24、48、72 h，然后提取蛋白和 RNA 進行實驗。25 mmol/L高糖增加 A549 細胞 HO-1 表達并呈時間依賴性（圖 1a和圖 1c）。同時也給予0、10、25、40 mmol/L 濃度高糖處理 A549 細胞 48 h，結果顯示高糖增加 A549細胞 HO-1 表達呈濃度依賴性（圖 1b和圖 1d）。為了排除滲透壓的影響，用甘露醇 25 mmol/L 代替高糖處理細胞 48 h，結果顯示甘露醇沒有影響細胞 HO-1 的表達（圖 2）。
圖1
高糖對 HO-1 mRNA 和蛋白表達的影響
圖2
甘露醇對 HO-1 蛋白表達的影響
2.2 高糖增加A549細胞HO-1的活性
用酶標儀通過檢測膽紅素的生成量確定 HO-1活性，高糖處理細胞 48 h 或過氧化氫（500 μmol/L）處理細胞 2 h 增加了 HO-1 的活性，而甘露醇沒有增加 HO-1 活性，說明用抗氧化劑預處理細胞能夠明顯抑制高糖誘導 HO-1 活性的增加。結果見圖 3。
圖3
高糖和過氧化氫增加 A549 細胞 HO-1 酶活性
2.3 高糖誘導細胞 ROS 產生并介導 HO-1 表達
用 DCFH-DA 染色法檢測高糖對細胞內 ROS 產生的影響。為了確定高糖是否能誘導細胞產生 ROS 以及 ROS 對 HO-1 表達的影響，分別用正常糖、高糖、高糖加 NAC 100 μmol/L、甘露醇處理 A549 細胞 48 h，用過氧化氫處理細胞 2 h。與對照組比較，高糖組細胞內 ROS 產生顯著增多（圖 4a）。甘露醇未能誘導細胞內ROS產生（圖 4a）。如細胞預先用抗氧化劑 NAC 100 μmol/L 處理 30 min，然后給予高糖 25 mmol/L 作用于細胞 48 h，結果顯示和高糖組相比，NAC 顯著抑制細胞內 ROS 產生，并且顯著減弱高糖誘導的 HO-1 表達（圖 4c 和圖 4d）。為了判斷內源性氧化應激的角色，給予外源性過氧化氫 500 μmol/L 處理細胞 4 h，結果過氧化氫增加細胞內 ROS 產生（圖4 a），并且增加細胞 HO-1 表達和 HO-1 酶活性（圖 4b、圖 4d 和圖 3）。這些實驗結果顯示高糖增加細胞內 ROS 產生，并介導 HO-1 表達。
圖4
高糖誘導細胞 ROS 產生并介導 HO-1 表達
2.4 PI3K/Akt 信號途徑參與介導高糖誘導 HO-1表達
給予 PI3K 抑制劑（10 μmol/L）或 Akt 抑制劑（100 nmol/L）作用細胞 30 min，然后再給予高糖處理 48 h 或過氧化氫（500 μmol/L）2 h。結果顯示 PI3K 抑制劑（10 μmol/L）或 Akt 抑制劑（100 nmol/L）均不同程度地抑制高糖誘導 HO-1 表達（圖 5a），但 PI3K 抑制劑（10 μmol/L）或 Akt 抑制劑（100 nmol/L）沒有抑制過氧化氫誘導 HO-1 表達（圖5 b），提示 PI3K/Akt 信號途徑參與高糖誘導 HO-1 表達，但不依賴于細胞內 ROS 產生。
圖5
PI3K/Akt 信號途徑在高糖誘導 HO-1 表達中的角色
2.5 高糖誘導 TGF-β1 產生并介導 HO-1 表達
用高糖處理細胞 48 h 后收集細胞液上清，然后用 TGF-β1 試劑盒檢測 TGF-β1 的含量。結果顯示與對照組比較，高糖增加 TGF-β1 的產生，然而甘露醇和過氧化氫沒有誘導 TGF-β1 的產生（圖 6a）。為了進一步證明 TGF-β1 在高糖誘導 HO-1 表達的角色，用 TGF-β1 2 ng/ml 作用于細胞，結果顯示 TGF-β1誘導 A549 細胞 HO-1 表達增加，給予 PI3K 抑制劑（10 μmol/L）或 Akt 抑制劑（100 nmol/L）能夠顯著抑制 TGF-β1 誘導 HO-1 表達（圖 6b）。這些實驗結果表明 TGF-β1 經由 PI3K/Akt 信號途徑參與高糖誘導 HO-1 表達。
圖6
高糖誘導 TGF-β1 產生和 TGF-β1 在高糖誘導 HO-1 表達增加中的作用
3 討論
流行病學資料顯示糖尿病患者罹患各種惡性腫瘤的風險增加，如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌和子宮內膜癌等，并且促進腫瘤發展和轉移，這可能與糖尿病人群高水平的胰島素和胰島素樣生長因子相關，也可能與糖尿病微血管病變使血管更容易被腫瘤細胞侵襲相關[8]。與其他器官一樣，目前研究顯示糖尿病也可促進肺癌的發生發展和轉移，但糖尿病促進肺癌發展和轉移的機制尚不明確。
HO-1 在一些代謝紊亂疾病中升高[9–11]。糖尿病患者血中 HO-1 水平升高與年齡、性別和體重指數無明顯相關性，可能與一些特定器官損傷有關，如胰島或胰腺 β 細胞損傷。本實驗結果顯示高糖增加 HO-1 蛋白和 RNA 表達，而且伴隨 HO-1 表達的增加，同時 HO-1 的酶活性也增加，這一發現與視網膜內皮細胞的相關研究結果一致[12]。自發性糖尿病大鼠肝臟的 HO-1 表達水平較正常大鼠肝臟明顯升高，提示在慢性高血糖狀態下，HO-1 表達的升高可能參與了氧化性損傷的修復過程，高糖增加 HO-1表達的可能機制為高糖誘導 ROS 產生增加[13–14]。在 A549 細胞，正如在其他類型細胞一樣[12,15]，ROS 能夠促進 HO-1 表達上調[16]。本實驗結果顯示高糖誘導 ROS 產生，而抗氧化劑 NAC 能減少 ROS 的產生并且減弱高糖誘導 HO-1 的表達。本研究發現外源性 H2O2（500 μmol/L）可以增加 HO-1 的表達，這與在其他類型細胞相關研究結果一致[17–19]。
我們還發現 PI3K/Akt 信號途徑在高糖誘導細胞 HO-1 表達中起重要作用。文獻報道在其他類型細胞上 ROS 經 PI3K/Akt 信號途徑誘導 HO-1 表達上調[21–22]，本研究發現 PI3K/Akt 信號途徑的上游途徑不是 ROS 而是 TGF-β1。高糖可誘導細胞產生TGF-β1[20]，而 TGF-β1 能夠經由 PI3K/Akt 信號途徑上調 HO-1 表達[7]，TGF-β1 還可經由細胞核因子κB（NF-κB）和 p38 促分裂原活化蛋白激酶途徑[7]。上游途徑是 ROS 還是 TGF-β1 可能與細胞的類型或其他因素相關，本研究未深入探討。總之，目前的研究結果說明高糖上調 HO-1 表達至少部分是經過 ROS 或 TGF-β1/PI3K/Akt 信號途徑。
綜上所述，我們的研究發現高糖促進肺腺癌 A549 細胞 HO-1 表達增加，結合以往研究已經發現 HO-1 與肺癌的發展與轉移密切的相關，因此可以推測高糖可能通過 HO-1 增加促進肺腺癌的進展， HO-1 可能是一個潛在的肺癌治療靶點。
血紅素加氧酶（heme oxygenase，HO）是一種微粒體酶，在人和哺乳動物體內廣泛存在，參與多種生理和病理過程，是血紅素代謝的起始酶和限速酶，在細胞抗氧化應激、炎癥反應、增殖中起著重要作用。近年研究發現在多種腫瘤組織中 HO-1 表達增多，并已在人腺癌、前列腺癌、口腔鱗狀細胞癌、食管癌、黑色素瘤和胰腺癌等多種實體腫瘤研究中得到證實[1–2]。研究發現高糖增加腫瘤細胞的侵襲能力如 MCF-7 乳腺癌細胞[3–4]、胰腺癌細胞[5]。而且 HO-1 與腫瘤細胞的淋巴結轉移相關，與肺癌的進展相關[6]。非小細胞肺癌患者 HO-1 表達增多，有著更差的預后以及更高的轉移發生率[7]。糖尿病患者 HO-1 的表達上調[8]，然而在糖尿病合并肺癌的人群中 HO-1 表達情況尚不清楚。因此在本實驗中，我們在體外用高糖作用于肺腺癌上皮細胞系 A549 細胞，觀察高糖對 HO-1 蛋白和 mRNA 的表達及 HO-1 活性的影響及其潛在機制，為肺癌合并糖尿病人群臨床治療提供新的靶點。
1 材料與方法
1.1 實驗材料
人 A549 細胞系（中科院上海細胞庫），DMEM高糖培養基（Hyclone 公司），DMEM 低糖培養基（Hyclone 公司），胎牛血清 FBS（Gibco 公司），胰酶 TRYPSIN（Invitrogen 公司），2′, 7′-dichloro- dihydrofluorescin diacetate（DCFH-DA，Sigma），活性氧（ROS）抑制劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC），人血紅素加氧酶 1（HO-1）酶聯免疫試劑盒，HO-1 引物；GAPDH 引物；高容量 cDNA 反轉錄試劑盒；SYBR Green PCR Master Mix（ABI Applied Biosystems 公司）。
1.2 實驗方法和檢測指標
1.2.1 細胞培養 從液氮罐中取出凍存管，迅速放入 37 ℃ 的水浴鍋中復溫。在離心管中，加入約 5 ml低糖培養液培養液，將凍存管中解凍后的懸液吸出，加入離心管內的培養液中，吹打幾下，密封離心（1 000 r/min，5 min），棄上清，用 RPMI1640+10% FBS適當稀釋后，移入培養瓶中，置于培養箱中，37 ℃ 5% CO2常規培養。細胞生長至 80% 融合時，用胰蛋白酶消化傳代，繼續培養。為研究 A549 細胞功能，選擇第 3～15 代的 A549 細胞用于進一步實驗操作。
1.2.2 Western blot 檢測 HO-1 表達 Western blot 按照試劑盒說明進行，A549 細胞給予不同預處理后提取蛋白，然后測濃度、煮樣，在10% 的凝膠上電泳，300 mA 轉膜 50 min，在 5% 的脫脂牛奶中室溫封閉 2 h，在 4 ℃ 搖床孵育過夜，然后洗膜掃膜。β-actin 為內參照。
1.2.3 逆轉錄 PCR 技術 為觀察高糖等處理對 A549 細胞 HO-1 mRNA 表達水平的影響，進行 Real-time RT-PCR 的實驗研究。提取 A549 細胞 RNA，根據 Applied Biosystems 高通量 cDNA Reverse Transcription Kit 操作步驟完成，并放置于逆轉錄系統（Eppendorf Mastercycler公司）中進行 cDNA 合成。參照 ABI Applied Biosystems 公司的 SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒操作步驟進行。將 cDNA 樣本取出，用 Real-time PCR 實驗進行定量分析。總量 20 μl的Real-time PCR 反應體系主要由10 μl SYBR Green PCR Master Mix（ABI Applied Biosystems公司），1 μl 上游引物，1 μl 下游引物，1 μl cDNA 模板和去離子水 7 μl，組成 20 μl 總體系。將混合好的溶液加入 96 孔板中（冰上操作），瞬時離心。Realtime PCR反應主要在 ABI Applied Biosystems 公司的 ABI PRISM 7500 Real-time PCR 系統運行此實驗。反應條件為：95 ℃ 10 min 預變性，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共 40 個循環。溶解曲線為：95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min。所用引物均由 Primer 5 設計軟件進行設計。HO-1 基因的引物序列如下：HO-1 sense，5′-TTC TTC ACC TTC CCC AAC TA-3′；antisense，5′-GCA TAA AGC CCT ACA GCA AC-3′。
1.2.4 細胞 ROS 檢測 通過檢測 DCFH-DA 來檢測細胞內 ROS 的含量。其基本原理是 DCFH-DA 本身沒有熒光，可以自由通過細胞膜，進入細胞內后，可以被細胞內的酯酶水解后形成不能通過細胞膜的 DCFH，從而使探針很容易被裝載到細胞內，細胞內的 ROS 可以氧化無熒光的 DCFH 生成有熒光的 DCF，檢測 DCF 的熒光間接判斷細胞內活性氧的水平。將 A549 細胞根據實驗要求進行分組，分組處理后的 A549 細胞用于 ROS 檢測。用 PBS 輕輕的洗細胞 2 次，棄去 PBS，加入 10 μmol/L 的 DCFH-DA，避光 37 ℃，染色 45 min，然后用 PBS 清洗細胞，1 000g 離心。然后加入黑板內，在酶標儀下檢測OD 值。
1.2.5 HO-1 活性及 TGF-β1 檢測 A549 細胞給予不同預處理后，留取上清，用人 HO-1 酶聯免疫試劑盒和 TGF-β1 試劑盒，按照說明書操作，酶標儀檢測確定 HO-1 活性及高糖誘導細胞分泌 TGF-β1水平。
1.3 統計學方法
采用 SPSS 19.0 統計分析軟件，計量數據以均數±標準差（ ）表示。使用非配對t 檢驗進行統計。P＜0.05 為差異有統計學意義。
2 結果
2.1 高糖增加 A549 細胞 HO-1 的表達
為了判斷高糖對 A549 細胞 HO-1 表達的影響，采用 25 mmol/L 高糖分別處理 A549 細胞 0、24、48、72 h，然后提取蛋白和 RNA 進行實驗。25 mmol/L高糖增加 A549 細胞 HO-1 表達并呈時間依賴性（圖 1a和圖 1c）。同時也給予0、10、25、40 mmol/L 濃度高糖處理 A549 細胞 48 h，結果顯示高糖增加 A549細胞 HO-1 表達呈濃度依賴性（圖 1b和圖 1d）。為了排除滲透壓的影響，用甘露醇 25 mmol/L 代替高糖處理細胞 48 h，結果顯示甘露醇沒有影響細胞 HO-1 的表達（圖 2）。
圖1
高糖對 HO-1 mRNA 和蛋白表達的影響
圖2
甘露醇對 HO-1 蛋白表達的影響
2.2 高糖增加A549細胞HO-1的活性
用酶標儀通過檢測膽紅素的生成量確定 HO-1活性，高糖處理細胞 48 h 或過氧化氫（500 μmol/L）處理細胞 2 h 增加了 HO-1 的活性，而甘露醇沒有增加 HO-1 活性，說明用抗氧化劑預處理細胞能夠明顯抑制高糖誘導 HO-1 活性的增加。結果見圖 3。
圖3
高糖和過氧化氫增加 A549 細胞 HO-1 酶活性
2.3 高糖誘導細胞 ROS 產生并介導 HO-1 表達
用 DCFH-DA 染色法檢測高糖對細胞內 ROS 產生的影響。為了確定高糖是否能誘導細胞產生 ROS 以及 ROS 對 HO-1 表達的影響，分別用正常糖、高糖、高糖加 NAC 100 μmol/L、甘露醇處理 A549 細胞 48 h，用過氧化氫處理細胞 2 h。與對照組比較，高糖組細胞內 ROS 產生顯著增多（圖 4a）。甘露醇未能誘導細胞內ROS產生（圖 4a）。如細胞預先用抗氧化劑 NAC 100 μmol/L 處理 30 min，然后給予高糖 25 mmol/L 作用于細胞 48 h，結果顯示和高糖組相比，NAC 顯著抑制細胞內 ROS 產生，并且顯著減弱高糖誘導的 HO-1 表達（圖 4c 和圖 4d）。為了判斷內源性氧化應激的角色，給予外源性過氧化氫 500 μmol/L 處理細胞 4 h，結果過氧化氫增加細胞內 ROS 產生（圖4 a），并且增加細胞 HO-1 表達和 HO-1 酶活性（圖 4b、圖 4d 和圖 3）。這些實驗結果顯示高糖增加細胞內 ROS 產生，并介導 HO-1 表達。
圖4
高糖誘導細胞 ROS 產生并介導 HO-1 表達
2.4 PI3K/Akt 信號途徑參與介導高糖誘導 HO-1表達
給予 PI3K 抑制劑（10 μmol/L）或 Akt 抑制劑（100 nmol/L）作用細胞 30 min，然后再給予高糖處理 48 h 或過氧化氫（500 μmol/L）2 h。結果顯示 PI3K 抑制劑（10 μmol/L）或 Akt 抑制劑（100 nmol/L）均不同程度地抑制高糖誘導 HO-1 表達（圖 5a），但 PI3K 抑制劑（10 μmol/L）或 Akt 抑制劑（100 nmol/L）沒有抑制過氧化氫誘導 HO-1 表達（圖5 b），提示 PI3K/Akt 信號途徑參與高糖誘導 HO-1 表達，但不依賴于細胞內 ROS 產生。
圖5
PI3K/Akt 信號途徑在高糖誘導 HO-1 表達中的角色
2.5 高糖誘導 TGF-β1 產生并介導 HO-1 表達
用高糖處理細胞 48 h 后收集細胞液上清，然后用 TGF-β1 試劑盒檢測 TGF-β1 的含量。結果顯示與對照組比較，高糖增加 TGF-β1 的產生，然而甘露醇和過氧化氫沒有誘導 TGF-β1 的產生（圖 6a）。為了進一步證明 TGF-β1 在高糖誘導 HO-1 表達的角色，用 TGF-β1 2 ng/ml 作用于細胞，結果顯示 TGF-β1誘導 A549 細胞 HO-1 表達增加，給予 PI3K 抑制劑（10 μmol/L）或 Akt 抑制劑（100 nmol/L）能夠顯著抑制 TGF-β1 誘導 HO-1 表達（圖 6b）。這些實驗結果表明 TGF-β1 經由 PI3K/Akt 信號途徑參與高糖誘導 HO-1 表達。
圖6
高糖誘導 TGF-β1 產生和 TGF-β1 在高糖誘導 HO-1 表達增加中的作用
3 討論
流行病學資料顯示糖尿病患者罹患各種惡性腫瘤的風險增加，如肝癌、胰腺癌、乳腺癌、結腸癌和子宮內膜癌等，并且促進腫瘤發展和轉移，這可能與糖尿病人群高水平的胰島素和胰島素樣生長因子相關，也可能與糖尿病微血管病變使血管更容易被腫瘤細胞侵襲相關[8]。與其他器官一樣，目前研究顯示糖尿病也可促進肺癌的發生發展和轉移，但糖尿病促進肺癌發展和轉移的機制尚不明確。
HO-1 在一些代謝紊亂疾病中升高[9–11]。糖尿病患者血中 HO-1 水平升高與年齡、性別和體重指數無明顯相關性，可能與一些特定器官損傷有關，如胰島或胰腺 β 細胞損傷。本實驗結果顯示高糖增加 HO-1 蛋白和 RNA 表達，而且伴隨 HO-1 表達的增加，同時 HO-1 的酶活性也增加，這一發現與視網膜內皮細胞的相關研究結果一致[12]。自發性糖尿病大鼠肝臟的 HO-1 表達水平較正常大鼠肝臟明顯升高，提示在慢性高血糖狀態下，HO-1 表達的升高可能參與了氧化性損傷的修復過程，高糖增加 HO-1表達的可能機制為高糖誘導 ROS 產生增加[13–14]。在 A549 細胞，正如在其他類型細胞一樣[12,15]，ROS 能夠促進 HO-1 表達上調[16]。本實驗結果顯示高糖誘導 ROS 產生，而抗氧化劑 NAC 能減少 ROS 的產生并且減弱高糖誘導 HO-1 的表達。本研究發現外源性 H2O2（500 μmol/L）可以增加 HO-1 的表達，這與在其他類型細胞相關研究結果一致[17–19]。
我們還發現 PI3K/Akt 信號途徑在高糖誘導細胞 HO-1 表達中起重要作用。文獻報道在其他類型細胞上 ROS 經 PI3K/Akt 信號途徑誘導 HO-1 表達上調[21–22]，本研究發現 PI3K/Akt 信號途徑的上游途徑不是 ROS 而是 TGF-β1。高糖可誘導細胞產生TGF-β1[20]，而 TGF-β1 能夠經由 PI3K/Akt 信號途徑上調 HO-1 表達[7]，TGF-β1 還可經由細胞核因子κB（NF-κB）和 p38 促分裂原活化蛋白激酶途徑[7]。上游途徑是 ROS 還是 TGF-β1 可能與細胞的類型或其他因素相關，本研究未深入探討。總之，目前的研究結果說明高糖上調 HO-1 表達至少部分是經過 ROS 或 TGF-β1/PI3K/Akt 信號途徑。
綜上所述，我們的研究發現高糖促進肺腺癌 A549 細胞 HO-1 表達增加，結合以往研究已經發現 HO-1 與肺癌的發展與轉移密切的相關，因此可以推測高糖可能通過 HO-1 增加促進肺腺癌的進展， HO-1 可能是一個潛在的肺癌治療靶點。
