引用本文： 李鐳, 朱盈盈, 劉丹, 張立, 李為民. 循環腫瘤細胞在非小細胞肺癌中的研究進展. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(1): 87-91. doi: 10.7507/1671-6205.2016022 復制
循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)指從腫瘤原發灶或轉移灶脫落后進入血液循環的腫瘤細胞。它可通過被動的“脫落(shedding)”或主動的“上皮-基質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)”進入血液循環，并參與腫瘤的早期轉移[1-3]。既往研究表明，CTC與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的預后密切相關[4-6]；并且隨著生物靶向治療的發展、精準醫學概念的提出，對治療反應進行實時監測顯得尤為重要，因此作為“液體活檢(liquid biopsy)”[7]的重要媒介，CTC逐漸受到重視。然而，由于檢測陽性率低、檢測標準不統一、費用昂貴等多種因素，現階段CTC仍較難應用到臨床工作中。現就CTC的主要檢測方法及其與NSCLC診斷、治療、預后的關系作一綜述。
一 CTC的富集、分離與檢測
CTC在外周血中十分稀少，其密度約為1個/(105~107)個外周血單核細胞[8]。為方便后續研究，須先從外周血中分離并富集CTC，該步驟也是現階段限制CTC領域發展的重要瓶頸。目前常用的分離富集技術主要分為兩大類，分別為基于物理特性的分離技術和基于生物特性的分離技術。前者利用CTC及正常血細胞在大小、密度、電荷、可變形性等方面的差異，對CTC進行富集[9]。常用的技術包括ISET(isolation by size of epithelial tumor cells)法[10-11]、密度梯度離心分離法(density gradient centrifugation)[12]以及新型的3D微型過濾器(three-dimensional microfilter)[13]。上述方法因不具備特異性，可能出現假陽性[14]。后者則利用CTC與正常血細胞表面抗原的差異對二者進行分離，包括陽性選擇(選擇CTC表達而正常血細胞不表達的表面抗原)、陰性選擇(剔除正常血細胞表達而CTC不表達的表面抗原)[15]。目前應用較為成熟的表面抗原為EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)[16]，已作為陽性選擇的主要指標應用在多種分離富集技術中，但此類技術可能受到EMT效應的影響，降低CTC分離率[17]。
目前常用的CTC檢測技術主要包括以下幾種。(1)?反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)：RT-PCR通過檢測外周血中腫瘤細胞特異的DNA或RNA，間接證明CTC的存在。該技術敏感性高，但易受外界環境的影響，出現假陽性。同時，由于破壞了細胞結構，無法對CTC進行后續計數及細胞形態方面的分析[18-19]。(2)?Cell Search System：該技術的理論基礎是將CTC定義為EpCAM(+)CK(+)DAPI(+)CD45(-)的細胞，通過吸附EpCAM的免疫磁珠富集CTC，并使用CD45、細胞角蛋白8、18、19(CK-8，18，19)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)對細胞進行熒光染色、計數、拍照及其他分析。該技術為目前唯一得到美國FDA認證的CTC分離檢測技術，被批準應用于轉移性乳腺癌、結直腸癌及前列腺癌。但該技術敏感性低，且同樣可能受EMT效應影響出現假陰性[20-21]。此外，該技術在NSCLC中的應用仍存在爭議。(3)?流式細胞術：該技術借助攜帶熒光物質的特異性抗體，與CTC表面的腫瘤細胞特異性抗原結合，后續通過流式細胞儀對CTC進行分離、計數及其他檢測[22]。該方法可避免EMT效應的影響，但現階段缺乏公認的腫瘤細胞特異性抗原，各研究間采用的抗體多樣，異質性較大。(4)?CTC芯片：該技術可根據不同的研究需要，將相應的磁珠及特異性抗體整合到同一芯片上，分離、檢測CTC。既往研究證實該方法敏感性、特異性均較高，且操作簡便，但價格昂貴，難以投入臨床使用[23]。CTC常用檢測技術的比較見表 1。
表1
CTC常用檢測技術的比較
二 CTC與NSCLC的診斷及其與臨床特征的相關性
CTC因其采樣簡便，且在腫瘤早期即可進入外周血液循環，因此曾被作為NSCLC早期診斷的重要潛在手段。目前對于CTC的分離檢測手段多樣，在各研究中得到的CTC陽性率及平均水平波動較大。Mascalchi等[24]采用Screen Cell技術(通過細胞大小鑒別CTC)，檢測26例確診NSCLC(均為Ⅲ~Ⅳ期)患者外周血，17例(65%)檢出CTC，計數為(6.8±3.7)/3 mL。而采用Cell Search System進行檢測得到的CTC陽性率則普遍較低，Muinelo-Romay等[25]在43例ⅢB~Ⅳ期NSCLC患者中，僅發現18例(41.9%)患者存在CTC，計數為(18.9±14.8)/7.5 mL；Krebs等[26]納入101例NSCLC患者(ⅢA期14例、ⅢB期27例、Ⅳ期60例)，并定義CTC≥2/7.5 mL為CTC(+)，結果表明21例(21%)為CTC(+)；而在Chen等[27]的研究中，169例NSCLC患者僅40例(23.7%)檢出CTC，且Ⅰ期患者中未檢測到CTC。總而言之，早期NSCLC患者外周血CTC陽性率極低，現階段難以用于NSCLC的早期診斷。
部分研究表明，CTC結合其他實驗室指標可作為鑒別良惡性病變的重要手段。Chen等[28]將756例受試者分為測試組和驗證組，其中測試組納入377例(肺癌236例、良性肺疾病113例、健康受試者28例)，驗證組納入379例(肺癌237例、良性肺疾病114例、健康受試者28例)。研究發現，與癌胚抗原(CEA)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、細胞角蛋白19血清片段21-1(CYFRA21-1)等常用的腫瘤標志物相比，CTC在鑒別肺部良惡性病變方面具
有更高的敏感性(測試組72.46%，驗證組76.37%，P < 0.001)及特異性(測試組88.65%，驗證組82.39%，P < 0.001)，且結合上述4項指標可顯著提高診斷效能。Yu等[29]研究發現，當閾值設定為8.64/3 mL時，CTC用于診斷NSCLC的敏感性為72.3%，特異性為84.1%，ROC曲線下面積(AUC)為0.823(95%CI 0.773~0.874)，其診斷效能明顯高于NSE、CEA、糖類抗原125(CA125)、CYFRA21-1及鱗狀細胞癌相關抗原(SCC Ag)等腫瘤標志物。
此外，既往大量研究表明CTC水平與NSCLC患者TNM分期、分化程度、遠處轉移等臨床特征相關。Chen等[28]分析測試組、驗證組的數據發現，肺癌患者CTC水平(測試組11.64±8.6，驗證組12.41±9.02)明顯高于良性肺疾病患者(測試組6.60±5.21，驗證組6.95±5.45，P < 0.001)及健康受試者(測試組5.72±4.49，驗證組5.94±4.57，P < 0.001)；此外，Ⅰ~Ⅱ期肺癌患者CTC水平(10.17±6.23)也較Ⅲ期(11.96±8.23，P < 0.001)及Ⅳ期(12.44±9.02，P < 0.001)低。上述結果與另兩項研究[26, 29]一致，但與Mascalchi等[24]的研究結果相反。此外，尚有研究發現CTC水平隨腫瘤直徑增大[29]、分化程度降低[27]、骨轉移[26, 30]及肝轉移[26]的出現而升高。CTC與NSCLC診斷及臨床特征的相關研究見表 2。
表2
CTC與NSCLC診斷及臨床特征的相關研究
三 CTC與靶向治療
NSCLC的常見治療靶點包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、間變淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)、鼠Kirsten肉瘤病毒致癌因子(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homology, KRAS)等，近年來針對上述靶點的藥物改善了NSCLC患者的預后，但耐藥突變的出現卻嚴重阻礙了靶向治療的進展[31-33]。對于使用靶向藥物的患者而言，實時監測耐藥突變可有效地指導后續治療，但由于腫瘤標本獲取困難，大部分患者不愿選擇二次活檢。CTC因其采樣簡便，為實時監測治療反應提供了可能。目前，關于CTC中的基因突變能否代表NSCLC原發灶及轉移灶尚存爭議。
Freidin等[34]的研究納入93例受試者(NSCLC 82例、良性肺疾病11例)，結合Cobas、Cold PCR/HRM assay等多種技術，對比其組織樣本(包括原發灶及轉移灶)以及CTC中KRAS 12、13位點突變率。結果表明，對于組織樣本，NSCLC患者中有24例(29.3%)檢出KRAS突變，良性肺疾病患者中1例檢出突變(10%)；對于CTC，則分別為20例(23.2%)和1例(10%)；此外，CTC用于診斷KRAS突變的敏感性和特異性分別為0.522(95%CI 0.335~0.732)和0.881(95%CI 0.789~0.951)。
Pailler等[35]研究了ALK在CTC中的基因重組情況，該研究納入32例NSCLC患者(均已發生遠處轉移)。其原發灶/轉移灶基因檢測已證實18例存在ALK基因重組(重組型)，14例未檢出ALK基因重組(野生型)。檢測CTC基因重組發現，在所有重組型患者中，重組型CTC≥4/mL；在所有野生型患者中，重組型CTC≤1/mL。因此若以重組型4/mL為閾值，CTC用于診斷ALK重組的敏感性和特異性均為100%。但CTC中的基因重組亞型與原發灶/轉移灶有所差異，在原發灶/轉移灶中存在3′，5′分離以及單純3′兩種重組型細胞；而在CTC中僅發現3′，5′分離型，未見單純3′型。此外，在使用克唑替尼治療的過程中對5例重組型患者實施CTC基因監測，4例出現不同程度的ALK重組減少。
Marchetti等[36]對59例受試者CTC中EGFR突變情況進行了研究。該研究納入37例NSCLC患者(原發灶基因檢測已證實均存在EGFR突變)、10例乳腺癌患者(無EGFR突變)、12例健康受試者。原發灶基因突變結果顯示，26例(70%)為exon 19缺失，11例(30%)為exon 21突變；采用NGS(next generation sequencing)技術檢測CTC發現，共31例(84%)EGFR突變，其中25例(81%)為exon 19缺失，6例(19%)為exon 21突變，CTC中EGFR突變結果與原發灶基本一致。另一項關于EGFR的研究為多中心2期臨床試驗，樣本來自美國及澳大利亞的9個研究中心[37]。該研究納入37例NSCLC患者，原發灶/轉移灶基因檢測證實8例(21.6%)患者存在EGFR突變，但CTC僅檢出1例(2.7%)EGFR突變。CTC與NSCLC靶向治療的相關研究見表 3。
表3
CTC與NSCLC靶向治療的相關研究
四 CTC與NSCLC預后
關于NSCLC患者的預后情況，目前尚無可靠指標進行預測。既往研究提出，Ki-67[38]、mTOR[39]、Akt[40]、4E-BP1[41]等蛋白表達水平可能與NSCLC預后有關，但仍無一致結論。部分研究表明，CTC在外周血中的水平與NSCLC患者預后具有顯著相關性。Muinelo-Romay等[25]對43例NSCLC患者治療前、化療2周期后、化療5周期后的CTC水平進行檢測，發現治療前CTC計數為(18.9±14.8)/7.5 mL，化療后明顯降低，分別為(0.87±0.22)/7.5 mL、(0.77±0.42)/7.5 mL。此外，治療前CTC≥5/7.5 mL的患者較CTC < 5/7.5 mL者無進展生存期(PFS)(4.1個月，95%CI 2.2~6 vs.7.6個月，95%CI 5.7~9.5)及總生存率(OS)(4.6個月，95%CI 2.5~6.8 vs.10.7個月，95%CI 8.6~12.8)更短。Krebs等[26]的研究同樣以5/7.5 mL為閾值，所得結論與Muinelo-Romay等[25]一致；該研究還發現化療后CTC≥5/7.5 mL者PFS(2.4個月vs.6.9個月，HR=5.15，95%CI 1.44~18.46)、OS(3.9個月vs.8.8個月，HR=8.3，95%CI 2.09~32.91)也更短。
Juan等[42]從西班牙4所醫院中納入37例NSCLC患者，予以吉西他濱、多西紫杉醇聯合化療，并分別于化療前后收集患者外周血檢測CTC。該研究以2/7.5 mL為閾值，發現化療前CTC≥2的患者PFS(4.3個月vs.9.4個月，P=0.350 6)、OS(8.1個月vs.12.2個月，P=0.763 9)均較CTC 0~1者短，但上述差異無統計學意義。隨后根據患者化療前后兩次CTC計數進行分組，第一組兩次均為CTC 0~1(18例)，第二組化療前CTC≥5、化療后CTC 0~1(5例)，兩組PFS分別為7.7個月vs.9.9個月，差異無統計學意義。
此外，部分研究通過檢測腫瘤特異性mRNA間接證明CTC的存在，亦發現其與NSCLC預后相關。Li等[43]定義CTC為LUNX mRNA(+)細胞，采集68例Ⅰ~ⅢA期NSCLC肺癌患者治療前(T0)、手術后(T1)、輔助化療后(T2)的外周血進行研究。結果表明T0、T1、T2均檢出LUNX mRNA(+)CTC的患者復發率較高，且PFS、OS較短；此外，T1/T2檢出LUNX mRNA(+)CTC是NSCLC預后不良的獨立危險因素。而Zhu等[44]則將CTC定義為EpCAM/MUCI mRNA(+)細胞，納入74例NSCLC患者(61例接受手術治療)進行研究，發現術前/術后檢出EpCAM/MUCI mRNA(+)CTC的患者復發率較高(P=0.004，P=0.001)，DFS、OS較短(術前P=0.012，P=0.002；術后P < 0.001)；此外，術前/術后EpCAM/MUCI mRNA(+)CTC是腫瘤復發的獨立危險因素。CTC與NSCLC預后的相關研究見表 4。
表4
CTC與NSCLC預后的相關研究
五 CTC與ctDNA
由于取材簡便，循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)也被視作“液體活檢”的重要潛在手段，用于監測EGFR、ALK等是否發生耐藥突變。ctDNA是循環游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)的重要組成部分，目前認為ctDNA可來自腫瘤原發灶或轉移灶的凋亡或壞死崩解，也可來自CTC的凋亡或壞死[45]。ctDNA數量較CTC多，因此其敏感性更高；但由于缺乏充足的前期研究結果，目前仍不清楚ctDNA基因突變結果是否與原發灶一致[46-47]。近年來，隨著PCR相關技術的進步，特別是二代測序技術(next generation sequencing，NGS)[48]的出現，ctDNA領域進展迅猛。既往部分研究證實使用ctDNA診斷基因突變，其診斷效能優于CTC[34, 37]。
綜上所述，CTC作為“液體活檢”的重要載體，其應用前景較為可觀。但由于目前分離檢測技術的局限，CTC仍難以應用到臨床工作中；同時，關于CTC與腫瘤原發灶及轉移灶的相關性、在早期轉移中所起作用等諸多方面仍存在疑問，有待后續高質量、多中心、大樣本的研究予以說明。隨著富集、分離、檢測技術的逐步完善，CTC有望成為肺癌早期診斷的有效指標，或是預測預后的重要手段。此外，對于接受生物靶向治療的肺癌患者，可通過CTC實時監測EGFR、ALK等靶點是否發生耐藥突變，以指導后續治療方案的制訂。總而言之，CTC有望為肺癌的診斷、治療帶來突破，但目前仍有待相關技術的完善。
循環腫瘤細胞(circulating tumor cell，CTC)指從腫瘤原發灶或轉移灶脫落后進入血液循環的腫瘤細胞。它可通過被動的“脫落(shedding)”或主動的“上皮-基質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)”進入血液循環，并參與腫瘤的早期轉移[1-3]。既往研究表明，CTC與非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的預后密切相關[4-6]；并且隨著生物靶向治療的發展、精準醫學概念的提出，對治療反應進行實時監測顯得尤為重要，因此作為“液體活檢(liquid biopsy)”[7]的重要媒介，CTC逐漸受到重視。然而，由于檢測陽性率低、檢測標準不統一、費用昂貴等多種因素，現階段CTC仍較難應用到臨床工作中。現就CTC的主要檢測方法及其與NSCLC診斷、治療、預后的關系作一綜述。
一 CTC的富集、分離與檢測
CTC在外周血中十分稀少，其密度約為1個/(105~107)個外周血單核細胞[8]。為方便后續研究，須先從外周血中分離并富集CTC，該步驟也是現階段限制CTC領域發展的重要瓶頸。目前常用的分離富集技術主要分為兩大類，分別為基于物理特性的分離技術和基于生物特性的分離技術。前者利用CTC及正常血細胞在大小、密度、電荷、可變形性等方面的差異，對CTC進行富集[9]。常用的技術包括ISET(isolation by size of epithelial tumor cells)法[10-11]、密度梯度離心分離法(density gradient centrifugation)[12]以及新型的3D微型過濾器(three-dimensional microfilter)[13]。上述方法因不具備特異性，可能出現假陽性[14]。后者則利用CTC與正常血細胞表面抗原的差異對二者進行分離，包括陽性選擇(選擇CTC表達而正常血細胞不表達的表面抗原)、陰性選擇(剔除正常血細胞表達而CTC不表達的表面抗原)[15]。目前應用較為成熟的表面抗原為EpCAM(epithelial cell adhesion molecule)[16]，已作為陽性選擇的主要指標應用在多種分離富集技術中，但此類技術可能受到EMT效應的影響，降低CTC分離率[17]。
目前常用的CTC檢測技術主要包括以下幾種。(1)?反轉錄聚合酶鏈式反應(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)：RT-PCR通過檢測外周血中腫瘤細胞特異的DNA或RNA，間接證明CTC的存在。該技術敏感性高，但易受外界環境的影響，出現假陽性。同時，由于破壞了細胞結構，無法對CTC進行后續計數及細胞形態方面的分析[18-19]。(2)?Cell Search System：該技術的理論基礎是將CTC定義為EpCAM(+)CK(+)DAPI(+)CD45(-)的細胞，通過吸附EpCAM的免疫磁珠富集CTC，并使用CD45、細胞角蛋白8、18、19(CK-8，18，19)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)對細胞進行熒光染色、計數、拍照及其他分析。該技術為目前唯一得到美國FDA認證的CTC分離檢測技術，被批準應用于轉移性乳腺癌、結直腸癌及前列腺癌。但該技術敏感性低，且同樣可能受EMT效應影響出現假陰性[20-21]。此外，該技術在NSCLC中的應用仍存在爭議。(3)?流式細胞術：該技術借助攜帶熒光物質的特異性抗體，與CTC表面的腫瘤細胞特異性抗原結合，后續通過流式細胞儀對CTC進行分離、計數及其他檢測[22]。該方法可避免EMT效應的影響，但現階段缺乏公認的腫瘤細胞特異性抗原，各研究間采用的抗體多樣，異質性較大。(4)?CTC芯片：該技術可根據不同的研究需要，將相應的磁珠及特異性抗體整合到同一芯片上，分離、檢測CTC。既往研究證實該方法敏感性、特異性均較高，且操作簡便，但價格昂貴，難以投入臨床使用[23]。CTC常用檢測技術的比較見表 1。
表1
CTC常用檢測技術的比較
二 CTC與NSCLC的診斷及其與臨床特征的相關性
CTC因其采樣簡便，且在腫瘤早期即可進入外周血液循環，因此曾被作為NSCLC早期診斷的重要潛在手段。目前對于CTC的分離檢測手段多樣，在各研究中得到的CTC陽性率及平均水平波動較大。Mascalchi等[24]采用Screen Cell技術(通過細胞大小鑒別CTC)，檢測26例確診NSCLC(均為Ⅲ~Ⅳ期)患者外周血，17例(65%)檢出CTC，計數為(6.8±3.7)/3 mL。而采用Cell Search System進行檢測得到的CTC陽性率則普遍較低，Muinelo-Romay等[25]在43例ⅢB~Ⅳ期NSCLC患者中，僅發現18例(41.9%)患者存在CTC，計數為(18.9±14.8)/7.5 mL；Krebs等[26]納入101例NSCLC患者(ⅢA期14例、ⅢB期27例、Ⅳ期60例)，并定義CTC≥2/7.5 mL為CTC(+)，結果表明21例(21%)為CTC(+)；而在Chen等[27]的研究中，169例NSCLC患者僅40例(23.7%)檢出CTC，且Ⅰ期患者中未檢測到CTC。總而言之，早期NSCLC患者外周血CTC陽性率極低，現階段難以用于NSCLC的早期診斷。
部分研究表明，CTC結合其他實驗室指標可作為鑒別良惡性病變的重要手段。Chen等[28]將756例受試者分為測試組和驗證組，其中測試組納入377例(肺癌236例、良性肺疾病113例、健康受試者28例)，驗證組納入379例(肺癌237例、良性肺疾病114例、健康受試者28例)。研究發現，與癌胚抗原(CEA)、神經元特異性烯醇化酶(NSE)、細胞角蛋白19血清片段21-1(CYFRA21-1)等常用的腫瘤標志物相比，CTC在鑒別肺部良惡性病變方面具
有更高的敏感性(測試組72.46%，驗證組76.37%，P < 0.001)及特異性(測試組88.65%，驗證組82.39%，P < 0.001)，且結合上述4項指標可顯著提高診斷效能。Yu等[29]研究發現，當閾值設定為8.64/3 mL時，CTC用于診斷NSCLC的敏感性為72.3%，特異性為84.1%，ROC曲線下面積(AUC)為0.823(95%CI 0.773~0.874)，其診斷效能明顯高于NSE、CEA、糖類抗原125(CA125)、CYFRA21-1及鱗狀細胞癌相關抗原(SCC Ag)等腫瘤標志物。
此外，既往大量研究表明CTC水平與NSCLC患者TNM分期、分化程度、遠處轉移等臨床特征相關。Chen等[28]分析測試組、驗證組的數據發現，肺癌患者CTC水平(測試組11.64±8.6，驗證組12.41±9.02)明顯高于良性肺疾病患者(測試組6.60±5.21，驗證組6.95±5.45，P < 0.001)及健康受試者(測試組5.72±4.49，驗證組5.94±4.57，P < 0.001)；此外，Ⅰ~Ⅱ期肺癌患者CTC水平(10.17±6.23)也較Ⅲ期(11.96±8.23，P < 0.001)及Ⅳ期(12.44±9.02，P < 0.001)低。上述結果與另兩項研究[26, 29]一致，但與Mascalchi等[24]的研究結果相反。此外，尚有研究發現CTC水平隨腫瘤直徑增大[29]、分化程度降低[27]、骨轉移[26, 30]及肝轉移[26]的出現而升高。CTC與NSCLC診斷及臨床特征的相關研究見表 2。
表2
CTC與NSCLC診斷及臨床特征的相關研究
三 CTC與靶向治療
NSCLC的常見治療靶點包括表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)、間變淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)、鼠Kirsten肉瘤病毒致癌因子(Kirsten rat sarcoma viral oncogene homology, KRAS)等，近年來針對上述靶點的藥物改善了NSCLC患者的預后，但耐藥突變的出現卻嚴重阻礙了靶向治療的進展[31-33]。對于使用靶向藥物的患者而言，實時監測耐藥突變可有效地指導后續治療，但由于腫瘤標本獲取困難，大部分患者不愿選擇二次活檢。CTC因其采樣簡便，為實時監測治療反應提供了可能。目前，關于CTC中的基因突變能否代表NSCLC原發灶及轉移灶尚存爭議。
Freidin等[34]的研究納入93例受試者(NSCLC 82例、良性肺疾病11例)，結合Cobas、Cold PCR/HRM assay等多種技術，對比其組織樣本(包括原發灶及轉移灶)以及CTC中KRAS 12、13位點突變率。結果表明，對于組織樣本，NSCLC患者中有24例(29.3%)檢出KRAS突變，良性肺疾病患者中1例檢出突變(10%)；對于CTC，則分別為20例(23.2%)和1例(10%)；此外，CTC用于診斷KRAS突變的敏感性和特異性分別為0.522(95%CI 0.335~0.732)和0.881(95%CI 0.789~0.951)。
Pailler等[35]研究了ALK在CTC中的基因重組情況，該研究納入32例NSCLC患者(均已發生遠處轉移)。其原發灶/轉移灶基因檢測已證實18例存在ALK基因重組(重組型)，14例未檢出ALK基因重組(野生型)。檢測CTC基因重組發現，在所有重組型患者中，重組型CTC≥4/mL；在所有野生型患者中，重組型CTC≤1/mL。因此若以重組型4/mL為閾值，CTC用于診斷ALK重組的敏感性和特異性均為100%。但CTC中的基因重組亞型與原發灶/轉移灶有所差異，在原發灶/轉移灶中存在3′，5′分離以及單純3′兩種重組型細胞；而在CTC中僅發現3′，5′分離型，未見單純3′型。此外，在使用克唑替尼治療的過程中對5例重組型患者實施CTC基因監測，4例出現不同程度的ALK重組減少。
Marchetti等[36]對59例受試者CTC中EGFR突變情況進行了研究。該研究納入37例NSCLC患者(原發灶基因檢測已證實均存在EGFR突變)、10例乳腺癌患者(無EGFR突變)、12例健康受試者。原發灶基因突變結果顯示，26例(70%)為exon 19缺失，11例(30%)為exon 21突變；采用NGS(next generation sequencing)技術檢測CTC發現，共31例(84%)EGFR突變，其中25例(81%)為exon 19缺失，6例(19%)為exon 21突變，CTC中EGFR突變結果與原發灶基本一致。另一項關于EGFR的研究為多中心2期臨床試驗，樣本來自美國及澳大利亞的9個研究中心[37]。該研究納入37例NSCLC患者，原發灶/轉移灶基因檢測證實8例(21.6%)患者存在EGFR突變，但CTC僅檢出1例(2.7%)EGFR突變。CTC與NSCLC靶向治療的相關研究見表 3。
表3
CTC與NSCLC靶向治療的相關研究
四 CTC與NSCLC預后
關于NSCLC患者的預后情況，目前尚無可靠指標進行預測。既往研究提出，Ki-67[38]、mTOR[39]、Akt[40]、4E-BP1[41]等蛋白表達水平可能與NSCLC預后有關，但仍無一致結論。部分研究表明，CTC在外周血中的水平與NSCLC患者預后具有顯著相關性。Muinelo-Romay等[25]對43例NSCLC患者治療前、化療2周期后、化療5周期后的CTC水平進行檢測，發現治療前CTC計數為(18.9±14.8)/7.5 mL，化療后明顯降低，分別為(0.87±0.22)/7.5 mL、(0.77±0.42)/7.5 mL。此外，治療前CTC≥5/7.5 mL的患者較CTC < 5/7.5 mL者無進展生存期(PFS)(4.1個月，95%CI 2.2~6 vs.7.6個月，95%CI 5.7~9.5)及總生存率(OS)(4.6個月，95%CI 2.5~6.8 vs.10.7個月，95%CI 8.6~12.8)更短。Krebs等[26]的研究同樣以5/7.5 mL為閾值，所得結論與Muinelo-Romay等[25]一致；該研究還發現化療后CTC≥5/7.5 mL者PFS(2.4個月vs.6.9個月，HR=5.15，95%CI 1.44~18.46)、OS(3.9個月vs.8.8個月，HR=8.3，95%CI 2.09~32.91)也更短。
Juan等[42]從西班牙4所醫院中納入37例NSCLC患者，予以吉西他濱、多西紫杉醇聯合化療，并分別于化療前后收集患者外周血檢測CTC。該研究以2/7.5 mL為閾值，發現化療前CTC≥2的患者PFS(4.3個月vs.9.4個月，P=0.350 6)、OS(8.1個月vs.12.2個月，P=0.763 9)均較CTC 0~1者短，但上述差異無統計學意義。隨后根據患者化療前后兩次CTC計數進行分組，第一組兩次均為CTC 0~1(18例)，第二組化療前CTC≥5、化療后CTC 0~1(5例)，兩組PFS分別為7.7個月vs.9.9個月，差異無統計學意義。
此外，部分研究通過檢測腫瘤特異性mRNA間接證明CTC的存在，亦發現其與NSCLC預后相關。Li等[43]定義CTC為LUNX mRNA(+)細胞，采集68例Ⅰ~ⅢA期NSCLC肺癌患者治療前(T0)、手術后(T1)、輔助化療后(T2)的外周血進行研究。結果表明T0、T1、T2均檢出LUNX mRNA(+)CTC的患者復發率較高，且PFS、OS較短；此外，T1/T2檢出LUNX mRNA(+)CTC是NSCLC預后不良的獨立危險因素。而Zhu等[44]則將CTC定義為EpCAM/MUCI mRNA(+)細胞，納入74例NSCLC患者(61例接受手術治療)進行研究，發現術前/術后檢出EpCAM/MUCI mRNA(+)CTC的患者復發率較高(P=0.004，P=0.001)，DFS、OS較短(術前P=0.012，P=0.002；術后P < 0.001)；此外，術前/術后EpCAM/MUCI mRNA(+)CTC是腫瘤復發的獨立危險因素。CTC與NSCLC預后的相關研究見表 4。
表4
CTC與NSCLC預后的相關研究
五 CTC與ctDNA
由于取材簡便，循環腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)也被視作“液體活檢”的重要潛在手段，用于監測EGFR、ALK等是否發生耐藥突變。ctDNA是循環游離DNA(circulating free DNA，cfDNA)的重要組成部分，目前認為ctDNA可來自腫瘤原發灶或轉移灶的凋亡或壞死崩解，也可來自CTC的凋亡或壞死[45]。ctDNA數量較CTC多，因此其敏感性更高；但由于缺乏充足的前期研究結果，目前仍不清楚ctDNA基因突變結果是否與原發灶一致[46-47]。近年來，隨著PCR相關技術的進步，特別是二代測序技術(next generation sequencing，NGS)[48]的出現，ctDNA領域進展迅猛。既往部分研究證實使用ctDNA診斷基因突變，其診斷效能優于CTC[34, 37]。
綜上所述，CTC作為“液體活檢”的重要載體，其應用前景較為可觀。但由于目前分離檢測技術的局限，CTC仍難以應用到臨床工作中；同時，關于CTC與腫瘤原發灶及轉移灶的相關性、在早期轉移中所起作用等諸多方面仍存在疑問，有待后續高質量、多中心、大樣本的研究予以說明。隨著富集、分離、檢測技術的逐步完善，CTC有望成為肺癌早期診斷的有效指標，或是預測預后的重要手段。此外，對于接受生物靶向治療的肺癌患者，可通過CTC實時監測EGFR、ALK等靶點是否發生耐藥突變，以指導后續治療方案的制訂。總而言之，CTC有望為肺癌的診斷、治療帶來突破，但目前仍有待相關技術的完善。
