引用本文： 何麗秀, 劉春濤. 哮喘患者呼出氣一氧化氮和氣道高反應性的關系探究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(1): 82-86. doi: 10.7507/1671-6205.2016021 復制
支氣管哮喘是由多種細胞(包括氣道炎癥細胞和結構細胞)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，這種慢性炎癥導致氣道高反應性(AHR)以及廣泛多變的可逆性氣流受限。臨床上通過支氣管激發試驗判斷AHR對哮喘診斷[1]和氣道炎癥及其程度的辨識具有重要意義，然而檢查過程中支氣管收縮將導致一定風險，適用于第1秒用力呼氣容積(FEV1) > 70%的患者，對有嚴重心肺功能不全及高血壓者有一定限制，且無法進行哮喘日常病情監測。現階段無創、簡單、安全的檢查方法受到臨床的廣泛關注，其中生物標志物檢測是哮喘氣道炎癥研究的熱點課題[2]，呼出氣一氧化氮(FENO)是最具有廣闊臨床應用前景的標志物之一[3-4]。
一 一氧化氮(NO)
1．內源性NO的來源：NO是體內的一種活性信號分子，由左旋精氨酸(L-Arg)與O2在一氧化氮合酶(NOS)的催化下生成，同時產生瓜氨酸。L-精氨酸的來源主要有經食物吸收、近端腎小管合成以及其他蛋白質轉化。小腸吸收L-谷氨酸鹽和L-脯氨酸后轉化為L-鳥氨酸，在肝臟經鳥氨酸循環生成L-瓜氨酸，L-瓜氨酸在胞質中由精氨酸代琥珀酸合成酶1、精氨酸代琥珀酸裂解酶催化生成L-精氨[5-6]。
在哺乳動物中根據其分布部位，NOS可分為神經型(nNOS)、誘導型(iNOS)和內皮型(eNOS)三種類型。eNOS主要分布于支氣管柱狀上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞、鼻移行上皮細胞及肺血管內皮細胞；nNOS分布于肺實質、肺間質的神經細胞、氣道上皮細胞；iNOS分布于支氣管柱狀上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞、肺血管內皮細胞、支氣管和肺血管的平滑肌細胞，以及炎癥細胞(如巨噬細胞、肥大細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等)[7-8]。按功能和存在狀態，NOS可分為固有型NOS(即cNOS，包括nNOS和eNOS)和誘導型NOS(iNOS)。正常生理情況下支氣管激動劑如乙酰膽堿、緩激肽、組胺等通過Ca2+/Ca2+M(鈣調蛋白)激活cNOS，以pmol水平的濃度合成釋放NO，持續時間僅數秒[9]；相反的，iNOS為非Ca2+/Ca2+M(鈣調蛋白)依賴酶，在腫瘤壞死因子α、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素1β(IL-1β)等前炎癥因子誘導下，iNOS的mRNA被激活[10]，過表達生成大量NO(nmol水平)，并且持續時間可長達數小時或數天[8]。
2．NO的氣道雙重作用：自1987年揭曉內皮源性舒張因子的本質是NO以來，NO的病理生理功能得到了廣泛的研究。業已證實NO具有調節血壓、神經傳遞、免疫防御等生理作用。在呼吸系統中NO主要參與氣道和血管平滑肌張力、纖毛運動以及iNANC神經功能調節，并參與炎癥反應[9]。
非腎上腺素能非膽堿能神經(NANC)是肺內除交感和副交感神經外的第三類神經，分為抑制性NANC(iNANC)和興奮性NANC(eNANC)，對氣道張力的調節具有雙重作用，即支氣管收縮和舒張[11-12]。iNANC是人類氣道唯一的支氣管舒張神經通路，NO和血管活性腸肽(VIP)是iNANC的重要神經遞質[13]。國內外學者的研究證實，在離體大鼠的氣道培養液中加入L-精氨酸類似物L-NAME或L-NMMA孵化后，電刺激誘導的iNANC神經對支氣管的舒張作用減弱，進而提出內源性NO參與(至少部分參與)氣道平滑肌的張力調節[14-16]。同樣，精氨酸酶通過與NOS競爭共同底物L-精氨酸而減少NO的生成，結果大鼠氣管環中iNANC神經介導的支氣管舒張作用明顯變弱[17]。NOS在iNANA神經-NO介導的支氣管平滑肌舒張中具有重要作用，NOS是合成NO的限速酶，影響NO的生成量和生物效應；已有研究表明L-瓜氨酸/L-精氨酸循環也是產生L-精氨酸的一個通路，但是L-瓜氨酸的含量在基礎狀態下并不影響NO的支氣管舒張作用[18]。在人類氣道中NO作為iNANC神經遞質參與氣道平滑肌調節也得到了證實，Belvisi等[19]通過在人體氣管段中，予以L-NAME抑制NO合成，支氣管舒張作用減弱。NO激活氣道平滑肌中可溶性鳥甘酸環化酶(sGC)，第二信使cGMP合成增多，通過激活胞內激酶或者胞膜鈣-鉀通道開放，鈣離子內流，引起平滑肌舒張[20]。
由cNOS產生的少量NO具有支氣管平滑肌舒張作用，但在哮喘患者中，支氣管上皮細胞、巨噬細胞、肥大細胞、淋巴細胞中iNOS被前炎癥因子大量激活，合成NO增多。氣道局部持續高水平的NO可能產生許多有害作用，誘發和加劇氣道炎癥引起氣道平滑肌收縮，進一步加重AHR。其作用機制可能為：(1)?細胞毒作用直接損害氣道上皮細胞：NO過氧化生成過氧硝酸鹽和羥自由基等，過氧亞硝酸鹽的強氧化作用導致氣道上皮損傷、脫落，加重AHR[21]。(2)?舒張肺及支氣管毛細血管后微靜脈，血管內皮細胞收縮，內皮細胞間隙增大，血管通透性增加，導致血漿滲漏增多和氣道水腫。Kageyama等[22]用NOS抑制劑(L-NAME、L-NMMA)抑制NO合成后，由P物質引起的血漿滲漏減少；額外給予L-精氨酸合成大量NO后血漿滲出再次增多。(3)?哮喘時NO介導iNANC神經功能缺陷[12]：可能原因為大量NO或其過氧化反應生成的過氧陰離子(如過氧亞硝酸鹽、羥自由基等)的強氧化作用對神經的損害效應，但其確切機制仍不十分清楚。
二 哮喘AHR
1．AHR的形成機制：目前公認的哮喘兩大特征是氣道炎癥和AHR。AHR是指氣道對正常時不引起或僅引起輕度應答反應的刺激物出現過度的收縮反應的特性，而氣道炎癥是導致哮喘AHR最重要的機制。在正常情況下氣道上皮細胞是氣道的天然屏障，可以有效隔離刺激原，保護氣道平滑肌細胞，然而其作用不僅限于物理屏障作用，在有害刺激時可以釋放炎性介質參與天然固有免疫應答、募集免疫細胞和分泌抗菌肽，其結構成分主要有基底細胞、柱狀纖毛細胞和杯狀細胞[23]。而哮喘時長期慢性炎癥導致氣道上皮細胞損傷脫落，物理屏障和免疫屏障破壞，黏膜層和黏膜下層滲出增多，滲透性改變，各種刺激原或炎性介質直接作用于平滑肌細胞，氣道收縮增強，AHR形成。其次，近年來Th1/Th2失衡引起AHR機制也越來越受到關注，Th2細胞通過分泌IL(主要包含IL-4、5、9、10和IL-13)促進氣道IgE的產生以及募集嗜酸粒細胞，上調多種炎性介質，其中IL-13使氣道上皮細胞黏液分泌增多，影響纖毛細胞的分化和擺動[24]。Laporte等[25]發現IL-13降低氣道平滑肌細胞的β-腎上腺素受體的反應性，促進氣道收縮參與AHR的形成。Th1主要分泌IL-2和IL-12、IFN-γ，對Th2效應具有拮抗作用。再次，NOS和精氨酸酶平衡失調也是導致AHR的原因[5, 26]，精氨酸酶通過競爭共同底物機制而校正NOS的L-精氨酸生物利用度，減少NO的產生，iNANC神經舒張氣道平滑肌作用減弱，因此升高的精氨酸酶可能部分參與AHR的形成，但是此平衡僅限于cNOS和精氨酸酶之間。對于iNOS和精氨酸酶之間的平衡調節主要與Th1/Th2平衡相關，哮喘動物模型示在變應原刺激早期和哮喘病程的后期Th1釋放細胞因子誘導肥大細胞產生iNOS，精氨酸酶則是由Th2釋放IL-4、IL-10、IL-13誘導巨噬細胞而產生[26-27]。干擾哮喘小鼠精氨酸酶mRNA使精氨酸酶失活后，IL-13誘發的AHR消失[28]，表明精氨酸酶在IL-13介導的AHR中起重要作用。最后，哮喘AHR可能還與iNANC神經功能缺陷、支氣管舒張作用減弱有關。
支氣管哮喘AHR的發生機制極其復雜，與氣道炎癥、Th1/Th2平衡、NOS/精氨酸酶平衡、iNANC神經功能缺陷等多種因素相關，各種機制之間相互聯系、相互影響、相互滲透，以其中任何一種機制均無法完全解釋AHR的發生發展，其確切機制有待進一步研究。
2．激發試驗的類型：不同的刺激原引起支氣管收縮的機制各異，可能包括：(1)?刺激原直接作用于氣道平滑肌受體；(2)?與炎癥細胞相互作用引起炎癥介質釋放，通過炎癥介質進一步作用于平滑肌細胞或神經細胞受體；(3)刺激局部感覺神經引起局部軸突反射或者迷走神經介導的中樞神經反射[29]。其中，組胺和乙酰膽堿可直接作用于氣道平滑肌細胞受體從而引起氣道收縮。相反，已有證據表明神經肽和腺苷可通過作用于迷走神經或者肥大細胞的特定受體間接引起支氣管平滑肌收縮。故對于刺激原引起的氣道收縮可以簡單分為直接反應和間接反應，直接反應即刺激原直接作用于氣道平滑肌細胞受體引起氣道收縮，組胺作用于H1受體，乙酰膽堿作用于M3受體[30]。間接反應即刺激原通過作用于除平滑肌細胞外的炎癥細胞和神經細胞引起氣道收縮，刺激原包括過敏原、滲透性物質(如甘露醇、高滲鹽水)和腺苷等，刺激炎癥細胞釋放炎癥介質如組胺、白三烯前列腺素等，后者再作用于氣道平滑肌細胞引起收縮和氣道狹窄，其中肥大細胞、巨噬細胞具有重要作用，受刺激后通過脫顆粒釋放大量炎癥介質[31]。而冷空氣或者高滲透性物質可能作用于局部感覺神經纖維或者改變氣道壁的滲透性而引起神經反射，氣道收縮。
支氣管激發試驗是通過化學、物理、生物等人工刺激，誘發氣道平滑肌收縮，并借助肺功能指標改變來判斷支氣管是否縮窄及其程度的方法，是最常用于臨床診斷和評估AHR的方法[30]，結合臨床癥狀和體征有助于確診哮喘。根據上述激發物質的不同作用機制可以分為直接激發試驗和間接激發試驗兩種。常用于直接激發試驗的刺激物有組織胺、膽堿類、前列腺素、白細胞三烯、刺激性氣體(如二氧化硫)。用于間接激發試驗的刺激物包括物理、化學、生物源性物質，其中化學源性刺激物有一磷酸腺苷、心得安、緩激肽、速激肽、阿司匹林等，物理源性刺激包括運動、過度通氣、冷空氣、高/低滲鹽水、蒸餾水、甘露醇等，生物源性刺激包括花粉、塵螨、動物皮毛、蟑螂、霉菌等。
三 FENO和AHR的關系
1．哮喘時高水平FENO和AHR相關：各亞型NOS和NO在哮喘中的作用尚有爭議。有人認為NO本質是保護和舒張支氣管平滑肌，哮喘時NO增加是為了抵抗AHR的自然應答反應。盡管NO具體的細胞及分子作用機制不明，但可以明確的是已有大量研究表明哮喘時iNOS過表達，生成大量NO導致氣道炎癥及AHR[10, 32-35]。哮喘患者FENO濃度主要由氣道上皮iNOS的表達水平決定，而與其他類型的NOS未見明確關系[36]，并且其他非上皮細胞(如巨噬細胞)iNOS合成的NO僅占FENO的極小一部分[37]。哮喘時Th2細胞激活產生IL-4和IL-13，通過信號傳導和轉錄激活因子6(STAT-6)通路上調表達支氣管上皮細胞iNOS，大量合成NO[37]，彌散至支氣管腔，呼出氣中NO濃度增高。
2．FENO和間接激發試驗AHR相關：近年FENO作為哮喘氣道炎癥的非侵入性標志物，在哮喘的診斷和監測方面得到了廣泛應用。盡管表面上FENO和AHR分別代表氣道炎癥和平滑肌結構性變化，但是深入了解兩者關系仍具有重要臨床意義。Sverrild等[38]隨機選取238例青年行甘露醇激發試驗和乙酰甲膽堿激發試驗，并測定FENO，研究結果提示甘露醇激發試驗診斷哮喘的特異性和陽性預測值均較乙酰甲膽堿激發試驗高，甘露醇AHR程度與FENO水平相關，而乙酰膽堿與FENO無明顯關系。為了解哮喘患者間接激發試驗與FENO的關系，Perzanowski等[39]檢測了哮喘患兒FENO和肺功能，并行一磷酸腺苷(AMP)激發試驗和乙酰甲膽堿激發試驗，單因素線性回歸分析發現FENO與AMP、乙酰甲膽堿的PC20均相關。但是校正年齡、性別、血IgE和血嗜酸粒細胞計數等影響因素后，FENO只與AMP的PC20相關(P=0.001)，作者因此提出FENO與間接激發試驗的AHR更具相關性。同樣，在青年和老年哮喘患者中兩者的相關性也得到了證實[40-41]。Porsbjerg等[42]在非吸煙成人哮喘患者中也發現FENO與甘露醇AHR相關。此外，FENO與運動試驗誘發的氣道AHR關系密切[43]。上述多項研究均表明間接激發試驗AHR與氣道炎癥導致的FENO升高更具相關性，能更好地反映氣道炎癥。甘露醇、AMP、高滲鹽水等通過刺激肥大細胞脫顆粒，釋放組胺和其他炎癥因子間接作用于氣道平滑肌細胞，反映了潛在氣道炎癥的嚴重程度，FENO更是哮喘氣道炎癥程度的一個尺標，故FENO與間接激發試驗的關系甚密。
3．FENO和AHR關系的影響因素：FENO與AHR的相關關系受多種因素影響。Perzanowski等[39]發現激素治療影響FENO與間接激發試驗AHR的關系，在未經激素治療的哮喘患者中FENO與AMP的AHR呈明顯負相關，在經過激素治療的患者中兩者無相關關系。此外，在未經激素治療和已經激素治療的哮喘患兒中，FENO對于運動激發試驗的陽性預測截斷值不同[43]。Shim等[44]、Suh等[45]研究顯示特應性哮喘(atopic asthma)患者AMP激發試驗的AHR與FENO水平相關，而在非特應性哮喘(non-atopic asthma)未觀察到此相關關系，特應性程度可作為氣道AMP反應的重要預測因素。其次，它還與哮喘氣道炎癥類型相關，根據患者誘導痰中嗜酸粒細胞、中性粒細胞計數，哮喘可分為嗜酸粒細胞型哮喘、中性粒細胞型哮喘、混合細胞型哮喘和寡細胞型哮喘四種亞型。Porsbjerg等[46]證實四種亞型中中性粒細胞型哮喘FENO值最低，嗜酸粒細胞型哮喘最高，并且中性粒細胞型哮喘甘露醇AHR最低，嗜酸粒細胞型哮喘甘露醇AHR最高。這與FENO主要反映氣道嗜酸粒細胞炎癥的結論不謀而合。并且嗜酸粒細胞增多是特應性哮喘的一個重要特征，中性粒細胞性氣道炎癥是非特異性哮喘的特征[47]。此外，年齡也是兩者關系的影響因素，Hardaker等[48]比較老年和年輕哮喘患者AHR的預測因子，發現年輕患者AHR的預測因子為肺通氣功能、FENO和FEV1/FVC；然而老年患者AHR的預測因子為殘余肺容量和肺彌散功能，與FEV1%pred、FENO并無相關關系；再進一步分析發現年輕者主要是嗜酸粒細胞型哮喘，而老年患者哮喘主要可能主要是非嗜酸粒細胞型哮喘。綜合上述特應性因素、炎癥類型因素、年齡因素均與嗜酸粒細胞和非嗜酸粒細胞相關，故可以簡單地把哮喘分為嗜酸粒細胞型哮喘和非嗜酸粒細胞型哮喘兩大類；在嗜酸粒細胞型未經激素治療的哮喘中，FENO與間接激發試驗AHR具有重要相關性，通過測定FENO值可以反映患者AHR水平。
國外有研究表明FENO預測甘露醇AHR陽性中位值為47 ppb，陰性中位預測值為19 ppb[38]。另一項研究顯示FENO預測甘露醇激發試驗陽性的曲線下面積為91.9%，最佳截斷值為25 ppb，當FENO為20 ppb時其敏感性為100%，即當FENO值低于20 ppb可排除甘露醇AHR，這類患者可以不再行甘露醇激發試驗[40]。但這僅限于小樣本量的試驗結論，目前尚無公認的標準FENO截斷值來預測激發試驗，還需更多的多中心大樣本量研究來明確。
四 結語
傳統的乙酰甲膽堿、組胺激發試驗僅與AHR相關，不能反映氣道炎癥程度。而間接激發試驗不僅能反映AHR，且與炎癥細胞、炎癥介質相關，能更好地反映氣道炎癥[39]。在哮喘病程中刺激物主要通過間接刺激引起癥狀，故間接激發試驗更符合哮喘的臨床特征[29, 49]，或許在今后的臨床中將得到更廣泛的應用。氣道炎癥是AHR形成的機制之一，AHR是反映氣道炎癥的一項指標，通過測量FENO可以直接反映AHR，臨床上可以通過測量FENO水平而診斷哮喘。為了進一步提高準確性，有必要進一步把哮喘分為嗜酸粒細胞型和非嗜酸粒細胞型哮喘，在未經激素治療的嗜酸粒細胞型哮喘中FENO可以直接反映其AHR，FENO水平的高低可以預測AHR的嚴重程度。但是氣道炎癥并非AHR的唯一機制，僅為哮喘病程中兩種不同的病理生理機制之一，FENO水平高低反映的主要是氣道炎癥水平，而無法完全預測AHR的強度。故FENO與AHR的關系仍有待于哮喘的氣道炎癥和AHR兩大病理生理機制關系的進一步明確。
綜上所述，FENO是哮喘診斷的重要生物標志物，NO調節氣道平滑肌張力，高濃度NO對其具有收縮作用，參與AHR的形成。在反映哮喘AHR的激發試驗中，FENO與間接激發試驗的關系更密切。在未經激素治療的嗜酸粒細胞型哮喘患者中可以用FENO水平反映其間接激發試驗的AHR程度，但預測間接激發試驗陽性的FENO截斷值仍需要更多臨床研究來確定。
支氣管哮喘是由多種細胞(包括氣道炎癥細胞和結構細胞)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病，這種慢性炎癥導致氣道高反應性(AHR)以及廣泛多變的可逆性氣流受限。臨床上通過支氣管激發試驗判斷AHR對哮喘診斷[1]和氣道炎癥及其程度的辨識具有重要意義，然而檢查過程中支氣管收縮將導致一定風險，適用于第1秒用力呼氣容積(FEV1) > 70%的患者，對有嚴重心肺功能不全及高血壓者有一定限制，且無法進行哮喘日常病情監測。現階段無創、簡單、安全的檢查方法受到臨床的廣泛關注，其中生物標志物檢測是哮喘氣道炎癥研究的熱點課題[2]，呼出氣一氧化氮(FENO)是最具有廣闊臨床應用前景的標志物之一[3-4]。
一 一氧化氮(NO)
1．內源性NO的來源：NO是體內的一種活性信號分子，由左旋精氨酸(L-Arg)與O2在一氧化氮合酶(NOS)的催化下生成，同時產生瓜氨酸。L-精氨酸的來源主要有經食物吸收、近端腎小管合成以及其他蛋白質轉化。小腸吸收L-谷氨酸鹽和L-脯氨酸后轉化為L-鳥氨酸，在肝臟經鳥氨酸循環生成L-瓜氨酸，L-瓜氨酸在胞質中由精氨酸代琥珀酸合成酶1、精氨酸代琥珀酸裂解酶催化生成L-精氨[5-6]。
在哺乳動物中根據其分布部位，NOS可分為神經型(nNOS)、誘導型(iNOS)和內皮型(eNOS)三種類型。eNOS主要分布于支氣管柱狀上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞、鼻移行上皮細胞及肺血管內皮細胞；nNOS分布于肺實質、肺間質的神經細胞、氣道上皮細胞；iNOS分布于支氣管柱狀上皮細胞、Ⅱ型肺泡上皮細胞、肺血管內皮細胞、支氣管和肺血管的平滑肌細胞，以及炎癥細胞(如巨噬細胞、肥大細胞、嗜酸粒細胞、嗜堿粒細胞、中性粒細胞、T淋巴細胞等)[7-8]。按功能和存在狀態，NOS可分為固有型NOS(即cNOS，包括nNOS和eNOS)和誘導型NOS(iNOS)。正常生理情況下支氣管激動劑如乙酰膽堿、緩激肽、組胺等通過Ca2+/Ca2+M(鈣調蛋白)激活cNOS，以pmol水平的濃度合成釋放NO，持續時間僅數秒[9]；相反的，iNOS為非Ca2+/Ca2+M(鈣調蛋白)依賴酶，在腫瘤壞死因子α、γ干擾素(IFN-γ)、白細胞介素1β(IL-1β)等前炎癥因子誘導下，iNOS的mRNA被激活[10]，過表達生成大量NO(nmol水平)，并且持續時間可長達數小時或數天[8]。
2．NO的氣道雙重作用：自1987年揭曉內皮源性舒張因子的本質是NO以來，NO的病理生理功能得到了廣泛的研究。業已證實NO具有調節血壓、神經傳遞、免疫防御等生理作用。在呼吸系統中NO主要參與氣道和血管平滑肌張力、纖毛運動以及iNANC神經功能調節，并參與炎癥反應[9]。
非腎上腺素能非膽堿能神經(NANC)是肺內除交感和副交感神經外的第三類神經，分為抑制性NANC(iNANC)和興奮性NANC(eNANC)，對氣道張力的調節具有雙重作用，即支氣管收縮和舒張[11-12]。iNANC是人類氣道唯一的支氣管舒張神經通路，NO和血管活性腸肽(VIP)是iNANC的重要神經遞質[13]。國內外學者的研究證實，在離體大鼠的氣道培養液中加入L-精氨酸類似物L-NAME或L-NMMA孵化后，電刺激誘導的iNANC神經對支氣管的舒張作用減弱，進而提出內源性NO參與(至少部分參與)氣道平滑肌的張力調節[14-16]。同樣，精氨酸酶通過與NOS競爭共同底物L-精氨酸而減少NO的生成，結果大鼠氣管環中iNANC神經介導的支氣管舒張作用明顯變弱[17]。NOS在iNANA神經-NO介導的支氣管平滑肌舒張中具有重要作用，NOS是合成NO的限速酶，影響NO的生成量和生物效應；已有研究表明L-瓜氨酸/L-精氨酸循環也是產生L-精氨酸的一個通路，但是L-瓜氨酸的含量在基礎狀態下并不影響NO的支氣管舒張作用[18]。在人類氣道中NO作為iNANC神經遞質參與氣道平滑肌調節也得到了證實，Belvisi等[19]通過在人體氣管段中，予以L-NAME抑制NO合成，支氣管舒張作用減弱。NO激活氣道平滑肌中可溶性鳥甘酸環化酶(sGC)，第二信使cGMP合成增多，通過激活胞內激酶或者胞膜鈣-鉀通道開放，鈣離子內流，引起平滑肌舒張[20]。
由cNOS產生的少量NO具有支氣管平滑肌舒張作用，但在哮喘患者中，支氣管上皮細胞、巨噬細胞、肥大細胞、淋巴細胞中iNOS被前炎癥因子大量激活，合成NO增多。氣道局部持續高水平的NO可能產生許多有害作用，誘發和加劇氣道炎癥引起氣道平滑肌收縮，進一步加重AHR。其作用機制可能為：(1)?細胞毒作用直接損害氣道上皮細胞：NO過氧化生成過氧硝酸鹽和羥自由基等，過氧亞硝酸鹽的強氧化作用導致氣道上皮損傷、脫落，加重AHR[21]。(2)?舒張肺及支氣管毛細血管后微靜脈，血管內皮細胞收縮，內皮細胞間隙增大，血管通透性增加，導致血漿滲漏增多和氣道水腫。Kageyama等[22]用NOS抑制劑(L-NAME、L-NMMA)抑制NO合成后，由P物質引起的血漿滲漏減少；額外給予L-精氨酸合成大量NO后血漿滲出再次增多。(3)?哮喘時NO介導iNANC神經功能缺陷[12]：可能原因為大量NO或其過氧化反應生成的過氧陰離子(如過氧亞硝酸鹽、羥自由基等)的強氧化作用對神經的損害效應，但其確切機制仍不十分清楚。
二 哮喘AHR
1．AHR的形成機制：目前公認的哮喘兩大特征是氣道炎癥和AHR。AHR是指氣道對正常時不引起或僅引起輕度應答反應的刺激物出現過度的收縮反應的特性，而氣道炎癥是導致哮喘AHR最重要的機制。在正常情況下氣道上皮細胞是氣道的天然屏障，可以有效隔離刺激原，保護氣道平滑肌細胞，然而其作用不僅限于物理屏障作用，在有害刺激時可以釋放炎性介質參與天然固有免疫應答、募集免疫細胞和分泌抗菌肽，其結構成分主要有基底細胞、柱狀纖毛細胞和杯狀細胞[23]。而哮喘時長期慢性炎癥導致氣道上皮細胞損傷脫落，物理屏障和免疫屏障破壞，黏膜層和黏膜下層滲出增多，滲透性改變，各種刺激原或炎性介質直接作用于平滑肌細胞，氣道收縮增強，AHR形成。其次，近年來Th1/Th2失衡引起AHR機制也越來越受到關注，Th2細胞通過分泌IL(主要包含IL-4、5、9、10和IL-13)促進氣道IgE的產生以及募集嗜酸粒細胞，上調多種炎性介質，其中IL-13使氣道上皮細胞黏液分泌增多，影響纖毛細胞的分化和擺動[24]。Laporte等[25]發現IL-13降低氣道平滑肌細胞的β-腎上腺素受體的反應性，促進氣道收縮參與AHR的形成。Th1主要分泌IL-2和IL-12、IFN-γ，對Th2效應具有拮抗作用。再次，NOS和精氨酸酶平衡失調也是導致AHR的原因[5, 26]，精氨酸酶通過競爭共同底物機制而校正NOS的L-精氨酸生物利用度，減少NO的產生，iNANC神經舒張氣道平滑肌作用減弱，因此升高的精氨酸酶可能部分參與AHR的形成，但是此平衡僅限于cNOS和精氨酸酶之間。對于iNOS和精氨酸酶之間的平衡調節主要與Th1/Th2平衡相關，哮喘動物模型示在變應原刺激早期和哮喘病程的后期Th1釋放細胞因子誘導肥大細胞產生iNOS，精氨酸酶則是由Th2釋放IL-4、IL-10、IL-13誘導巨噬細胞而產生[26-27]。干擾哮喘小鼠精氨酸酶mRNA使精氨酸酶失活后，IL-13誘發的AHR消失[28]，表明精氨酸酶在IL-13介導的AHR中起重要作用。最后，哮喘AHR可能還與iNANC神經功能缺陷、支氣管舒張作用減弱有關。
支氣管哮喘AHR的發生機制極其復雜，與氣道炎癥、Th1/Th2平衡、NOS/精氨酸酶平衡、iNANC神經功能缺陷等多種因素相關，各種機制之間相互聯系、相互影響、相互滲透，以其中任何一種機制均無法完全解釋AHR的發生發展，其確切機制有待進一步研究。
2．激發試驗的類型：不同的刺激原引起支氣管收縮的機制各異，可能包括：(1)?刺激原直接作用于氣道平滑肌受體；(2)?與炎癥細胞相互作用引起炎癥介質釋放，通過炎癥介質進一步作用于平滑肌細胞或神經細胞受體；(3)刺激局部感覺神經引起局部軸突反射或者迷走神經介導的中樞神經反射[29]。其中，組胺和乙酰膽堿可直接作用于氣道平滑肌細胞受體從而引起氣道收縮。相反，已有證據表明神經肽和腺苷可通過作用于迷走神經或者肥大細胞的特定受體間接引起支氣管平滑肌收縮。故對于刺激原引起的氣道收縮可以簡單分為直接反應和間接反應，直接反應即刺激原直接作用于氣道平滑肌細胞受體引起氣道收縮，組胺作用于H1受體，乙酰膽堿作用于M3受體[30]。間接反應即刺激原通過作用于除平滑肌細胞外的炎癥細胞和神經細胞引起氣道收縮，刺激原包括過敏原、滲透性物質(如甘露醇、高滲鹽水)和腺苷等，刺激炎癥細胞釋放炎癥介質如組胺、白三烯前列腺素等，后者再作用于氣道平滑肌細胞引起收縮和氣道狹窄，其中肥大細胞、巨噬細胞具有重要作用，受刺激后通過脫顆粒釋放大量炎癥介質[31]。而冷空氣或者高滲透性物質可能作用于局部感覺神經纖維或者改變氣道壁的滲透性而引起神經反射，氣道收縮。
支氣管激發試驗是通過化學、物理、生物等人工刺激，誘發氣道平滑肌收縮，并借助肺功能指標改變來判斷支氣管是否縮窄及其程度的方法，是最常用于臨床診斷和評估AHR的方法[30]，結合臨床癥狀和體征有助于確診哮喘。根據上述激發物質的不同作用機制可以分為直接激發試驗和間接激發試驗兩種。常用于直接激發試驗的刺激物有組織胺、膽堿類、前列腺素、白細胞三烯、刺激性氣體(如二氧化硫)。用于間接激發試驗的刺激物包括物理、化學、生物源性物質，其中化學源性刺激物有一磷酸腺苷、心得安、緩激肽、速激肽、阿司匹林等，物理源性刺激包括運動、過度通氣、冷空氣、高/低滲鹽水、蒸餾水、甘露醇等，生物源性刺激包括花粉、塵螨、動物皮毛、蟑螂、霉菌等。
三 FENO和AHR的關系
1．哮喘時高水平FENO和AHR相關：各亞型NOS和NO在哮喘中的作用尚有爭議。有人認為NO本質是保護和舒張支氣管平滑肌，哮喘時NO增加是為了抵抗AHR的自然應答反應。盡管NO具體的細胞及分子作用機制不明，但可以明確的是已有大量研究表明哮喘時iNOS過表達，生成大量NO導致氣道炎癥及AHR[10, 32-35]。哮喘患者FENO濃度主要由氣道上皮iNOS的表達水平決定，而與其他類型的NOS未見明確關系[36]，并且其他非上皮細胞(如巨噬細胞)iNOS合成的NO僅占FENO的極小一部分[37]。哮喘時Th2細胞激活產生IL-4和IL-13，通過信號傳導和轉錄激活因子6(STAT-6)通路上調表達支氣管上皮細胞iNOS，大量合成NO[37]，彌散至支氣管腔，呼出氣中NO濃度增高。
2．FENO和間接激發試驗AHR相關：近年FENO作為哮喘氣道炎癥的非侵入性標志物，在哮喘的診斷和監測方面得到了廣泛應用。盡管表面上FENO和AHR分別代表氣道炎癥和平滑肌結構性變化，但是深入了解兩者關系仍具有重要臨床意義。Sverrild等[38]隨機選取238例青年行甘露醇激發試驗和乙酰甲膽堿激發試驗，并測定FENO，研究結果提示甘露醇激發試驗診斷哮喘的特異性和陽性預測值均較乙酰甲膽堿激發試驗高，甘露醇AHR程度與FENO水平相關，而乙酰膽堿與FENO無明顯關系。為了解哮喘患者間接激發試驗與FENO的關系，Perzanowski等[39]檢測了哮喘患兒FENO和肺功能，并行一磷酸腺苷(AMP)激發試驗和乙酰甲膽堿激發試驗，單因素線性回歸分析發現FENO與AMP、乙酰甲膽堿的PC20均相關。但是校正年齡、性別、血IgE和血嗜酸粒細胞計數等影響因素后，FENO只與AMP的PC20相關(P=0.001)，作者因此提出FENO與間接激發試驗的AHR更具相關性。同樣，在青年和老年哮喘患者中兩者的相關性也得到了證實[40-41]。Porsbjerg等[42]在非吸煙成人哮喘患者中也發現FENO與甘露醇AHR相關。此外，FENO與運動試驗誘發的氣道AHR關系密切[43]。上述多項研究均表明間接激發試驗AHR與氣道炎癥導致的FENO升高更具相關性，能更好地反映氣道炎癥。甘露醇、AMP、高滲鹽水等通過刺激肥大細胞脫顆粒，釋放組胺和其他炎癥因子間接作用于氣道平滑肌細胞，反映了潛在氣道炎癥的嚴重程度，FENO更是哮喘氣道炎癥程度的一個尺標，故FENO與間接激發試驗的關系甚密。
3．FENO和AHR關系的影響因素：FENO與AHR的相關關系受多種因素影響。Perzanowski等[39]發現激素治療影響FENO與間接激發試驗AHR的關系，在未經激素治療的哮喘患者中FENO與AMP的AHR呈明顯負相關，在經過激素治療的患者中兩者無相關關系。此外，在未經激素治療和已經激素治療的哮喘患兒中，FENO對于運動激發試驗的陽性預測截斷值不同[43]。Shim等[44]、Suh等[45]研究顯示特應性哮喘(atopic asthma)患者AMP激發試驗的AHR與FENO水平相關，而在非特應性哮喘(non-atopic asthma)未觀察到此相關關系，特應性程度可作為氣道AMP反應的重要預測因素。其次，它還與哮喘氣道炎癥類型相關，根據患者誘導痰中嗜酸粒細胞、中性粒細胞計數，哮喘可分為嗜酸粒細胞型哮喘、中性粒細胞型哮喘、混合細胞型哮喘和寡細胞型哮喘四種亞型。Porsbjerg等[46]證實四種亞型中中性粒細胞型哮喘FENO值最低，嗜酸粒細胞型哮喘最高，并且中性粒細胞型哮喘甘露醇AHR最低，嗜酸粒細胞型哮喘甘露醇AHR最高。這與FENO主要反映氣道嗜酸粒細胞炎癥的結論不謀而合。并且嗜酸粒細胞增多是特應性哮喘的一個重要特征，中性粒細胞性氣道炎癥是非特異性哮喘的特征[47]。此外，年齡也是兩者關系的影響因素，Hardaker等[48]比較老年和年輕哮喘患者AHR的預測因子，發現年輕患者AHR的預測因子為肺通氣功能、FENO和FEV1/FVC；然而老年患者AHR的預測因子為殘余肺容量和肺彌散功能，與FEV1%pred、FENO并無相關關系；再進一步分析發現年輕者主要是嗜酸粒細胞型哮喘，而老年患者哮喘主要可能主要是非嗜酸粒細胞型哮喘。綜合上述特應性因素、炎癥類型因素、年齡因素均與嗜酸粒細胞和非嗜酸粒細胞相關，故可以簡單地把哮喘分為嗜酸粒細胞型哮喘和非嗜酸粒細胞型哮喘兩大類；在嗜酸粒細胞型未經激素治療的哮喘中，FENO與間接激發試驗AHR具有重要相關性，通過測定FENO值可以反映患者AHR水平。
國外有研究表明FENO預測甘露醇AHR陽性中位值為47 ppb，陰性中位預測值為19 ppb[38]。另一項研究顯示FENO預測甘露醇激發試驗陽性的曲線下面積為91.9%，最佳截斷值為25 ppb，當FENO為20 ppb時其敏感性為100%，即當FENO值低于20 ppb可排除甘露醇AHR，這類患者可以不再行甘露醇激發試驗[40]。但這僅限于小樣本量的試驗結論，目前尚無公認的標準FENO截斷值來預測激發試驗，還需更多的多中心大樣本量研究來明確。
四 結語
傳統的乙酰甲膽堿、組胺激發試驗僅與AHR相關，不能反映氣道炎癥程度。而間接激發試驗不僅能反映AHR，且與炎癥細胞、炎癥介質相關，能更好地反映氣道炎癥[39]。在哮喘病程中刺激物主要通過間接刺激引起癥狀，故間接激發試驗更符合哮喘的臨床特征[29, 49]，或許在今后的臨床中將得到更廣泛的應用。氣道炎癥是AHR形成的機制之一，AHR是反映氣道炎癥的一項指標，通過測量FENO可以直接反映AHR，臨床上可以通過測量FENO水平而診斷哮喘。為了進一步提高準確性，有必要進一步把哮喘分為嗜酸粒細胞型和非嗜酸粒細胞型哮喘，在未經激素治療的嗜酸粒細胞型哮喘中FENO可以直接反映其AHR，FENO水平的高低可以預測AHR的嚴重程度。但是氣道炎癥并非AHR的唯一機制，僅為哮喘病程中兩種不同的病理生理機制之一，FENO水平高低反映的主要是氣道炎癥水平，而無法完全預測AHR的強度。故FENO與AHR的關系仍有待于哮喘的氣道炎癥和AHR兩大病理生理機制關系的進一步明確。
綜上所述，FENO是哮喘診斷的重要生物標志物，NO調節氣道平滑肌張力，高濃度NO對其具有收縮作用，參與AHR的形成。在反映哮喘AHR的激發試驗中，FENO與間接激發試驗的關系更密切。在未經激素治療的嗜酸粒細胞型哮喘患者中可以用FENO水平反映其間接激發試驗的AHR程度，但預測間接激發試驗陽性的FENO截斷值仍需要更多臨床研究來確定。