引用本文： 王帝, 崔志磊, 郭雪君. 姜黃素mPEG-PLGA納米粒對香煙提取物刺激巨噬細胞RAW264.7所致激素抵抗現象逆轉作用的研究. 中國呼吸與危重監護雜志, 2016, 15(1): 68-74. doi: 10.7507/1671-6205.2016017 復制
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是以不完全可逆、呈進行性發展的慢性氣流受限為特征的疾病，相對于其他的氣道慢性疾病，慢阻肺的死亡率和致殘率都較高，而對激素藥物不敏感是導致慢阻肺治療效果不佳的主要的原因[1]。姜黃素(curcumin，CUR)是從姜黃(curcuma longa)中分離出來的一種低分子質量多酚類化合物。研究發現，CUR能夠提高組蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase，HDAC2)的活性，合用可以提高激素的抗炎活性[2]。但是CUR難溶于水，堿性環境下易降解，生物體內易發生轉化，利用率極低，限制了其在科研和臨床中的應用[3]。近年來，基于聚合物材料的納米技術正逐漸成為藥劑學研究的熱點，此技術能改善難溶性藥物的溶解度和溶出速度，將CUR制成納米制劑可在一定程度上提高其水溶性，增強其穩定性，同時在CUR釋放前，細胞即可以內吞的方式攝入納米顆粒，從而提高了CUR的蓄積量。本實驗利用mPEG2000-PLGA作為載體，采用溶劑揮發法制備載CUR-mPEG2000-PLGA納米粒(CUR-NPs)，香煙提取物(cigarette smoke extract，CSE)暴露誘導激素抵抗細胞模型，探討CUR和CUR-NPs對激素抵抗的逆轉作用，比較CUR和CUR-NPs的生物學作用差異。
材料與方法
一 材料
1．細胞和試劑：巨噬細胞RAW264.7(上海合生園生物科技發展有限公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，大前門香煙(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，煙氣堿含量14 mg，上海煙草公司)，姜黃素(Sigma公司)，聚乙二醇-聚乳酸乙酸酯[mPEG-PLGA，mPEG相對分子質量2 000，mPEG 4%，LA/GA(55 :45)，濟南岱罡生物科技有限公司]，布地奈德(budesonide，BUD)(阿斯利康公司)，抗大鼠HDAC2抗體(美國Abcam公司)，逆轉錄試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，實時熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，大鼠白細胞介素8(IL-8)酶聯免疫吸附法試劑盒(美國R & D公司)。
2．儀器：紫外可見光分光光度計(上海迪諾力泰儀器設備有限公司)，恒溫磁力攪拌器(德國IKA集團)，冷凍超速離心機(Thermo Electron公司)，H-7650透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，Zetasizer Nano ZS90激光粒度測定儀(英國Marlven公司)，共聚焦顯微鏡(德國Leica)。
二 方法
1．CUR-NPs的制備：采用乳化溶劑揮發法制備CUR-mPEG-PLGA納米粒[4]。室溫下將30 mg的mPEG2000-PLGA和1 mg的CUR溶于3 mL丙酮-乙醇混合溶液(丙酮與乙醇體積比為1 :1)中形成有機相。在磁力攪拌(300 r/min)下將此溶液緩慢滴入3%的PVA溶液，形成CUR及mPEG2000-PLGA納米粒子懸液，有機相滴加完成后繼續磁力攪拌5 min停止。將所得納米粒溶液置入真空旋轉蒸發儀，于40℃水浴中，以100 r/min減壓蒸發40 min，除去殘留的丙酮和乙醇。而后將納米粒溶液放入低溫離心機內以2 000 r/min離心20 min去除團聚的大粒子，再以12 000 r/min離心30 min沉淀納米粒，棄去上清液，去除殘留的PVA和mPEG2000-PLGA，雙蒸水重新懸起納米粒子，重復洗滌3次。將得到的納米粒溶液凍干后保存。用紫外-可見分光光度法測吸光度(A)，繪制濃度與吸光度的線性曲線，高速離心法測定CUR-NPs的載藥量和包封率。
2．CUR-NPs的表征：采用激光粒度測定儀測定CUR-NPs的粒徑大小，透射電子顯微鏡觀察CUR-NPs的形貌。
3．CSE的制備：參考文獻[5]報道的方法進行制備。1支香煙燃燒的煙霧在負壓吸引下在2 min內溶于10 mL的培養基中。經0.22μm濾膜過濾除菌后作為100% CSE原液使用，制備后30 min內使用完成。
4．細胞分組及藥物干預：ELISA法檢測巨噬細胞RAW264.7所分泌的IL-8。取對數生長期巨噬細胞RAW264.7，以2×104個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁良好后，棄掉舊培養基，以含1%FBS的培養基饑餓培養細胞12 h，BUD(10-10~10-5 mol/L)干預15 min后，加入脂多糖(LPS)(0.1μg/mL)，細胞孵育24 h后，收集細胞上清。按上述方法培養巨噬細胞RAW264.7，各組藥物CUR(10-10~10-5 mol/L)、BUD(10-10~10-5 mol/L)、CUR(10-7 mol/L)+ BUD(10-9~10-5 mol/L)、CUR(10-9~10-5 mol/L)+ BUD(10-7 mol/L)、CUR-NPs(10-9~10-5 mol/L)+BUD(10-7 mol/L)干預15 min后，CSE(10%)刺激4 h，然后加入LPS(0.1μg/mL)，細胞孵育24 h后，收集細胞上清。將上述細胞上清按照ELISA試劑盒廠家提供的操作指南進行IL-8的檢測，將樣品和不同濃度的標準品加入相應孔中，37℃孵育120 min，洗板。依次加入HRP工作液、標準色液、終止液，30 min內用自動酶標儀處讀OD值。根據標準曲線計算待測樣品的含量。計算BUD對IL-8分泌的抑制率及半數抑制濃度(IC50)。
5．Real-time PCR檢測細胞中HDAC2 mRNA的表達：上述方法孵育巨噬細胞RAW264.7，BUD(10-7 mol/L)、CUR(10-7、10-6 mol/L)和CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)干預15 min后，CSE(10%)刺激，孵育24 h后，收集細胞。Trizol提取各組細胞的RNA，在分光光度計下測定RNA的濃度和OD260/280比值。各樣本均按1μg RNA相應的體積(nμL)根據逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄，每樣本轉錄體系為20μL體系，混合好的液體放置在PCR儀中，反應條件為37℃15 min，85℃5 s。將得到cDNA根據Real-time PCR說明書進行半定量PCR，反應條件為95℃30 s預變性，然后進行40個循環，95℃5 s，60℃34 s兩步法進行PCR。以GAPDH為內參。引物序列：HDAC2上游引物5′-GGGCTGCTTCAACCTAACTG-3′，下游引物5′-TTCA CAATCAAGGGCAACTG-3′，擴增片段長度142 bp；GAPDH上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GCAAGTAGACTCCACGACAT-3′，擴增片段長度143 bp。Real-time PCR得到的相應的Ct值用2-ΔΔCt法進行分析。
6．Western blot測定細胞中HDAC2的蛋白表達：上述方法孵育巨噬細胞RAW264.7，BUD(10-7 mol/L)、CUR(10-7、10-6 mol/L)和CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)干預15 min后，CSE(10%)刺激，孵育24 h后，收集細胞。用RIPA裂解液提取各組分細胞，然后用BCA測定蛋白濃度試劑盒測定各組分細胞樣品總蛋白濃度。將所提取總蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1~2 h，然后放入含有適量一抗(HDAC2 1 :2 000，β-actin 1 :1 000稀釋)的一抗稀釋液中，4℃振蕩過夜。洗滌。然后放入含有適量二抗(1 :1 000稀釋)的TBST液中，室溫振蕩120 min，洗滌，最終顯色成像。結果經Image LabTM軟件進行灰度值分析。
7．細胞對CUR和CUR-NPs攝取量的檢測：采用共聚焦顯微成像系統檢測巨噬細胞RAW264.7對CUR和CUR-NPs內CUR的攝取量。實驗的激發波長為488 nm，發射波長為520 nm。細胞以1.0×104個/皿接種于共焦皿中，放置于培養箱孵育24 h后，換以CUR(10-7 mol/L)溶液及CUR-NP(10-7 mol/L)溶液繼續孵育。然后取各時間點進行共焦顯微成像﹙物鏡采用100×oil)。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0進行統計分析，數據用
結果
一 包封率、載藥量的測定及CUR-NPs的表征
高速離心法測定結果顯示CUR-NPs載藥量為(78.33±2.52)%，包封率為(10.86±2.90)%。粒度測定儀測得結果顯示CUR-NPs平均粒徑(356.4±146.6) nm，粒度分布均勻，呈單峰分布，結果見圖 1。CUR-NPs的形態為類球形，表面較光滑，大小較均勻，結果見圖 2。
圖1
CUR-NPs的粒徑分布
圖2
CUR-NPs的形態
二 不同濃度梯度的BUD對IL-8分泌的抑制作用及IC50計算
與LPS刺激相比，LPS+CSE共刺激時BUD(10-10~10-5 mol/L)對IL-8分泌的最大抑制率顯著降低(P < 0.05)，IC50顯著增高(P < 0.05)。LPS+CSE共刺激時，與BUD(10-10~10-5 mol/L)組相比，CUR(10-7 mol/L)+BUD(10-9~10-5 mol/L)組BUD對IL-8分泌的最大抑制率顯著增高(P < 0.05)，IC50顯著降低(P < 0.05)。結果見圖 3和表 1。
圖3
藥物對IL-8分泌的抑制作用
a．LPS刺激，BUD(10-10~10-5 mol/L)干預；b．LPS+CSE共刺激，BUD(10-10~10-5 mol/L)組及CUR(10-7 mol/L)+BUD(10-9~10-5 mol/L)組干預；c．LPS+CSE刺激，CUR(10-10~10-5 mol/L)干預
表1
藥物對IL-8分泌的最大抑制率及IC50
三 CUR及CUR-NPs生物學作用比較
LPS+CSE共刺激時，CUR和CUR-NPs濃度梯度為10-9、10-8、10-7 mol/L時，CUR-NPs+BUD(10-7 mol/L)組對IL-8分泌的抑制率顯著高于CUR+BUD(10-7 mol/L)組(P < 0.05)。結果見圖 4和表 2。
圖4
CUR及CUR-NPs的生物學作用比較
與CUR+BUD(10-7 mol/L)組比較，*
表2
兩組藥物不同濃度梯度下對IL-8分泌的抑制率
四 細胞中HDAC2 mRNA的表達水平檢測
CSE刺激后細胞中HDAC2的mRNA表達量顯著降低(0.42±0.30比2.10±0.53，P < 0.05)。CUR(10-7、10-6 mol/L)組及CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)組細胞中HDAC2的mRNA表達量較CSE組顯著增高(1.08±0.30、1.7±0.38、1.74±0.24和1.96±0.34比0.42±0.30，P < 0.05)。濃度梯度同為10-7 mol/L時，CUR-NPs組細胞中HDAC2的mRNA表達量顯著高于CUR組(1.74±0.24比1.08±0.30，P < 0.05)。結果見圖 5。
圖5
細胞中HDAC2 mRNA的表達水平
與對照組比較，△
五 細胞中HDAC2的蛋白表達水平檢測
CSE刺激后細胞中HDAC2的蛋白表達量顯著降低(31.33±11.59比95.67±3.51，P < 0.05)。CUR(10-7、10-6 mol/L)組及CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)組細胞中HDAC2的蛋白表達量較CSE組顯著增高(51.67±3.21、75.67±7.02、77.33±8.62和86.67±4.04比31.33±11.59，P < 0.05)。濃度梯度同為10-7 mol/L時，CUR-NPs組細胞中HDAC2的蛋白表達量高于CUR組(77.33±8.62比51.67±3.21，P < 0.05)。結果見圖 6。
圖6
細胞中HDAC2的蛋白表達水平
與無刺激對照組比較，△
六 細胞對CUR及CUR-NPs內CUR攝取量檢測
共聚焦顯微鏡觀察細胞對CUR和CUR-NPs中CUR的攝取量(圖 7)，經CUR孵育的細胞的熒光強度值輕微上升，2 h左右達最大值。經CUR-NPs孵育的細胞熒光強度大幅度上升，大概在4 h左右細胞熒光強度達最大。CUR-NPs組熒光強度最高值明顯大于CUR組熒光強度最高值[(318.63±22.19)AU比(133.70±5.69)AU，P < 0.05]，24 h后CUR-NPs組熒光強度明顯大于CUR組熒光強度[(63.76±15.50)AU比(29.67±6.03)AU，P < 0.05]。定量計算結果顯示，CUR-NPs組熒光強度-時間曲線面積顯著大于CUR組[(4 714.56±351.68)AU比(2 078.33±55.30)AU，P < 0.05]。
圖7
細胞對CUR及CUR-NPs內CUR攝取量的檢測
討論
糖皮質激素抵抗是近年來慢阻肺治療領域的研究熱點。目前研究表明，與糖皮質激素抵抗有關的機制包括HDAC2活性下降、糖皮質激素受體異常、核因子κB(NF-κB)激活通路缺乏等，其中HDAC2活性降低是導致糖皮質激素抵抗的重要原因[6-7]。本實驗結果顯示，與LPS刺激相比，LPS+CSE共刺激時，BUD對IL-8的抑制作用明顯減弱；在巨噬細胞RAW264.7中，與對照組比較，CSE組HDAC2 mRNA相對量和蛋白表達都明顯降低。這說明CSE誘導細胞中HDAC2活性和表達的下調，CSE暴露可以造成細胞對BUD抗炎作用產生抵抗。
在細胞水平上，CUR可以上調HDAC2活性，增加激素敏感性，逆轉激素抵抗，這使其在慢阻肺抗炎治療的研究領域引起了足夠的關注[8-9]。本課題組前期的研究結果表明，在動物水平上，CUR和BUD合用可明顯升高慢阻肺大鼠肺組織中HDAC2的表達，降低IL-8、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達量，說明CUR可能通過增加HDAC2的表達和活性提高糖皮質激素對慢阻肺大鼠的抗炎作用[10]。本實驗結果顯示，LPS與CSE共刺激巨噬細胞RAW264.7時，CUR與BUD合用時BUD對IL-8的最大抑制率升高，同時IC50降低，說明CUR可以逆轉CSE誘導的激素抵抗；同時，CUR可以上調HDAC2 mRNA和蛋白的表達。上述實驗結果說明CUR具有逆轉激素抵抗的作用，對于慢阻肺等激素抵抗型疾病，CUR具有潛在的治療價值。
盡管在改善激素抵抗方面具有確切的效果，但是CUR難溶于水，在體內易轉化其他的代謝產物，生物利用率較低。研究顯示，在大量的口服CUR后(如10~12 g/d)，人體血漿中CUR濃度也僅為毫微克級別[11]。因此，CUR雖具有極高的科研和臨床應用價值，但是其藥代學特點限制了其在呼吸系統疾病治療方面的研究。
將CUR制成納米制劑可在一定程度上改善其自身的理化性質及生物活性，該方面的研究已引起廣泛關注[12]。mPEG-PLGA是美國食品藥品管理局認可的用于人體的兩種可降解生物材料，mPEG和PLGA兩者形成的嵌段共聚物常被作為藥物載體材料而用于納米粒子的制備。Anand等[13]研究顯示，mPEG-PLGA包被的CUR-NPs能夠提高CUR在細胞中的蓄積量，在誘導腫瘤細胞凋亡方面，CUR-NPs的生物學活性是普通CUR的2倍。Khalil等[14]研究發現，在大鼠體內口服條件下，與普通CUR相比，mPEG-PLGA包被的CUR-NPs的最大血漿濃度增加7.4倍，半衰期增加6 h，分布容量降低4.6倍，最終其生物活性可以增加55.4倍。
本實驗的共聚焦顯微鏡結果顯示CUR-NPs能夠提高CUR在細胞中的蓄積量，有利于延長CUR在細胞內的滯留時間。實驗結果也顯示在CUR和CUR-NPs處于低濃度梯度時，CUR-NPs+BUD組對IL-8的抑制率均高于CUR+BUD組，同時CUR-NPs對HDAC2的表達的上調作用也高于CUR組。這表明在逆轉激素抵抗方面CUR-NPs具有更強的生物學活性，亦表明納米包被技術是改善CUR難溶性和不穩定性的重要途徑，值得在動物水平上進行更深入的研究。
慢性阻塞性肺疾病(簡稱慢阻肺)是以不完全可逆、呈進行性發展的慢性氣流受限為特征的疾病，相對于其他的氣道慢性疾病，慢阻肺的死亡率和致殘率都較高，而對激素藥物不敏感是導致慢阻肺治療效果不佳的主要的原因[1]。姜黃素(curcumin，CUR)是從姜黃(curcuma longa)中分離出來的一種低分子質量多酚類化合物。研究發現，CUR能夠提高組蛋白去乙酰化酶2(histone deacetylase，HDAC2)的活性，合用可以提高激素的抗炎活性[2]。但是CUR難溶于水，堿性環境下易降解，生物體內易發生轉化，利用率極低，限制了其在科研和臨床中的應用[3]。近年來，基于聚合物材料的納米技術正逐漸成為藥劑學研究的熱點，此技術能改善難溶性藥物的溶解度和溶出速度，將CUR制成納米制劑可在一定程度上提高其水溶性，增強其穩定性，同時在CUR釋放前，細胞即可以內吞的方式攝入納米顆粒，從而提高了CUR的蓄積量。本實驗利用mPEG2000-PLGA作為載體，采用溶劑揮發法制備載CUR-mPEG2000-PLGA納米粒(CUR-NPs)，香煙提取物(cigarette smoke extract，CSE)暴露誘導激素抵抗細胞模型，探討CUR和CUR-NPs對激素抵抗的逆轉作用，比較CUR和CUR-NPs的生物學作用差異。
材料與方法
一 材料
1．細胞和試劑：巨噬細胞RAW264.7(上海合生園生物科技發展有限公司)，胎牛血清(Hyclone公司)，大前門香煙(尼古丁含量0.9 mg，焦油含量12 mg，煙氣堿含量14 mg，上海煙草公司)，姜黃素(Sigma公司)，聚乙二醇-聚乳酸乙酸酯[mPEG-PLGA，mPEG相對分子質量2 000，mPEG 4%，LA/GA(55 :45)，濟南岱罡生物科技有限公司]，布地奈德(budesonide，BUD)(阿斯利康公司)，抗大鼠HDAC2抗體(美國Abcam公司)，逆轉錄試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，實時熒光定量PCR(Real-time PCR)試劑盒[TaKaRa，寶生物工程(大連)有限公司]，大鼠白細胞介素8(IL-8)酶聯免疫吸附法試劑盒(美國R & D公司)。
2．儀器：紫外可見光分光光度計(上海迪諾力泰儀器設備有限公司)，恒溫磁力攪拌器(德國IKA集團)，冷凍超速離心機(Thermo Electron公司)，H-7650透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)，Zetasizer Nano ZS90激光粒度測定儀(英國Marlven公司)，共聚焦顯微鏡(德國Leica)。
二 方法
1．CUR-NPs的制備：采用乳化溶劑揮發法制備CUR-mPEG-PLGA納米粒[4]。室溫下將30 mg的mPEG2000-PLGA和1 mg的CUR溶于3 mL丙酮-乙醇混合溶液(丙酮與乙醇體積比為1 :1)中形成有機相。在磁力攪拌(300 r/min)下將此溶液緩慢滴入3%的PVA溶液，形成CUR及mPEG2000-PLGA納米粒子懸液，有機相滴加完成后繼續磁力攪拌5 min停止。將所得納米粒溶液置入真空旋轉蒸發儀，于40℃水浴中，以100 r/min減壓蒸發40 min，除去殘留的丙酮和乙醇。而后將納米粒溶液放入低溫離心機內以2 000 r/min離心20 min去除團聚的大粒子，再以12 000 r/min離心30 min沉淀納米粒，棄去上清液，去除殘留的PVA和mPEG2000-PLGA，雙蒸水重新懸起納米粒子，重復洗滌3次。將得到的納米粒溶液凍干后保存。用紫外-可見分光光度法測吸光度(A)，繪制濃度與吸光度的線性曲線，高速離心法測定CUR-NPs的載藥量和包封率。
2．CUR-NPs的表征：采用激光粒度測定儀測定CUR-NPs的粒徑大小，透射電子顯微鏡觀察CUR-NPs的形貌。
3．CSE的制備：參考文獻[5]報道的方法進行制備。1支香煙燃燒的煙霧在負壓吸引下在2 min內溶于10 mL的培養基中。經0.22μm濾膜過濾除菌后作為100% CSE原液使用，制備后30 min內使用完成。
4．細胞分組及藥物干預：ELISA法檢測巨噬細胞RAW264.7所分泌的IL-8。取對數生長期巨噬細胞RAW264.7，以2×104個/孔接種于6孔板，待細胞貼壁良好后，棄掉舊培養基，以含1%FBS的培養基饑餓培養細胞12 h，BUD(10-10~10-5 mol/L)干預15 min后，加入脂多糖(LPS)(0.1μg/mL)，細胞孵育24 h后，收集細胞上清。按上述方法培養巨噬細胞RAW264.7，各組藥物CUR(10-10~10-5 mol/L)、BUD(10-10~10-5 mol/L)、CUR(10-7 mol/L)+ BUD(10-9~10-5 mol/L)、CUR(10-9~10-5 mol/L)+ BUD(10-7 mol/L)、CUR-NPs(10-9~10-5 mol/L)+BUD(10-7 mol/L)干預15 min后，CSE(10%)刺激4 h，然后加入LPS(0.1μg/mL)，細胞孵育24 h后，收集細胞上清。將上述細胞上清按照ELISA試劑盒廠家提供的操作指南進行IL-8的檢測，將樣品和不同濃度的標準品加入相應孔中，37℃孵育120 min，洗板。依次加入HRP工作液、標準色液、終止液，30 min內用自動酶標儀處讀OD值。根據標準曲線計算待測樣品的含量。計算BUD對IL-8分泌的抑制率及半數抑制濃度(IC50)。
5．Real-time PCR檢測細胞中HDAC2 mRNA的表達：上述方法孵育巨噬細胞RAW264.7，BUD(10-7 mol/L)、CUR(10-7、10-6 mol/L)和CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)干預15 min后，CSE(10%)刺激，孵育24 h后，收集細胞。Trizol提取各組細胞的RNA，在分光光度計下測定RNA的濃度和OD260/280比值。各樣本均按1μg RNA相應的體積(nμL)根據逆轉錄試劑盒說明進行逆轉錄，每樣本轉錄體系為20μL體系，混合好的液體放置在PCR儀中，反應條件為37℃15 min，85℃5 s。將得到cDNA根據Real-time PCR說明書進行半定量PCR，反應條件為95℃30 s預變性，然后進行40個循環，95℃5 s，60℃34 s兩步法進行PCR。以GAPDH為內參。引物序列：HDAC2上游引物5′-GGGCTGCTTCAACCTAACTG-3′，下游引物5′-TTCA CAATCAAGGGCAACTG-3′，擴增片段長度142 bp；GAPDH上游引物5′-GCAAGTTCAACGGCACAG-3′，下游引物5′-GCAAGTAGACTCCACGACAT-3′，擴增片段長度143 bp。Real-time PCR得到的相應的Ct值用2-ΔΔCt法進行分析。
6．Western blot測定細胞中HDAC2的蛋白表達：上述方法孵育巨噬細胞RAW264.7，BUD(10-7 mol/L)、CUR(10-7、10-6 mol/L)和CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)干預15 min后，CSE(10%)刺激，孵育24 h后，收集細胞。用RIPA裂解液提取各組分細胞，然后用BCA測定蛋白濃度試劑盒測定各組分細胞樣品總蛋白濃度。將所提取總蛋白樣品與上樣緩沖液按比例混合，煮沸5 min，聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白電轉移至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1~2 h，然后放入含有適量一抗(HDAC2 1 :2 000，β-actin 1 :1 000稀釋)的一抗稀釋液中，4℃振蕩過夜。洗滌。然后放入含有適量二抗(1 :1 000稀釋)的TBST液中，室溫振蕩120 min，洗滌，最終顯色成像。結果經Image LabTM軟件進行灰度值分析。
7．細胞對CUR和CUR-NPs攝取量的檢測：采用共聚焦顯微成像系統檢測巨噬細胞RAW264.7對CUR和CUR-NPs內CUR的攝取量。實驗的激發波長為488 nm，發射波長為520 nm。細胞以1.0×104個/皿接種于共焦皿中，放置于培養箱孵育24 h后，換以CUR(10-7 mol/L)溶液及CUR-NP(10-7 mol/L)溶液繼續孵育。然后取各時間點進行共焦顯微成像﹙物鏡采用100×oil)。
三 統計學處理
采用SPSS 17.0進行統計分析，數據用
結果
一 包封率、載藥量的測定及CUR-NPs的表征
高速離心法測定結果顯示CUR-NPs載藥量為(78.33±2.52)%，包封率為(10.86±2.90)%。粒度測定儀測得結果顯示CUR-NPs平均粒徑(356.4±146.6) nm，粒度分布均勻，呈單峰分布，結果見圖 1。CUR-NPs的形態為類球形，表面較光滑，大小較均勻，結果見圖 2。
圖1
CUR-NPs的粒徑分布
圖2
CUR-NPs的形態
二 不同濃度梯度的BUD對IL-8分泌的抑制作用及IC50計算
與LPS刺激相比，LPS+CSE共刺激時BUD(10-10~10-5 mol/L)對IL-8分泌的最大抑制率顯著降低(P < 0.05)，IC50顯著增高(P < 0.05)。LPS+CSE共刺激時，與BUD(10-10~10-5 mol/L)組相比，CUR(10-7 mol/L)+BUD(10-9~10-5 mol/L)組BUD對IL-8分泌的最大抑制率顯著增高(P < 0.05)，IC50顯著降低(P < 0.05)。結果見圖 3和表 1。
圖3
藥物對IL-8分泌的抑制作用
a．LPS刺激，BUD(10-10~10-5 mol/L)干預；b．LPS+CSE共刺激，BUD(10-10~10-5 mol/L)組及CUR(10-7 mol/L)+BUD(10-9~10-5 mol/L)組干預；c．LPS+CSE刺激，CUR(10-10~10-5 mol/L)干預
表1
藥物對IL-8分泌的最大抑制率及IC50
三 CUR及CUR-NPs生物學作用比較
LPS+CSE共刺激時，CUR和CUR-NPs濃度梯度為10-9、10-8、10-7 mol/L時，CUR-NPs+BUD(10-7 mol/L)組對IL-8分泌的抑制率顯著高于CUR+BUD(10-7 mol/L)組(P < 0.05)。結果見圖 4和表 2。
圖4
CUR及CUR-NPs的生物學作用比較
與CUR+BUD(10-7 mol/L)組比較，*
表2
兩組藥物不同濃度梯度下對IL-8分泌的抑制率
四 細胞中HDAC2 mRNA的表達水平檢測
CSE刺激后細胞中HDAC2的mRNA表達量顯著降低(0.42±0.30比2.10±0.53，P < 0.05)。CUR(10-7、10-6 mol/L)組及CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)組細胞中HDAC2的mRNA表達量較CSE組顯著增高(1.08±0.30、1.7±0.38、1.74±0.24和1.96±0.34比0.42±0.30，P < 0.05)。濃度梯度同為10-7 mol/L時，CUR-NPs組細胞中HDAC2的mRNA表達量顯著高于CUR組(1.74±0.24比1.08±0.30，P < 0.05)。結果見圖 5。
圖5
細胞中HDAC2 mRNA的表達水平
與對照組比較，△
五 細胞中HDAC2的蛋白表達水平檢測
CSE刺激后細胞中HDAC2的蛋白表達量顯著降低(31.33±11.59比95.67±3.51，P < 0.05)。CUR(10-7、10-6 mol/L)組及CUR-NPs(10-7、10-6 mol/L)組細胞中HDAC2的蛋白表達量較CSE組顯著增高(51.67±3.21、75.67±7.02、77.33±8.62和86.67±4.04比31.33±11.59，P < 0.05)。濃度梯度同為10-7 mol/L時，CUR-NPs組細胞中HDAC2的蛋白表達量高于CUR組(77.33±8.62比51.67±3.21，P < 0.05)。結果見圖 6。
圖6
細胞中HDAC2的蛋白表達水平
與無刺激對照組比較，△
六 細胞對CUR及CUR-NPs內CUR攝取量檢測
共聚焦顯微鏡觀察細胞對CUR和CUR-NPs中CUR的攝取量(圖 7)，經CUR孵育的細胞的熒光強度值輕微上升，2 h左右達最大值。經CUR-NPs孵育的細胞熒光強度大幅度上升，大概在4 h左右細胞熒光強度達最大。CUR-NPs組熒光強度最高值明顯大于CUR組熒光強度最高值[(318.63±22.19)AU比(133.70±5.69)AU，P < 0.05]，24 h后CUR-NPs組熒光強度明顯大于CUR組熒光強度[(63.76±15.50)AU比(29.67±6.03)AU，P < 0.05]。定量計算結果顯示，CUR-NPs組熒光強度-時間曲線面積顯著大于CUR組[(4 714.56±351.68)AU比(2 078.33±55.30)AU，P < 0.05]。
圖7
細胞對CUR及CUR-NPs內CUR攝取量的檢測
討論
糖皮質激素抵抗是近年來慢阻肺治療領域的研究熱點。目前研究表明，與糖皮質激素抵抗有關的機制包括HDAC2活性下降、糖皮質激素受體異常、核因子κB(NF-κB)激活通路缺乏等，其中HDAC2活性降低是導致糖皮質激素抵抗的重要原因[6-7]。本實驗結果顯示，與LPS刺激相比，LPS+CSE共刺激時，BUD對IL-8的抑制作用明顯減弱；在巨噬細胞RAW264.7中，與對照組比較，CSE組HDAC2 mRNA相對量和蛋白表達都明顯降低。這說明CSE誘導細胞中HDAC2活性和表達的下調，CSE暴露可以造成細胞對BUD抗炎作用產生抵抗。
在細胞水平上，CUR可以上調HDAC2活性，增加激素敏感性，逆轉激素抵抗，這使其在慢阻肺抗炎治療的研究領域引起了足夠的關注[8-9]。本課題組前期的研究結果表明，在動物水平上，CUR和BUD合用可明顯升高慢阻肺大鼠肺組織中HDAC2的表達，降低IL-8、單核細胞趨化蛋白1(MCP-1)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達量，說明CUR可能通過增加HDAC2的表達和活性提高糖皮質激素對慢阻肺大鼠的抗炎作用[10]。本實驗結果顯示，LPS與CSE共刺激巨噬細胞RAW264.7時，CUR與BUD合用時BUD對IL-8的最大抑制率升高，同時IC50降低，說明CUR可以逆轉CSE誘導的激素抵抗；同時，CUR可以上調HDAC2 mRNA和蛋白的表達。上述實驗結果說明CUR具有逆轉激素抵抗的作用，對于慢阻肺等激素抵抗型疾病，CUR具有潛在的治療價值。
盡管在改善激素抵抗方面具有確切的效果，但是CUR難溶于水，在體內易轉化其他的代謝產物，生物利用率較低。研究顯示，在大量的口服CUR后(如10~12 g/d)，人體血漿中CUR濃度也僅為毫微克級別[11]。因此，CUR雖具有極高的科研和臨床應用價值，但是其藥代學特點限制了其在呼吸系統疾病治療方面的研究。
將CUR制成納米制劑可在一定程度上改善其自身的理化性質及生物活性，該方面的研究已引起廣泛關注[12]。mPEG-PLGA是美國食品藥品管理局認可的用于人體的兩種可降解生物材料，mPEG和PLGA兩者形成的嵌段共聚物常被作為藥物載體材料而用于納米粒子的制備。Anand等[13]研究顯示，mPEG-PLGA包被的CUR-NPs能夠提高CUR在細胞中的蓄積量，在誘導腫瘤細胞凋亡方面，CUR-NPs的生物學活性是普通CUR的2倍。Khalil等[14]研究發現，在大鼠體內口服條件下，與普通CUR相比，mPEG-PLGA包被的CUR-NPs的最大血漿濃度增加7.4倍，半衰期增加6 h，分布容量降低4.6倍，最終其生物活性可以增加55.4倍。
本實驗的共聚焦顯微鏡結果顯示CUR-NPs能夠提高CUR在細胞中的蓄積量，有利于延長CUR在細胞內的滯留時間。實驗結果也顯示在CUR和CUR-NPs處于低濃度梯度時，CUR-NPs+BUD組對IL-8的抑制率均高于CUR+BUD組，同時CUR-NPs對HDAC2的表達的上調作用也高于CUR組。這表明在逆轉激素抵抗方面CUR-NPs具有更強的生物學活性，亦表明納米包被技術是改善CUR難溶性和不穩定性的重要途徑，值得在動物水平上進行更深入的研究。
