引用本文： 黃云, 黃文杰. 雙重氧化酶與呼吸系統關系的研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(1): 92-94. doi: 10.7507/1671-6205.2016023 復制
氧化應激是導致呼吸系統疾病的一個主要原因。近來越來越多的證據表明NADPH氧化酶在呼吸系統產生活性氧(ROS)過程中發揮重要作用。NADPH氧化酶體系現在已基本確定7種氧化酶(NOX)同源異構體，包括NOX1-5、DUOX1、DUOX2，兩種組織亞基(p47phox、NOXO1)，兩種激活亞基(p67phox、NOXA1)，以及兩種雙重氧化酶(DUOX)特定的成熟因素(DUOXA1和DUOXA2)[1]。NOX酶家族廣泛分布在各種組織，但高表達于特殊的器官或細胞類型，如NOX1在結腸，NOX2在吞噬細胞，NOX3在內耳，NOX4在腎臟，NOX5在胚胎組織，DUOX1和DUOX2在甲狀腺)[2]。最近研究表明DUOX1和DUOX2在呼吸道也廣泛表達，可能參與呼吸道宿主防御和信號轉導。本文主要對呼吸系統中DUOX的作用進行總結。
一 DUOX的結構
DUOX包括DUOX1、DUOX2兩個亞型，均屬于NOX家族，除了具有NOX家族共有的兩大結構域，即部分伸向胞漿的C末端和疏水跨膜區N末端，其中C末端包含有NADPH和FAD結合位點；N末端含有6個保守的跨膜區，也叫跨膜A單環，其中在第3個和第5個跨膜區各有2個結合亞鐵血紅素的保守組氨酸殘基[1, 3-4]；在N末端還有2個EF手結構域，此結構域被認為是鈣離子(Ca2+)的結合位點[3]；在N末端還有1個髓過氧化物酶(myelopero-xidase enzyme properties，MPO)樣胞外域(即第7個跨膜區)，因此也叫做雙功能氧化酶[1, 3]。
二 DUOX的分布
DUOX首先發現于甲狀腺，DUOX1還在人的肺、胰腺、胎盤、前列腺、睪丸和唾液腺中高表達[5]，DUOX2在人的氣管、胃、結腸和直腸中高表達[5-7]。這兩個基因均位于15號染色體，呈頭對頭排列，中間相隔15.8 kB，分別被長度為150 bp和250 bp的第一個外顯子區域調控[8]。在呼吸道不同上皮細胞中表達最廣泛的NADPH氧化酶是DUOX1和DUOX2。在原代正常人鼻腔上皮細胞(NHNECs)[9-10]、細胞分離培養的人和鼠氣管支氣管上皮細胞[11-13]、人Ⅱ型肺泡上皮細胞[14]均可檢測到DUOX mRNA和蛋白表達。
三 DUOX與ROS及其在呼吸系統的生理功能
ROS是氧衍生的小分子物質，包括超氧化物、羥自由基和過氧化氫，以及一些既是氧化因子又能夠很輕易地轉換成自由基的物質如次氯酸、臭氧及單態氧等。DUOX主要催化產生其中的過氧化氫(H2O2)，其中DUOX2對H2O2的產生起主要作用[15]。
1．DUOX參與呼吸道宿主防御功能：氣道上皮細胞中DUOX的主要功能是支持乳酸過氧化物酶(即DUOX/LPO系統)產生殺菌的OSCN-[16-18]，活化的DUOX釋放H2O2誘導免疫細胞向傷口遷移[19]，從而起到宿主防御作用。當受到胞外刺激因子的刺激時，DUOX蛋白過表達，產生過高濃度的H2O2，導致人體疾病的發生和發展[20]。研究還發現DUOX1和DUOX2在發泡劑誘導的人氣道上皮細胞炎癥因子白細胞介素6(IL-6)的分泌中起重要作用[21]。
2．DUOX參與呼吸道信號轉導功能：在肺泡上皮中，DUOX介導的H2O2能夠降低磷酸酶活性，提高蛋白酪氨酸磷酸化，從而影響信號轉導；H2O2能活化酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)[22]，而TPKs能控制很多信號轉導蛋白磷酸化狀態，因此DUOX能夠調節細胞增殖、分化、生長、代謝和生存；H2O2還可以通過間接損傷DNA、類脂和蛋白，或是直接通過ROS介導激活信號通路(如SAPK/JNK、ERK1/2和p38)來誘導細胞凋亡。高濃度的H2O2能抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)，導致細胞從凋亡轉變為壞死。
四 DUOX在呼吸系統疾病中的作用
1.呼吸道感染
(1)?呼吸道病毒感染：呼吸道病毒感染時可誘導DUOX2表達。最初通過病毒的模擬物來刺激人初級氣道上皮細胞，觀察到DUOX2表達增高，進一步研究發現副粘病毒、仙臺病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)和甲型流感病毒均可誘導DUOX2基因和蛋白水平上調，且與病毒復制呈正相關[23-24]。這可能提示DUOX2在限制病毒復制中起重要作用，因為IFN-β和IFN-γ的持續產生、核因子κB(NF-κB)的活化以及隨后的IL-8的表達均需要DUOX介導的H2O2的參與[10, 24-25]。DUOX1在病毒感染后上皮傷口愈合中也起重要作用，DUOX1源性H2O2對人支氣管上皮細胞傷口閉合以及鼠支氣管上皮細胞表皮生長因子受體(EGFR)的活化至關重要[26-29]，這有助于保護上皮的完整性，維持氣道的屏障功能。還有研究發現碘化物可以激活DUOX產生ROS來殺滅病毒，Derscheid等[30]通過對與嬰兒疾病情況相似的小羊羔進行研究，建立RSV感染模型，實驗組通過胃腸道給予碘化鉀處理，結果發現實驗組在肺損傷程度、RSV抗體表達、IL-8方面均較對照組降低，提示高劑量碘化鉀可以提高呼吸道DUOX氧化應激水平，從而降低RSV感性的嚴重性，治療RSV感染。
(2)?呼吸道細菌感染：通過純化的銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、金黃色葡萄球菌菌株刺激呼吸道上皮細胞，發現只有銅綠假單胞菌能使DUOX活化產生H2O2。通過比較突變型的銅綠假單胞菌菌株，發現3型分泌系統等毒力因子參與DUOX活化[31]。銅綠假單胞菌是呼吸道條件致病菌，Rada等[32]研究發現，用銅綠假單胞菌刺激氣道上皮細胞后，細胞DUOX介導的H2O2量減少，而且刺激時間越長，產生H2O2量越少，超過4 h后完全無H2O2產生。同時，銅綠假單胞菌對DUOX的抑制作用與它產生綠膿毒素的能力有關，進一步實驗證實綠膿毒素通過阻斷細胞炎癥因子通路來抑制氣道上皮細胞DUOX活化，從而躲避機體免疫系統的攻擊[33]。銅綠假單胞菌感染免疫低下人群的機制尚不清楚，人氣道上皮通過產生ROS來抵抗病原菌，而銅綠假單胞菌能通過產生綠膿毒素來抵消DUOX產生的ROS的攻擊，這可能為銅綠假單胞菌及其他條件致病菌感染的治療提供新靶點。
2．氣道變應性疾病：變應性鼻炎、哮喘等疾病發病機制復雜，氣道高反應性是其共同的病理生理特征。當氣道上皮細胞受到體內外炎性因素刺激時，細胞中的各種氧化酶可被激活，產生大量的ROS，引起氣道上皮的損傷進而導致氣道高反應性和疾病的發生。在小鼠哮喘模型研究中，氣道上皮細胞蛋白酶激活受體2(PAR-2)激活可以導致DUOX-2/ROS通路上調，然后通過氧化應激和細胞凋亡途徑調節氣道反應性和炎癥[34]。另一個對DUOXA缺陷小鼠模型(缺乏DUOX1和DUOX2的成熟因子)的研究顯示，DUOXA成熟因子對于分化成熟的氣道上皮細胞H2O2的產生是必需的，相對于野生型的小鼠(DUOX完整)，DUOXA缺陷小鼠肺泡灌洗液中黏膜細胞化生、Th2細胞因子、中性粒細胞、IL-6的水平均降低。另外，乙酰甲膽堿可以增加野生型小鼠的氣道阻力，而DUOXA缺陷小鼠沒有明顯變化[35]。這說明DUOX源性H2O2在過敏性氣道的信號轉導中起重要作用。另有研究發現組胺通過H1受體激活氣道上皮細胞DUOX酶來釋放H2O2，而且與哮喘有關的Th2細胞因子能促進這一過程[36]。
3．慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)：有研究表明，相對于從不吸煙人群，正在吸煙人群中氣管和支氣管上皮細胞DUOX1表達顯著下調，而DUOX2上調；曾經吸煙合并輕中度慢阻肺人群中，相對于從不吸煙人群，DUOX1和DUOX2表達均下調，相對于曾經吸煙人群，僅有DUOX1下調；而肺泡上皮細胞中DUOX1和DUOX2表達量各組沒有顯著差異[37]。這提示在氣道上皮中DUOX1和DUOX2的表達與吸煙和慢阻肺的關系是多種多樣的。
4．肺癌：肺癌的發展與許多腫瘤抑制基因或細胞修復基因異常甲基化從而導致轉錄沉默有關。DUOX1和DUOX2作為氣道ROS的主要來源之一，有研究發現幾乎所有的肺癌細胞均不表達有功能的DUOX1和DUOX2，兩個與DUOX轉錄和功能有關的基因DUOXA1和DUOXA2在肺癌細胞和肺癌組織表達也下調[38]，提示DUOX1和DUOX2在肺癌中通常是沉默基因。人的DUOX基因所有啟動子包含CpG島，考慮DUOX1和DUOX2啟動子的異常甲基化是DUOX功能缺失的主要原因，這些區域的甲基化可能不僅調控基因沉默，還可能是導致DNA損傷的化學致癌物的靶點，研究DUOX啟動子甲基化有助于為肺癌治療提供新方向。
五 結語
越來越多的證據顯示DUOX源性H2O2與呼吸道宿主防御和信號轉導有關，對呼吸道上皮細胞的生理功能發揮著重要作用。近年來逐漸增多的研究證明DUOX還參與了呼吸系統疾病的發生和發展，但對其具體作用機制、相互作用、有效的特異性抑制劑以及與腫瘤等疾病的關系的了解仍非常有限，需進一步研究。DUOX特異性抑制劑的應用可能為生物醫學的發展以及相關疾病的臨床治療提供新突破和新的藥物靶點。
氧化應激是導致呼吸系統疾病的一個主要原因。近來越來越多的證據表明NADPH氧化酶在呼吸系統產生活性氧(ROS)過程中發揮重要作用。NADPH氧化酶體系現在已基本確定7種氧化酶(NOX)同源異構體，包括NOX1-5、DUOX1、DUOX2，兩種組織亞基(p47phox、NOXO1)，兩種激活亞基(p67phox、NOXA1)，以及兩種雙重氧化酶(DUOX)特定的成熟因素(DUOXA1和DUOXA2)[1]。NOX酶家族廣泛分布在各種組織，但高表達于特殊的器官或細胞類型，如NOX1在結腸，NOX2在吞噬細胞，NOX3在內耳，NOX4在腎臟，NOX5在胚胎組織，DUOX1和DUOX2在甲狀腺)[2]。最近研究表明DUOX1和DUOX2在呼吸道也廣泛表達，可能參與呼吸道宿主防御和信號轉導。本文主要對呼吸系統中DUOX的作用進行總結。
一 DUOX的結構
DUOX包括DUOX1、DUOX2兩個亞型，均屬于NOX家族，除了具有NOX家族共有的兩大結構域，即部分伸向胞漿的C末端和疏水跨膜區N末端，其中C末端包含有NADPH和FAD結合位點；N末端含有6個保守的跨膜區，也叫跨膜A單環，其中在第3個和第5個跨膜區各有2個結合亞鐵血紅素的保守組氨酸殘基[1, 3-4]；在N末端還有2個EF手結構域，此結構域被認為是鈣離子(Ca2+)的結合位點[3]；在N末端還有1個髓過氧化物酶(myelopero-xidase enzyme properties，MPO)樣胞外域(即第7個跨膜區)，因此也叫做雙功能氧化酶[1, 3]。
二 DUOX的分布
DUOX首先發現于甲狀腺，DUOX1還在人的肺、胰腺、胎盤、前列腺、睪丸和唾液腺中高表達[5]，DUOX2在人的氣管、胃、結腸和直腸中高表達[5-7]。這兩個基因均位于15號染色體，呈頭對頭排列，中間相隔15.8 kB，分別被長度為150 bp和250 bp的第一個外顯子區域調控[8]。在呼吸道不同上皮細胞中表達最廣泛的NADPH氧化酶是DUOX1和DUOX2。在原代正常人鼻腔上皮細胞(NHNECs)[9-10]、細胞分離培養的人和鼠氣管支氣管上皮細胞[11-13]、人Ⅱ型肺泡上皮細胞[14]均可檢測到DUOX mRNA和蛋白表達。
三 DUOX與ROS及其在呼吸系統的生理功能
ROS是氧衍生的小分子物質，包括超氧化物、羥自由基和過氧化氫，以及一些既是氧化因子又能夠很輕易地轉換成自由基的物質如次氯酸、臭氧及單態氧等。DUOX主要催化產生其中的過氧化氫(H2O2)，其中DUOX2對H2O2的產生起主要作用[15]。
1．DUOX參與呼吸道宿主防御功能：氣道上皮細胞中DUOX的主要功能是支持乳酸過氧化物酶(即DUOX/LPO系統)產生殺菌的OSCN-[16-18]，活化的DUOX釋放H2O2誘導免疫細胞向傷口遷移[19]，從而起到宿主防御作用。當受到胞外刺激因子的刺激時，DUOX蛋白過表達，產生過高濃度的H2O2，導致人體疾病的發生和發展[20]。研究還發現DUOX1和DUOX2在發泡劑誘導的人氣道上皮細胞炎癥因子白細胞介素6(IL-6)的分泌中起重要作用[21]。
2．DUOX參與呼吸道信號轉導功能：在肺泡上皮中，DUOX介導的H2O2能夠降低磷酸酶活性，提高蛋白酪氨酸磷酸化，從而影響信號轉導；H2O2能活化酪氨酸蛋白激酶(tyrosine protein kinase，TPK)[22]，而TPKs能控制很多信號轉導蛋白磷酸化狀態，因此DUOX能夠調節細胞增殖、分化、生長、代謝和生存；H2O2還可以通過間接損傷DNA、類脂和蛋白，或是直接通過ROS介導激活信號通路(如SAPK/JNK、ERK1/2和p38)來誘導細胞凋亡。高濃度的H2O2能抑制半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspases)，導致細胞從凋亡轉變為壞死。
四 DUOX在呼吸系統疾病中的作用
1.呼吸道感染
(1)?呼吸道病毒感染：呼吸道病毒感染時可誘導DUOX2表達。最初通過病毒的模擬物來刺激人初級氣道上皮細胞，觀察到DUOX2表達增高，進一步研究發現副粘病毒、仙臺病毒、呼吸道合胞病毒(RSV)和甲型流感病毒均可誘導DUOX2基因和蛋白水平上調，且與病毒復制呈正相關[23-24]。這可能提示DUOX2在限制病毒復制中起重要作用，因為IFN-β和IFN-γ的持續產生、核因子κB(NF-κB)的活化以及隨后的IL-8的表達均需要DUOX介導的H2O2的參與[10, 24-25]。DUOX1在病毒感染后上皮傷口愈合中也起重要作用，DUOX1源性H2O2對人支氣管上皮細胞傷口閉合以及鼠支氣管上皮細胞表皮生長因子受體(EGFR)的活化至關重要[26-29]，這有助于保護上皮的完整性，維持氣道的屏障功能。還有研究發現碘化物可以激活DUOX產生ROS來殺滅病毒，Derscheid等[30]通過對與嬰兒疾病情況相似的小羊羔進行研究，建立RSV感染模型，實驗組通過胃腸道給予碘化鉀處理，結果發現實驗組在肺損傷程度、RSV抗體表達、IL-8方面均較對照組降低，提示高劑量碘化鉀可以提高呼吸道DUOX氧化應激水平，從而降低RSV感性的嚴重性，治療RSV感染。
(2)?呼吸道細菌感染：通過純化的銅綠假單胞菌、洋蔥伯克霍爾德菌、金黃色葡萄球菌菌株刺激呼吸道上皮細胞，發現只有銅綠假單胞菌能使DUOX活化產生H2O2。通過比較突變型的銅綠假單胞菌菌株，發現3型分泌系統等毒力因子參與DUOX活化[31]。銅綠假單胞菌是呼吸道條件致病菌，Rada等[32]研究發現，用銅綠假單胞菌刺激氣道上皮細胞后，細胞DUOX介導的H2O2量減少，而且刺激時間越長，產生H2O2量越少，超過4 h后完全無H2O2產生。同時，銅綠假單胞菌對DUOX的抑制作用與它產生綠膿毒素的能力有關，進一步實驗證實綠膿毒素通過阻斷細胞炎癥因子通路來抑制氣道上皮細胞DUOX活化，從而躲避機體免疫系統的攻擊[33]。銅綠假單胞菌感染免疫低下人群的機制尚不清楚，人氣道上皮通過產生ROS來抵抗病原菌，而銅綠假單胞菌能通過產生綠膿毒素來抵消DUOX產生的ROS的攻擊，這可能為銅綠假單胞菌及其他條件致病菌感染的治療提供新靶點。
2．氣道變應性疾病：變應性鼻炎、哮喘等疾病發病機制復雜，氣道高反應性是其共同的病理生理特征。當氣道上皮細胞受到體內外炎性因素刺激時，細胞中的各種氧化酶可被激活，產生大量的ROS，引起氣道上皮的損傷進而導致氣道高反應性和疾病的發生。在小鼠哮喘模型研究中，氣道上皮細胞蛋白酶激活受體2(PAR-2)激活可以導致DUOX-2/ROS通路上調，然后通過氧化應激和細胞凋亡途徑調節氣道反應性和炎癥[34]。另一個對DUOXA缺陷小鼠模型(缺乏DUOX1和DUOX2的成熟因子)的研究顯示，DUOXA成熟因子對于分化成熟的氣道上皮細胞H2O2的產生是必需的，相對于野生型的小鼠(DUOX完整)，DUOXA缺陷小鼠肺泡灌洗液中黏膜細胞化生、Th2細胞因子、中性粒細胞、IL-6的水平均降低。另外，乙酰甲膽堿可以增加野生型小鼠的氣道阻力，而DUOXA缺陷小鼠沒有明顯變化[35]。這說明DUOX源性H2O2在過敏性氣道的信號轉導中起重要作用。另有研究發現組胺通過H1受體激活氣道上皮細胞DUOX酶來釋放H2O2，而且與哮喘有關的Th2細胞因子能促進這一過程[36]。
3．慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)：有研究表明，相對于從不吸煙人群，正在吸煙人群中氣管和支氣管上皮細胞DUOX1表達顯著下調，而DUOX2上調；曾經吸煙合并輕中度慢阻肺人群中，相對于從不吸煙人群，DUOX1和DUOX2表達均下調，相對于曾經吸煙人群，僅有DUOX1下調；而肺泡上皮細胞中DUOX1和DUOX2表達量各組沒有顯著差異[37]。這提示在氣道上皮中DUOX1和DUOX2的表達與吸煙和慢阻肺的關系是多種多樣的。
4．肺癌：肺癌的發展與許多腫瘤抑制基因或細胞修復基因異常甲基化從而導致轉錄沉默有關。DUOX1和DUOX2作為氣道ROS的主要來源之一，有研究發現幾乎所有的肺癌細胞均不表達有功能的DUOX1和DUOX2，兩個與DUOX轉錄和功能有關的基因DUOXA1和DUOXA2在肺癌細胞和肺癌組織表達也下調[38]，提示DUOX1和DUOX2在肺癌中通常是沉默基因。人的DUOX基因所有啟動子包含CpG島，考慮DUOX1和DUOX2啟動子的異常甲基化是DUOX功能缺失的主要原因，這些區域的甲基化可能不僅調控基因沉默，還可能是導致DNA損傷的化學致癌物的靶點，研究DUOX啟動子甲基化有助于為肺癌治療提供新方向。
五 結語
越來越多的證據顯示DUOX源性H2O2與呼吸道宿主防御和信號轉導有關，對呼吸道上皮細胞的生理功能發揮著重要作用。近年來逐漸增多的研究證明DUOX還參與了呼吸系統疾病的發生和發展，但對其具體作用機制、相互作用、有效的特異性抑制劑以及與腫瘤等疾病的關系的了解仍非常有限，需進一步研究。DUOX特異性抑制劑的應用可能為生物醫學的發展以及相關疾病的臨床治療提供新突破和新的藥物靶點。